第十五章重组干扰素生产工艺
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质粒结构一致性、质粒稳定性。
干扰素生产工艺
发酵工艺过程
15.3. 2 重组人IFN-α2b 的发酵工艺控制
1、菌体生长与产物合成的关系
指数期：1.5-3.5hr左右 产物合成期：4hr左右最大。
不相关或非来自百度文库联型
干扰素生产工艺
2、培养基的配制
发酵工艺过程
种子培养基：C/N比较低的培养基 发酵培养基：C/N比较高的培养基 pH控制：加入缓冲体系
工程菌的特征：SmR、TcR、ApR 具有生产干扰素能力：
干扰素生产工艺
假单胞杆菌的构建与保藏
15.2. 3 主菌种库的建立与保藏
原始菌种
传代扩增
冻干保藏
加入甘油
QC：菌种特性、生产能力、质粒稳定性 菌种检查合格后，方可投产。
干扰素生产工艺
假单胞杆菌的构建与保藏
主菌种库 或上一代 工作菌种 库
15.2. 4 工作菌种库的建立与保藏
干扰素生产工艺
干扰素的理化性质
143～166aa； MW:18 ～ 40 ku； pI:6.5 ～ 7.5； 乙醚、氯仿敏感 容易吸附介质。
干扰素概述
N C
IFN α结构
干扰素生产工艺
15.1. 2 干扰素的临床应用
干扰素概述
广谱抗病毒活性（rhuIFNα） 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。 直接抗肿瘤活性（rhuIFNα） 白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。 免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFNγ） 多发性硬化症（rhuIFNβ）
干扰素生产工艺
假单胞杆菌的构建与保藏
15.2.1 基因工程假单胞杆菌菌种建立
第一步：干扰素α-2b基因的克隆 第二步：表达载体的构建 第三步：工程菌的构建
干扰素生产工艺
假单胞杆菌的构建与保藏
第一步：干扰素基因的克隆(RT-PCR)
制备白细胞，病毒诱导，分离mRNA，反转录酶合成cDNA、
PCR，基因连接质粒， 转化E.coli，筛选鉴定克隆。
干扰素生产工艺
路线2
干扰素概述
人源转化细胞系培养生产工艺：
Namalva培养
合成干扰素
分离纯化
病毒诱导
1999年：IFN α-n1/Wellferon, 批准用于临床。 优点：首次实现大规模商业化生产。 缺点：活性低，退出临床应用。
多亚型混 合干扰素
干扰素生产工艺
路线 3
干扰素概述
基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:
工艺特点：分泌表达，产量低，成本高，过程严格
干扰素生产工艺
路线5
干扰素概述
基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺：
宿主：腐生型假单胞杆菌（Pseudomonas putida） 上市产品：IFN α-2b/Alferon安福隆 表达产物：无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子结构
和生物活性
工艺特点： ➢ 发酵周期短：几个小时 ➢ 无需变性、复性过程，获得有活性产品 ➢ 纯化过程：淘汰抗体亲和层析
5、pH 值
菌体生长：pH 6.8 产物积累：pH 6.0 策略：两段培养
发酵工艺过程
干扰素生产工艺
6、泡沫控制
发酵工艺过程
机械除泡和消泡剂共同使用
第十五章 重组人干扰素生 产工艺
第一节 干扰素概述 第二节 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏 第三节 干扰素的发酵工艺过程 第四节 干扰素的分离纯化工艺过程
干扰素生产工艺
分离纯化工艺
第四节 干扰素的分离纯化工艺过程
15.4.1 干扰素分离工艺过程 15.4. 2 干扰素的纯化工艺过程
干扰素生产工艺
分离纯化工艺
蛋白质分离纯化的目标是增加制品的纯度或比活性， 即增加单位蛋白质的含量或生物活性。设法除去变 性的和杂蛋白，并且希望所得到蛋白质的产量和纯 度最高值。
干扰素生产工艺
第二步：工程菌构建
假单胞杆菌的构建与保藏
转化腐生型假单胞杆菌 筛选高表达、稳定遗传的工程菌 获得原始菌种
pVG3
干扰素生产工艺
假单胞杆菌的构建与保藏
15.2. 2 基因工程假单胞杆菌菌种特性
具有宿主菌的特征：
➢细菌：革兰氏阴性菌，有荚膜，无芽孢，杆状。 ➢菌落：直径2.5-3.0 mm，灰绿色半透明状，粘稠。 ➢生化特性:Ser —，L-Val、D/L-Arg和L-Thr为碳源。
干扰素生产工艺
2、种子罐培养
发酵工艺过程
接种：接入30L种子罐，接种量10% 培养：30℃，pH7.0 控制：级联调节通气量和搅拌转速
DO为30%，3～4h，OD>4.0 检测：显微镜和LB培养基划线检查，控制杂菌。
干扰素生产工艺
3、发酵罐培养
发酵工艺过程
接种：通入300L培养基的发酵罐，接种量 10%。 控制：级联调节通气量和搅拌转速。
干扰素概述
15两.1种.1病毒干感染扰同素一的种种细类胞或机体时，常常发生
一种病毒抑制另一种病毒复制的现象
干扰素的发现 1957年，英国病毒生物学家Alick Isaacs和瑞士研究人员Jean Lindenmann，在利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感干扰现象时了 解到，病毒感染的细胞能产生一种因子，后者作用于其它细 胞，干扰病毒的复制，故将其命名为干扰素。
工程菌构建
发酵培养
包涵体
复性
上市产品：重组人干扰素rhuIFN ➢ 1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b；
重组人干扰素
➢ 1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b；
➢ 2001－2002：PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys
表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体
第十五章 重组人干扰素生 产工艺
第一节 干扰素概述 第二节 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏 第三节 干扰素的发酵工艺过程 第四节 干扰素的分离纯化工艺过程
干扰素生产工艺
第一节 干扰素概述
15.1.1 干扰素的种类 15.1. 2 干扰素的临床应用 15.1. 3 干扰素的生产工艺路线
干扰素概述
干扰素生产工艺
OD值 5.5
离心
摇瓶种 子培养
种子 罐 培养
Ependorf 管
OD值 8.0 培养 基
第十五章 重组人干扰素生 产工艺
第一节 干扰素概述 第二节 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏 第三节 干扰素的发酵工艺过程 第四节 干扰素的分离纯化工艺过程
干扰素生产工艺
发酵工艺过程
第三节 干扰素的发酵工艺过程
干扰素生产工艺
3、DO控制
发酵工艺过程
DO：高时，产物明显提高；同时质粒的稳定性提高 策略：加大转速，增加通气量，必要时用纯氧
干扰素生产工艺
4、温 度
发酵工艺过程
温度：要考虑菌体生长和产物的积累 策略：前期控制在30℃，保证菌体快速生长，后期控制在
20℃积累产物，同时防止产物降解
干扰素生产工艺
离心：
➢ 连续流离心机：2℃～10℃，16000 r/min
➢ 收集上清液：含有重组干扰素蛋白质
➢ 杂质沉淀：121℃、30min 蒸汽灭菌，焚烧处理。
干扰素生产工艺
3、初级分离
分离纯化工艺
盐析: 4M硫酸铵，2℃～10℃，搅匀静置过夜。 离心：连续流离心机，16000 r/min 保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃。
第十五章 重组人干扰素生 产工艺
第一节 干扰素概述 第二节 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏 第三节 干扰素的发酵工艺过程 第四节 干扰素的分离纯化工艺过程
干扰素生产工艺
假单胞杆菌的构建与保藏
第二节 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏
15.2.1 基因工程假单胞杆菌菌种建立 15.2. 2 基因工程假单胞杆菌菌种特性 15.2. 3 菌种库的建立与保藏 15.2. 4 工作菌种库的建立与保藏
➢前4h：30℃，pH7.0，DO为30% ➢4h后：20℃，pH6.0，DO为60%，5～6.5h ➢终点控制：OD值达9.0±1.0，5℃冷却水快
速降温至15℃以下
检测：发酵液杂菌检查
干扰素生产工艺
4、菌体收集
发酵工艺过程
连续流离心机：冷却的发酵液，16000 r/min离心收集。 菌体保存：－20℃冰柜，不超过12个月。 检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、
裂解缓冲液：纯化水，2℃～10℃（pH7.5） 使用保护剂：EDTA、DTDE、PMSF 破碎-20℃菌体：2厘米 搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr 冻融: 细胞完全破裂，释放干扰素。
将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞 内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞 结构破碎。
测序：编码人IFNα-2b基因序列，501bp，165aa。
ATGTGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTT GATGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAA GGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGGTTGCCAACCAGTTC CAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATC TTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACC CTCCTAGACAAATTCACACGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTCGA AGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGA AGGAGGACTCCATTCTGGCTGTCAGGAAATACTTCCAAAGAATCACCT CTACTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAG AGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAG TTTAAGAAGTAAGGAATGA
干扰素生产工艺
干扰素概述
15.2. 3 干扰素的生产工艺路线
路线1
体外诱生干扰素制备工艺： Sendai病毒诱导人白细胞
血浆
人白细胞
分离纯化
人白干扰素
病毒诱导
1989年：IFNα-n3，批准上市 产量低：1g IFNα，需要3亿ml人血白细胞 来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵 潜在的血源性病毒污染的可能性
干扰素生产工艺
15.4.1 干扰素分离工艺过程
菌体裂解 预处理 初级分离
分离纯化工艺
干扰素生产工艺
分离纯化工艺
1、菌体裂解
一定的pH条件下，细胞破裂，加入表面活性剂(SDS、Triton X100 而获得。而pH 环境则由加入的强碱(NaOH) 或缓冲液 提供。 在一定的pH 环境下，表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解
干扰素生产工艺
2、预处理
分离纯化工艺
菌体自溶、核酸、蛋白质及其它有机粘性物质造成的浑浊，如果不经 过适当的预处理就直接进行过滤或离心沉降，不但速度极慢，甚至得 不到澄清的蛋白质
加絮凝剂聚乙烯亚胺：2℃～10℃，搅拌，对菌体碎片
进行絮凝。
加凝聚剂醋酸钙溶液：2℃～10℃,搅拌，对菌体碎
片、DNA等进行沉淀。
工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。
干扰素生产工艺
路线4
动物无限细胞系培养生产工艺：
工程CHO细 胞系构建
细胞培养
收集培养液
干扰素概述
分离纯化
上市产品： rhuIFNβ-1a
➢1996，Avonex(Biogen)
重组人干扰素
➢2002，Rebif(Serono)
表达产物：166 aa糖基化蛋白，22.5 ku
干扰素生产工艺
15.4. 2 干扰素的纯化工艺过程
分离纯化工艺
1980-1982年，科学家用基因工程方法在大肠杆菌及酵母菌 细胞内获得了干扰素，从每1升细胞培养物中可以得到20-40毫 升干扰素。从1987年开始，用基因工程方法生产的干扰素进 入了工业化生产，并且大量投放市场。
干扰素生产工艺
15.1.1 干扰素的种类
干扰素概述
概念：（interferon，IFN） 机体受到病毒感染时，免疫细胞产生的一组结构类 似、功能接近的细胞因子 功能：干扰病毒在细胞内的增殖 根据干扰素蛋白质的氨基酸结构、抗原性和细胞来源， 可将其分为：IFN-α、IFN-β、IFN-γ 干扰素-α有24种亚型，其中包括干扰素-α2a、干扰素α1b、 干扰素-α2b、干扰素-α2c等 上市重组干扰素: α-2a、α-2b、α-1b、β-1b，γ
15.3.1 重组人IFN-α2b 的发酵工艺过程 15.3. 2 重组人IFN-α2b 的发酵工艺控制
干扰素生产工艺
发酵工艺过程
15.3.1 重组人IFN-α2b 的发酵工艺过程
工
种
发
作
摇
子
酵
菌
菌
瓶
罐
罐
体
种
培
培
培
收
库
养
养
养
集
干扰素生产工艺
1、摇瓶培养
发酵工艺过程
取保存工作种子批菌种，室温融化 摇瓶活化培养：30℃，pH7.0，250 r/min，18±2h 检测：OD值和发酵液杂菌检查。
干扰素生产工艺
发酵工艺过程
15.3. 2 重组人IFN-α2b 的发酵工艺控制
1、菌体生长与产物合成的关系
指数期：1.5-3.5hr左右 产物合成期：4hr左右最大。
不相关或非来自百度文库联型
干扰素生产工艺
2、培养基的配制
发酵工艺过程
种子培养基：C/N比较低的培养基 发酵培养基：C/N比较高的培养基 pH控制：加入缓冲体系
工程菌的特征：SmR、TcR、ApR 具有生产干扰素能力：
干扰素生产工艺
假单胞杆菌的构建与保藏
15.2. 3 主菌种库的建立与保藏
原始菌种
传代扩增
冻干保藏
加入甘油
QC：菌种特性、生产能力、质粒稳定性 菌种检查合格后，方可投产。
干扰素生产工艺
假单胞杆菌的构建与保藏
主菌种库 或上一代 工作菌种 库
15.2. 4 工作菌种库的建立与保藏
干扰素生产工艺
干扰素的理化性质
143～166aa； MW:18 ～ 40 ku； pI:6.5 ～ 7.5； 乙醚、氯仿敏感 容易吸附介质。
干扰素概述
N C
IFN α结构
干扰素生产工艺
15.1. 2 干扰素的临床应用
干扰素概述
广谱抗病毒活性（rhuIFNα） 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。 直接抗肿瘤活性（rhuIFNα） 白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。 免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFNγ） 多发性硬化症（rhuIFNβ）
干扰素生产工艺
假单胞杆菌的构建与保藏
15.2.1 基因工程假单胞杆菌菌种建立
第一步：干扰素α-2b基因的克隆 第二步：表达载体的构建 第三步：工程菌的构建
干扰素生产工艺
假单胞杆菌的构建与保藏
第一步：干扰素基因的克隆(RT-PCR)
制备白细胞，病毒诱导，分离mRNA，反转录酶合成cDNA、
PCR，基因连接质粒， 转化E.coli，筛选鉴定克隆。
干扰素生产工艺
路线2
干扰素概述
人源转化细胞系培养生产工艺：
Namalva培养
合成干扰素
分离纯化
病毒诱导
1999年：IFN α-n1/Wellferon, 批准用于临床。 优点：首次实现大规模商业化生产。 缺点：活性低，退出临床应用。
多亚型混 合干扰素
干扰素生产工艺
路线 3
干扰素概述
基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:
工艺特点：分泌表达，产量低，成本高，过程严格
干扰素生产工艺
路线5
干扰素概述
基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺：
宿主：腐生型假单胞杆菌（Pseudomonas putida） 上市产品：IFN α-2b/Alferon安福隆 表达产物：无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子结构
和生物活性
工艺特点： ➢ 发酵周期短：几个小时 ➢ 无需变性、复性过程，获得有活性产品 ➢ 纯化过程：淘汰抗体亲和层析
5、pH 值
菌体生长：pH 6.8 产物积累：pH 6.0 策略：两段培养
发酵工艺过程
干扰素生产工艺
6、泡沫控制
发酵工艺过程
机械除泡和消泡剂共同使用
第十五章 重组人干扰素生 产工艺
第一节 干扰素概述 第二节 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏 第三节 干扰素的发酵工艺过程 第四节 干扰素的分离纯化工艺过程
干扰素生产工艺
分离纯化工艺
第四节 干扰素的分离纯化工艺过程
15.4.1 干扰素分离工艺过程 15.4. 2 干扰素的纯化工艺过程
干扰素生产工艺
分离纯化工艺
蛋白质分离纯化的目标是增加制品的纯度或比活性， 即增加单位蛋白质的含量或生物活性。设法除去变 性的和杂蛋白，并且希望所得到蛋白质的产量和纯 度最高值。
干扰素生产工艺
第二步：工程菌构建
假单胞杆菌的构建与保藏
转化腐生型假单胞杆菌 筛选高表达、稳定遗传的工程菌 获得原始菌种
pVG3
干扰素生产工艺
假单胞杆菌的构建与保藏
15.2. 2 基因工程假单胞杆菌菌种特性
具有宿主菌的特征：
➢细菌：革兰氏阴性菌，有荚膜，无芽孢，杆状。 ➢菌落：直径2.5-3.0 mm，灰绿色半透明状，粘稠。 ➢生化特性:Ser —，L-Val、D/L-Arg和L-Thr为碳源。
干扰素生产工艺
2、种子罐培养
发酵工艺过程
接种：接入30L种子罐，接种量10% 培养：30℃，pH7.0 控制：级联调节通气量和搅拌转速
DO为30%，3～4h，OD>4.0 检测：显微镜和LB培养基划线检查，控制杂菌。
干扰素生产工艺
3、发酵罐培养
发酵工艺过程
接种：通入300L培养基的发酵罐，接种量 10%。 控制：级联调节通气量和搅拌转速。
干扰素概述
15两.1种.1病毒干感染扰同素一的种种细类胞或机体时，常常发生
一种病毒抑制另一种病毒复制的现象
干扰素的发现 1957年，英国病毒生物学家Alick Isaacs和瑞士研究人员Jean Lindenmann，在利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感干扰现象时了 解到，病毒感染的细胞能产生一种因子，后者作用于其它细 胞，干扰病毒的复制，故将其命名为干扰素。
工程菌构建
发酵培养
包涵体
复性
上市产品：重组人干扰素rhuIFN ➢ 1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b；
重组人干扰素
➢ 1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b；
➢ 2001－2002：PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys
表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体
第十五章 重组人干扰素生 产工艺
第一节 干扰素概述 第二节 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏 第三节 干扰素的发酵工艺过程 第四节 干扰素的分离纯化工艺过程
干扰素生产工艺
第一节 干扰素概述
15.1.1 干扰素的种类 15.1. 2 干扰素的临床应用 15.1. 3 干扰素的生产工艺路线
干扰素概述
干扰素生产工艺
OD值 5.5
离心
摇瓶种 子培养
种子 罐 培养
Ependorf 管
OD值 8.0 培养 基
第十五章 重组人干扰素生 产工艺
第一节 干扰素概述 第二节 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏 第三节 干扰素的发酵工艺过程 第四节 干扰素的分离纯化工艺过程
干扰素生产工艺
发酵工艺过程
第三节 干扰素的发酵工艺过程
干扰素生产工艺
3、DO控制
发酵工艺过程
DO：高时，产物明显提高；同时质粒的稳定性提高 策略：加大转速，增加通气量，必要时用纯氧
干扰素生产工艺
4、温 度
发酵工艺过程
温度：要考虑菌体生长和产物的积累 策略：前期控制在30℃，保证菌体快速生长，后期控制在
20℃积累产物，同时防止产物降解
干扰素生产工艺
离心：
➢ 连续流离心机：2℃～10℃，16000 r/min
➢ 收集上清液：含有重组干扰素蛋白质
➢ 杂质沉淀：121℃、30min 蒸汽灭菌，焚烧处理。
干扰素生产工艺
3、初级分离
分离纯化工艺
盐析: 4M硫酸铵，2℃～10℃，搅匀静置过夜。 离心：连续流离心机，16000 r/min 保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃。
第十五章 重组人干扰素生 产工艺
第一节 干扰素概述 第二节 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏 第三节 干扰素的发酵工艺过程 第四节 干扰素的分离纯化工艺过程
干扰素生产工艺
假单胞杆菌的构建与保藏
第二节 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏
15.2.1 基因工程假单胞杆菌菌种建立 15.2. 2 基因工程假单胞杆菌菌种特性 15.2. 3 菌种库的建立与保藏 15.2. 4 工作菌种库的建立与保藏
➢前4h：30℃，pH7.0，DO为30% ➢4h后：20℃，pH6.0，DO为60%，5～6.5h ➢终点控制：OD值达9.0±1.0，5℃冷却水快
速降温至15℃以下
检测：发酵液杂菌检查
干扰素生产工艺
4、菌体收集
发酵工艺过程
连续流离心机：冷却的发酵液，16000 r/min离心收集。 菌体保存：－20℃冰柜，不超过12个月。 检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、
裂解缓冲液：纯化水，2℃～10℃（pH7.5） 使用保护剂：EDTA、DTDE、PMSF 破碎-20℃菌体：2厘米 搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr 冻融: 细胞完全破裂，释放干扰素。
将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞 内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞 结构破碎。
测序：编码人IFNα-2b基因序列，501bp，165aa。
ATGTGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTT GATGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAA GGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGGTTGCCAACCAGTTC CAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATC TTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACC CTCCTAGACAAATTCACACGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTCGA AGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGA AGGAGGACTCCATTCTGGCTGTCAGGAAATACTTCCAAAGAATCACCT CTACTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAG AGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAG TTTAAGAAGTAAGGAATGA
干扰素生产工艺
干扰素概述
15.2. 3 干扰素的生产工艺路线
路线1
体外诱生干扰素制备工艺： Sendai病毒诱导人白细胞
血浆
人白细胞
分离纯化
人白干扰素
病毒诱导
1989年：IFNα-n3，批准上市 产量低：1g IFNα，需要3亿ml人血白细胞 来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵 潜在的血源性病毒污染的可能性
干扰素生产工艺
15.4.1 干扰素分离工艺过程
菌体裂解 预处理 初级分离
分离纯化工艺
干扰素生产工艺
分离纯化工艺
1、菌体裂解
一定的pH条件下，细胞破裂，加入表面活性剂(SDS、Triton X100 而获得。而pH 环境则由加入的强碱(NaOH) 或缓冲液 提供。 在一定的pH 环境下，表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解
干扰素生产工艺
2、预处理
分离纯化工艺
菌体自溶、核酸、蛋白质及其它有机粘性物质造成的浑浊，如果不经 过适当的预处理就直接进行过滤或离心沉降，不但速度极慢，甚至得 不到澄清的蛋白质
加絮凝剂聚乙烯亚胺：2℃～10℃，搅拌，对菌体碎片
进行絮凝。
加凝聚剂醋酸钙溶液：2℃～10℃,搅拌，对菌体碎
片、DNA等进行沉淀。
工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。
干扰素生产工艺
路线4
动物无限细胞系培养生产工艺：
工程CHO细 胞系构建
细胞培养
收集培养液
干扰素概述
分离纯化
上市产品： rhuIFNβ-1a
➢1996，Avonex(Biogen)
重组人干扰素
➢2002，Rebif(Serono)
表达产物：166 aa糖基化蛋白，22.5 ku
干扰素生产工艺
15.4. 2 干扰素的纯化工艺过程
分离纯化工艺
1980-1982年，科学家用基因工程方法在大肠杆菌及酵母菌 细胞内获得了干扰素，从每1升细胞培养物中可以得到20-40毫 升干扰素。从1987年开始，用基因工程方法生产的干扰素进 入了工业化生产，并且大量投放市场。
干扰素生产工艺
15.1.1 干扰素的种类
干扰素概述
概念：（interferon，IFN） 机体受到病毒感染时，免疫细胞产生的一组结构类 似、功能接近的细胞因子 功能：干扰病毒在细胞内的增殖 根据干扰素蛋白质的氨基酸结构、抗原性和细胞来源， 可将其分为：IFN-α、IFN-β、IFN-γ 干扰素-α有24种亚型，其中包括干扰素-α2a、干扰素α1b、 干扰素-α2b、干扰素-α2c等 上市重组干扰素: α-2a、α-2b、α-1b、β-1b，γ
15.3.1 重组人IFN-α2b 的发酵工艺过程 15.3. 2 重组人IFN-α2b 的发酵工艺控制
干扰素生产工艺
发酵工艺过程
15.3.1 重组人IFN-α2b 的发酵工艺过程
工
种
发
作
摇
子
酵
菌
菌
瓶
罐
罐
体
种
培
培
培
收
库
养
养
养
集
干扰素生产工艺
1、摇瓶培养
发酵工艺过程
取保存工作种子批菌种，室温融化 摇瓶活化培养：30℃，pH7.0，250 r/min，18±2h 检测：OD值和发酵液杂菌检查。