第十五章重组干扰素生产工艺
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【完整版】重组干扰素-α 生物制药工艺学PPT文档
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ挑取单菌落于液体ypdzeocin100mgml培养基中300rmin30培养至od600为15取1ml稀释至100ml同样培养基中振荡培养至od6007000rmin4离心15分钟取上清液经硫胺盐析浓缩透析用无菌水5ml溶解后以125的分离胶做sdspage分析
重组干扰素-α
演讲：谢思思 PPT制作：朱宇婷、张芳芳 资料查找：陈雪梅、方琦璐、钱媛 媛、夏烽、董敏健、袁海剑
感谢观看
IFNα-2b简介
IFNα-2b是苏黎世大学Charles Weissmann实验室最新发现的抗病毒 药物，由Biogen公司发展的，最终由Schering-Plough公司出品，商品名 为Intron-A。它应用于多种适应症，包括病毒性感染和肿瘤。它被批准用 于乙、丙型肝炎、毛细胞白血病、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、良性 肿瘤和恶性黑色素瘤的治疗等的治疗。
干扰素（IFN)简介
• 干扰素是由多种细胞产生的一组蛋白质类细胞因子，具有广泛的 抗病毒，抗肿瘤免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。 根据其来源、分子结构和抗原性的差异分为α,β,γ,ω四个类型。α 型干扰素又依其结构的不同再分为α-1b, α-2a, α-2b等亚型，其具 体表现在个别氨基酸的差异上。我们要具体讲讲rhIFN α-2b的生产 工艺设计。
来源于维基百科 理化性质：
分子量：19247 结构特点：四个Cys残基，形成两个二硫键
无糖基化位点 PI:5-6 在的溶液中稳定，对热也稳定 对各种蛋白酶敏感，比活为2X10^8 IU/mg
制备工艺路线：
制备工艺过程
• 基因的制备 • 构建重组质粒 • 酵母转化 • 发酵及表达产物的SDS-PAGE分析 • 样品的纯化
重组干扰素-α
演讲：谢思思 PPT制作：朱宇婷、张芳芳 资料查找：陈雪梅、方琦璐、钱媛 媛、夏烽、董敏健、袁海剑
感谢观看
IFNα-2b简介
IFNα-2b是苏黎世大学Charles Weissmann实验室最新发现的抗病毒 药物，由Biogen公司发展的，最终由Schering-Plough公司出品，商品名 为Intron-A。它应用于多种适应症，包括病毒性感染和肿瘤。它被批准用 于乙、丙型肝炎、毛细胞白血病、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、良性 肿瘤和恶性黑色素瘤的治疗等的治疗。
干扰素（IFN)简介
• 干扰素是由多种细胞产生的一组蛋白质类细胞因子，具有广泛的 抗病毒，抗肿瘤免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。 根据其来源、分子结构和抗原性的差异分为α,β,γ,ω四个类型。α 型干扰素又依其结构的不同再分为α-1b, α-2a, α-2b等亚型，其具 体表现在个别氨基酸的差异上。我们要具体讲讲rhIFN α-2b的生产 工艺设计。
来源于维基百科 理化性质：
分子量：19247 结构特点：四个Cys残基，形成两个二硫键
无糖基化位点 PI:5-6 在的溶液中稳定，对热也稳定 对各种蛋白酶敏感，比活为2X10^8 IU/mg
制备工艺路线：
制备工艺过程
• 基因的制备 • 构建重组质粒 • 酵母转化 • 发酵及表达产物的SDS-PAGE分析 • 样品的纯化
干扰素制备的工艺流程
第十五页
❖５）加500μl含13％（w/v)聚乙二醇（PEG 8000）的 1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量离心机于４℃以 12000g离心５分钟，以回收质粒ＤＮＡ。 ６）吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。 用酚、酚：氯仿、氯仿各抽１次。 ７）将水相转到另一微量离心管中，加100μl 10mol/L 乙醇铵，充分混匀，加２倍体积（约1ml）乙醇，于室温 放置10分钟，于4℃以12 000g离心5分钟，以回收沉淀的 质粒ＤＮＡ。 ８）吸去上清，加200μl处于4℃以12 000g离心2分钟。 ９）吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到最后 可见的痕量乙醇蒸发殆尽。 10）用500μl TE（pH8.0）溶解沉淀1:100稀释[用TE （pH8.0)] 后测量OD 260，计算质粒DNA的浓度（1OD260 ＝50μg质粒DNA/ml）， 然后将DNA贮于－20℃。
从受体菌中获取目的基因
表达载体
重组质粒
导入大肠杆菌
受体菌的筛选，表达性、稳定性等检测
→工程菌
第四页
第五页
一、目的基因的分离与获得
❖ 1. 设计合成干扰素基因的两端引物（完全的），每条引物内 或5‘-端最好有内切酶酶切位点。
❖ 2. 有药物诱导细胞，如佛波酯，使细胞表达干扰素升高。 ❖ 3. 破碎细胞，提取细胞总mRNA. ❖ 4. 用逆转录试剂盒逆转录，把总mRNA逆转录成cDNA ❖ 5. 以cDNA为模板、干扰素引物为引物，PCR，得到完全的干扰素基
❖ 2．种子罐培养 将已活化的菌种接入装有30L培养基的种子罐 中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0，级联调节通气量和搅拌转速， 控制溶解氧为30%，培养3～4小时，转入发酵罐中，同时取样发酵液
❖５）加500μl含13％（w/v)聚乙二醇（PEG 8000）的 1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量离心机于４℃以 12000g离心５分钟，以回收质粒ＤＮＡ。 ６）吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。 用酚、酚：氯仿、氯仿各抽１次。 ７）将水相转到另一微量离心管中，加100μl 10mol/L 乙醇铵，充分混匀，加２倍体积（约1ml）乙醇，于室温 放置10分钟，于4℃以12 000g离心5分钟，以回收沉淀的 质粒ＤＮＡ。 ８）吸去上清，加200μl处于4℃以12 000g离心2分钟。 ９）吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到最后 可见的痕量乙醇蒸发殆尽。 10）用500μl TE（pH8.0）溶解沉淀1:100稀释[用TE （pH8.0)] 后测量OD 260，计算质粒DNA的浓度（1OD260 ＝50μg质粒DNA/ml）， 然后将DNA贮于－20℃。
从受体菌中获取目的基因
表达载体
重组质粒
导入大肠杆菌
受体菌的筛选，表达性、稳定性等检测
→工程菌
第四页
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一、目的基因的分离与获得
❖ 1. 设计合成干扰素基因的两端引物（完全的），每条引物内 或5‘-端最好有内切酶酶切位点。
❖ 2. 有药物诱导细胞，如佛波酯，使细胞表达干扰素升高。 ❖ 3. 破碎细胞，提取细胞总mRNA. ❖ 4. 用逆转录试剂盒逆转录，把总mRNA逆转录成cDNA ❖ 5. 以cDNA为模板、干扰素引物为引物，PCR，得到完全的干扰素基
❖ 2．种子罐培养 将已活化的菌种接入装有30L培养基的种子罐 中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0，级联调节通气量和搅拌转速， 控制溶解氧为30%，培养3～4小时，转入发酵罐中，同时取样发酵液
干扰素制备的工艺流程图
提取重组质 粒④
7)用合适转头于室温以5000转/分离心15分钟，回收核酸。如于4 ℃离心， 盐也会生成了沉淀。 8)小心倒掉上清,敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽,于室温用70%乙醇 洗涤沉积管壁。倒出乙醇，用与真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所 有液滴，于室温将瓶倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。 9)用3mlTE(pH8.0)溶解核酸沉淀. 10)纯化。
质粒DNA的纯
化①
（一）聚乙二醇沉淀法提取质粒DNA
1)将核酸溶液所得转入15mlCorex管中，再加3ml用冰预冷的5mo1/L LiCl溶液， 充 分混匀，用合适转头于4 ℃下以10000转/分离心I0分钟。LiCI可沉淀高分子RNA。
2)将上清转移到另一30mlCorex管内，加等量的异丙醇，充分混匀，用SorvallSS34 转头(或与其相当的转尖)于室温以10000转/分离心10分钟，回收沉淀的核酸。
白标准系列做对照，以迁移率为横坐标，相对分子量的对数为纵坐标 作图，计算相对分子量。与理论值比较，误差不得高于10%。
(6)残余外源性DNA含量测定 用放射性核素或生物素探针法测定，每剂量中残余外源性DNA应低于
100pg. (7)残余血清lgG含量测定 在应用抗体亲和层析法作为纯化方法吋必须进行此项检定。
重组体引入宿主 细胞
将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质 粒pBR322中,转化到大肠杆菌,重组的载体 DNA 分子在 一定条件下转化入大肠杆菌,形成携带质粒的菌株。
从大肠杆菌K12获取目 的基因
由于质粒重组时有3种基本方式,即:目的基因与克隆载体重组,目的基因片段与 目的基因片段重组,克隆载体与克隆载体重组;另外重组过程可能会发生基因突 变情况
干扰素的生产工艺过程
干扰素的生产工艺过程1．菌种制备取－70℃下保存的甘油管菌种（工作种子批），于室温下融化。
然后，接入摇瓶，培养温度30℃，pH7.0，250 r/min活化培养18±2小时后，进行吸光值测定和发酵液杂菌检查。
2．种子罐培养将已活化的菌种接入装有30L培养基的种子罐中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0，级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧为30%，培养3～4小时，转入发酵罐中，同时取样发酵液进行显微镜检查和LB培养基划线检查，控制杂菌。
3．发酵罐培养将种子液通入300L培养基的发酵罐中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0。
级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧30%，培养4小时。
然后控制培养温度20℃，pH6.0，溶解氧60%，继续培养5～6.5小时。
同时进行发酵液杂菌检查，当OD值达9.0±1.0后，用5℃冷却水快速降温至15℃以下，以减缓细胞衰老。
或者将发酵液转入收集罐中，加入冰块使温度迅速降至10℃以下。
4．菌体收集将已降温的发酵液转入连续流离心机，16000 r/min离心收集。
进行干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目的检测。
菌体于－20℃冰柜中保存时，不得超过12个月。
每保存3个月，检查一次活性。
11.4.3.4 干扰素发酵过程控制在假单孢杆菌的发酵生产中，菌体在培养1.5小时分裂速度最快，到3.5小时开始下降。
而干扰素的迅速合成出现在3.5小时之后，在4小时达到最大，然后由于降解而迅速下降。
可见在发酵生产工艺中，假单孢杆菌的生长和干扰素的生产基本处于不相关状态，可采用两段培养的策略进行过程控制。
1．溶解氧控制分别在生长阶段和生产阶段采用各自最佳溶解氧浓度，以期提高干扰素的发酵水平。
通过级联调节通气量和搅拌转速得以实现。
2．温度控制假单孢杆菌生长最适温度与产物形成最适温度是不同的。
产物合成温度控制在20℃可以有效防止干扰素-α2b的降解，而其最佳生长温度则为30℃。
干扰素制备的工艺流程PPT课件
2020/2/21
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质粒DNA的纯化②
6)吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚：氯 仿、氯仿各抽l次。
7)将水相转到另一微量离心管中，加100μl 10mol/L乙醇铵，充分混 匀，加2倍体积(约lml)乙醇，于室温放置10分钟，于4 ℃以 12000g离心5分钟，以回收沉淀的质粒DNA。
3 破碎细胞,提取细胞总mRNA.
4
用逆转录试剂盒逆转录,把总mRNA逆转录成cDNA
5
以cDNA为模板、干扰素引物为引物,PCR,得到完全的干扰素基因的PCR产物
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6
目的基因与克隆载体进行体外重组
1.提取载体(连接
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,现在 来进行生
2
基因工程菌的制备
目的基因的分离
目的基因与克隆
克隆载体
载体的体外重组
重组导入大肠杆菌K12
受体菌的培养 及筛选
从受体菌中获取目的基因 重组质粒
表达载体
导入大肠杆菌
受体菌的筛选（表达性、稳定性等检测）
工程菌
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3
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工艺流程
目的基因的分离与获得
2、细菌的收获和裂解
1）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟,弃上清,敞开离心管口并倒置离心管使上清全
部流尽。
2）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。
STE 0.1mol/L NaCl
10mmol/L Tris.Cl(Ph8.0)
1mmol/L EDTA(Ph8.0)
按步骤1）所述方法离心，以收集细菌细胞。
级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧30%,培养4小时。然后控制培养温度20℃ ，pH6.0, 溶解氧60%,继续培养5-6.5小吋。同时进行发酵液杂菌检查，当0D值达9.0±1.0后，用5℃冷 却水快速降温至15℃以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转入收集罐中，加入冰块使温 度迅速降至10℃以下。
干扰素的工艺制备流程
蛋白质含量测定
原理：利用蛋白质与特定试剂反应，生成有色物质，通过比色法测定蛋白质含量
试剂：考马斯亮蓝、溴酚蓝、福林酚试剂等
步骤：样品处理、试剂添加、反应时间、比色测定、结果计算 注意事项：样品处理要充分，试剂添加要准确，反应时间要控制好，比色测定要准确，结果计 算要正确。
基因序列分析
目的：检测干扰素 的基因序列
化学合成法
原料：氨基酸、核苷酸等
反应条件：温度、pH值、反应时间 等
合成步骤：氨基酸合成、核苷酸合成、 蛋白质合成等
产物纯化：色谱法、电泳法等 质量控制：检测纯度、活性等 包装与储存：无菌包装、低温储存等
干扰素质量检测
生物学活性检测
检测方法：采用细胞培养法或酶联免疫吸附法 检测指标：干扰素的生物学活性、纯度、稳定性等 检测步骤：样品制备、细胞培养、酶联免疫吸附、结果分析等 检测结果：根据检测结果判断干扰素的生物学活性是否达标
干扰素工艺制备流程
汇报人：
干扰素制备原料 干扰素制备工艺流程 干扰素质量检测 干扰素生产成本控制 干扰素工艺制备技术的发展趋势
干扰素制备原料
重组人干扰素
原料：人源细胞
制备方法：基因 工程
作用：抗病毒、 抗肿瘤
应用：临床治疗、 疫苗开发
病毒干扰素
病毒来源：自然界 中的病毒
病毒种类：包括流 感病毒、乙肝病毒 等
病毒提取：通过生 物技术从病毒中提 取干扰素
干扰素纯化：通过 生物技术对提取的 干扰素进行纯化处 理
干扰素制备工艺流程
基因工程法
基因工程法简介： 通过基因工程技术， 将干扰素基因导入 到微生物中，使其 表达出干扰素蛋白
基因工程法的优点： 可以大规模生产， 成本低，效率高
干扰素的工艺制备流程
取体重18-20克小鼠5只，每只尾静脉注射剂量按人
每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，若动物全部存
活，说明成品合格。
4 国内基因工程药物产业发展状况
我国的生物技术药物却一直苦于缺乏 自主创新的产品，绝大多数上市药物为仿 制药，创新药物的开发一直未能打开局面。
一种新药从研发到投放市场，投入大 约为30亿~60亿美元。
基因工程菌的制备
❖ 目的基因的分离 克隆载体
→ 目的基因与克隆
载体的体外重组
重组体导入大肠杆菌K12
→
→
受体菌的培养及筛选 从受体菌中获取目的基因
表达载体
重组质粒
导入大肠杆菌
→
受体菌的筛选，表达性、稳定性等检测
工程菌
一、目的基因的分离与扩增
❖ 1. 破碎细胞，用Trizol法提取总的RNA ❖ 2. 将生产干扰素的人白细胞的mRNA分级分离然后进行凝胶
存在的问题：
（1）同种产品生产厂家过多，造成市场恶性竞 争， 严重影响产业的健康发展。
（2）融资渠道单一、产业发展资金不足。 （3）医药市场竞争无序，行业不正之风严重。 （4）企业管理相对滞后，技术兼经营型人才匮 乏。
后面附件PPT常用图标，方便大家提高工作效率
140 BUSINESS & FINANCE ICONS
源性DNA应低于100pg。
❖ （7）残余血清IgG含量测定
❖
在应用抗体亲和层析法作为纯化方法时必须进行此项
检定。
❖ （8）残余抗生素活性测定
❖
半成品中不应有抗生素活性存在。
❖ （9）紫外光谱扫描
❖
检查半成品的光谱吸收值，最大吸收值应在280±2纳
米。
干扰素的工艺制备流程
干扰素的工艺制备流程干扰素是一种细胞因子，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种功能。
干扰素的制备是通过基因工程技术来实现的，下面将介绍干扰素的工艺制备流程。
1. 基因克隆在干扰素的工艺制备中，首先需要进行基因克隆。
这一步是将目标基因与表达载体连接起来，形成重组 DNA 分子。
常用的表达载体包括质粒和病毒载体。
基因克隆的具体步骤如下：1.1 选择目标基因：根据所需要制备的干扰素类型，选择相应的目标基因序列。
1.2 购买引物：根据目标基因设计引物，并购买合成。
1.3 PCR 扩增：使用引物进行 PCR 扩增，得到目标基因的 PCR 产物。
1.4 酶切与连接：将目标基因的 PCR 产物切割与载体进行连接，形成重组 DNA 分子。
常用的酶切酶有 EcoRI、BamHI、XhoI 等。
1.5 转化：将重组 DNA 转化至宿主菌中，如大肠杆菌，以便后续大规模培养。
2. 克隆表达在克隆表达阶段，需要将重组 DNA 导入到宿主细胞中，并使其表达干扰素。
克隆表达的具体步骤如下：2.1 酵母菌检测: 通过将宿主细胞转化至酵母菌中，进行孢子碟试验来筛选高表达的菌株。
2.2 培养: 选取高表达的菌株进行大规模培养，提供充足的菌体用于干扰素的表达。
2.3 诱导表达: 通过添加合适的诱导剂，如等温诱导或化学诱导，使菌体产生干扰素。
2.4 培养时间控制: 根据不同的干扰素类型，确定合适的培养时间。
2.5 菌体破碎: 将培养得到的菌体进行破碎，以释放干扰素。
2.6 干扰素纯化: 利用分离纯化技术，如柱层析、高效液相层析等，对菌体提取液进行纯化，得到纯净的干扰素。
3. 干扰素的活性检测制备干扰素后，需要对其进行活性检测，以确保其具有预期的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等功能。
干扰素活性检测的方法有多种，包括：3.1 细胞抑制实验：通过对目标细胞进行处理，并观察细胞生长情况，来判断干扰素抑制细胞生长的能力。
3.2 抗病毒实验：通过对目标病毒感染细胞进行处理，并观察细胞感染情况，来判断干扰素抗病毒能力。
重组人干扰素生产工艺
基因工程干扰素a与天然干扰素a的序列区别？
重组人干扰素生产工艺
概述
2、重组干扰素的临床应用
• 广谱抗病毒活性（rhuIFNα及其PEG化，α2a, α2b, alfacon-1, α1b, ）
✓ 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎…
• 直接抗肿瘤活性（rhuIFNα及其PEG化） ✓ 毛细胞和慢性髓样白血病、 Kaposi肉瘤、非霍奇金
IFNa1b MCDLPETHSLDNRRTLMLLAQMSRISPSSCLMDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAPAISVLHE 60
Alfacon-1
QTHSLGNRRALILLAQMRRISPFSCLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHE
IFNa2a MIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILA 119 IFNa2b MIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILA 119 IFNa1b LIQQIFNLFTTKDSSAAWDEDLLDKFCTELYQQPNDLEACVMQEERVGETPLMNADSILA 120 Alfacon-1 MIQQTFNLFSTKNSSAAWNESLLEKFYTELYQQLNDLEACVIQEVGVTETPLMNVDSILA
rhuIFNα 、Alfacon-1、rhuIFNβ 、rhuIFNγ
重组人干扰素生产工艺
概述
上市重组人干扰素a的氨基酸序列
IFNa2a MCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRKISLFSCLKDRHDFGFPQEEF-GNQFQKAETIPVLHE 59
第十五章重组干扰素生产工艺
5、pH 值
菌体生长：pH 6.8 产物积累：pH 6.0 策略：两段培养
发酵工艺过程
干扰素生产工艺
6、泡沫控制
发酵工艺过程
机械除泡和消泡剂共同使用
第十五章 重组人干扰素生 产工艺
第一节 干扰素概述 第二节 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏 第三节 干扰素的发酵工艺过程 第四节 干扰素的分离纯化工艺过程
离心：
➢ 连续流离心机：2℃～10℃，16000 r/min
➢ 收集上清液：含有重组干扰素蛋白质
➢ 杂质沉淀：121℃、30min 蒸汽灭菌，焚烧处理。
干扰素生产工艺
3、初级分离
分离纯化工艺
盐析: 4M硫酸铵，2℃～10℃，搅匀静置过夜。 离心：连续流离心机，16000 r/min 保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃。
干扰素生产工艺
分离纯化工艺
第四节 干扰素的分离纯化工艺过程
15.4.1 干扰素分离工艺过程 15.4. 2 干扰素的纯化工艺过程
干扰素生产工艺
分离纯化工艺
蛋白质分离纯化的目标是增加制品的纯度或比活性， 即增加单位蛋白质的含量或生物活性。设法除去变 性的和杂蛋白，并且希望所得到蛋白质的产量和纯 度最高值。
干扰素生产工艺
干扰素概述
15.2. 3 干扰素的生产工艺路线
路线1
体外诱生干扰素制备工艺： Sendai病毒诱导人白细胞
血浆
人白细胞
分离纯化
人白干扰素
病毒诱导
1989年：IFNα-n3，批准上市 产量低：1g IFNα，需要3亿ml人血白细胞 来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵 潜在的血源性病毒污染的可能性
干扰素生产工艺
2、预处理
分离纯化工艺
干扰素制备的工艺流程
DNA分子。
转化与筛选
将重组DNA分子导入受体细 胞，通过选择性培养基筛选 出含有干扰素基因的阳性克
隆。
表达与鉴定
对阳性克隆进行培养，诱导 干扰素基因的表达，并对表 达产物进行生物学活性鉴定 。
细胞培养技术
1 2 3
细胞株选择
选择适宜的细胞株作为干扰素的生产细胞，确保 其能够在体外培养条件下稳定表达干扰素。
量病毒颗粒。
感染与表达
03
将病毒颗粒感染适宜的宿主细胞，诱导干扰素基因的表达，收
集表达产物。
纯化与精制技术
初步纯化
采用沉淀、过滤等方法去除杂质和悬浮颗粒物，初步纯化干扰素。
进一步纯化
利用各种层析技术（如凝胶过滤、离子交换等）对初步纯化产物进 行进一步纯化，提高干扰素的纯度。
精制与制剂
对高纯度的干扰素进行精制和制剂加工，以满足临床应用的需求。
• 未来发展方向：随着生物技术的不断 发展，干扰素的质量控制将更加严格 和全面。未来发展方向包括建立更加 灵敏和准确的检测方法、提高制备工 艺的效率和纯度、加强生产过程中的 监控和管理等方面，以确保干扰素的 安全性和有效性。
05 干扰素制备的工艺优化
基因重组技术的优化
01
基因重组技术是制备干扰素的 关键技术之一，通过优化重组 技术，可以提高干扰素的产量 和纯度。
干扰素的种类
α干扰素
由白细胞和成纤维细胞产生，主要用于治疗 乙型肝炎和丙型肝炎。
β干扰素
由自然杀伤细胞产生，具有广谱抗病毒活性。
γ干扰素
由T淋巴细胞产生，具有免疫调节活性。
02 干扰素制备前的准备
原材料的准备
细胞培养基
选择适合细胞生长的培养基，确保细胞生长旺盛，产量高。
转化与筛选
将重组DNA分子导入受体细 胞，通过选择性培养基筛选 出含有干扰素基因的阳性克
隆。
表达与鉴定
对阳性克隆进行培养，诱导 干扰素基因的表达，并对表 达产物进行生物学活性鉴定 。
细胞培养技术
1 2 3
细胞株选择
选择适宜的细胞株作为干扰素的生产细胞，确保 其能够在体外培养条件下稳定表达干扰素。
量病毒颗粒。
感染与表达
03
将病毒颗粒感染适宜的宿主细胞，诱导干扰素基因的表达，收
集表达产物。
纯化与精制技术
初步纯化
采用沉淀、过滤等方法去除杂质和悬浮颗粒物，初步纯化干扰素。
进一步纯化
利用各种层析技术（如凝胶过滤、离子交换等）对初步纯化产物进 行进一步纯化，提高干扰素的纯度。
精制与制剂
对高纯度的干扰素进行精制和制剂加工，以满足临床应用的需求。
• 未来发展方向：随着生物技术的不断 发展，干扰素的质量控制将更加严格 和全面。未来发展方向包括建立更加 灵敏和准确的检测方法、提高制备工 艺的效率和纯度、加强生产过程中的 监控和管理等方面，以确保干扰素的 安全性和有效性。
05 干扰素制备的工艺优化
基因重组技术的优化
01
基因重组技术是制备干扰素的 关键技术之一，通过优化重组 技术，可以提高干扰素的产量 和纯度。
干扰素的种类
α干扰素
由白细胞和成纤维细胞产生，主要用于治疗 乙型肝炎和丙型肝炎。
β干扰素
由自然杀伤细胞产生，具有广谱抗病毒活性。
γ干扰素
由T淋巴细胞产生，具有免疫调节活性。
02 干扰素制备前的准备
原材料的准备
细胞培养基
选择适合细胞生长的培养基，确保细胞生长旺盛，产量高。
干扰素的生产工艺
4. 人γ干扰素 上海生物化学研究所 中国预防医学科学院 卫生部上海生物制品研究所 第二军医大学 上海克隆生物高技术有限公司 珠海丽珠制药有限公司
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
干扰素生产工艺路线:
路线1：
体外诱生干扰素制备工艺：
Sendai病毒诱导人白细胞 1989年：IFNα-n3/Alferon，批准上市 产量低：1g IFNα，需要 3亿ml人血白细胞 来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵
上市产品：重组人干扰素rhuIFN 1986，rhuIFNα-2a， rhuIFNα-2b； 1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b； 2001－2002： PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys 表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体 工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。
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路线4：
动物无限细胞系培养生产工艺：
上市产品：rhuIFN β-1a 1996， Avonex(Biogen)； 2002， Rebif(Serono) 表达产物：166 aa 糖基化蛋白，22.5 ku 工艺特点：分泌表达，产量低，成本高,过程严格
不良反应：
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1.全身反应主要表现为流感样症状，即寒战、 发热和不适。
2.骨髓抑制在用药中可出现白细胞、血小板 和网状红细胞减少。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
3.局部反应部分患者在注射部位可出现 红斑，并有压痛，24小时后即可消退。
4.其他脱发、皮疹、血沉加快、嗜睡、 一过性肝损伤。偶见过敏性休克，用 药前作过敏试验。
2.抑制细胞增殖。干扰素抑制细胞分裂的活 性有明显的选择性，对肿瘤细胞的活性比 正常细胞大500～1000倍。干扰素抗肿瘤效 果可以是直接抑制肿瘤细胞增殖，或通过 宿主机体的免疫防御机制限制肿瘤的生长。
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干扰素生产工艺路线:
路线1：
体外诱生干扰素制备工艺：
Sendai病毒诱导人白细胞 1989年：IFNα-n3/Alferon，批准上市 产量低：1g IFNα，需要 3亿ml人血白细胞 来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵
上市产品：重组人干扰素rhuIFN 1986，rhuIFNα-2a， rhuIFNα-2b； 1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b； 2001－2002： PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys 表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体 工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。
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路线4：
动物无限细胞系培养生产工艺：
上市产品：rhuIFN β-1a 1996， Avonex(Biogen)； 2002， Rebif(Serono) 表达产物：166 aa 糖基化蛋白，22.5 ku 工艺特点：分泌表达，产量低，成本高,过程严格
不良反应：
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1.全身反应主要表现为流感样症状，即寒战、 发热和不适。
2.骨髓抑制在用药中可出现白细胞、血小板 和网状红细胞减少。
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3.局部反应部分患者在注射部位可出现 红斑，并有压痛，24小时后即可消退。
4.其他脱发、皮疹、血沉加快、嗜睡、 一过性肝损伤。偶见过敏性休克，用 药前作过敏试验。
2.抑制细胞增殖。干扰素抑制细胞分裂的活 性有明显的选择性，对肿瘤细胞的活性比 正常细胞大500～1000倍。干扰素抗肿瘤效 果可以是直接抑制肿瘤细胞增殖，或通过 宿主机体的免疫防御机制限制肿瘤的生长。
干扰素的生产工艺
基因连接质粒, 转化E.coli,筛选鉴定克隆。 测序：编码人IFNα-2b基因序列,501bp，
165aa。
第二步：表达载体的构建
IFN基因与表达载体连接 转化大肠杆菌 筛选阳性克隆 获得序列正确表达载体
第三步：工程菌的构建
转化假单胞杆 筛选高表达、稳定遗传的工程菌 获得原始菌种
菌种库的建立与保藏
3.离心：
连续流离心机：2℃～10℃，16000 r/min 收集上清液：含有重组干扰素蛋白质 杂质沉淀：121℃、30min 蒸汽灭菌,焚烧处理。
4.初级分离：
盐析: 4M硫酸铵，2℃～10℃，搅匀,静置过夜。 离心：连续流离心机，16000 r/min 保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃保存。
干扰素纯化工艺过程
透析除盐：调整溶液pH 8.0，电导值，10 ku 超滤膜，0.005 M缓冲液。
4.阳离子交换层析与浓缩
用0.1M醋酸缓冲液（pH 5.0）平衡树脂。 上样，相同缓冲液冲洗。 盐浓度线性梯度5～50 ms/cm进行洗脱 配合SDS-PAGE收集干扰素峰。 浓缩：10 ku超滤膜进行。
使用保护剂：EDTA，PMSF。 破碎－20℃菌体：2厘米以下的碎块 搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr 冻融: 细胞完全破裂，释放干扰素。
2.预处理-沉淀：
加絮凝剂聚乙烯亚胺:
2℃～10℃，搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。
加凝聚剂醋酸钙溶液:
2℃～10℃,搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进行沉 淀。
5.凝胶过滤层析
洗涤液：0.15 M NaCl的0.01M磷酸缓冲液 （pH7.0）清洗系统和树脂
上样，相同缓冲液进行洗脱。 合并干扰素部分
6.无菌过滤分装
165aa。
第二步：表达载体的构建
IFN基因与表达载体连接 转化大肠杆菌 筛选阳性克隆 获得序列正确表达载体
第三步：工程菌的构建
转化假单胞杆 筛选高表达、稳定遗传的工程菌 获得原始菌种
菌种库的建立与保藏
3.离心：
连续流离心机：2℃～10℃，16000 r/min 收集上清液：含有重组干扰素蛋白质 杂质沉淀：121℃、30min 蒸汽灭菌,焚烧处理。
4.初级分离：
盐析: 4M硫酸铵，2℃～10℃，搅匀,静置过夜。 离心：连续流离心机，16000 r/min 保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃保存。
干扰素纯化工艺过程
透析除盐：调整溶液pH 8.0，电导值，10 ku 超滤膜，0.005 M缓冲液。
4.阳离子交换层析与浓缩
用0.1M醋酸缓冲液（pH 5.0）平衡树脂。 上样，相同缓冲液冲洗。 盐浓度线性梯度5～50 ms/cm进行洗脱 配合SDS-PAGE收集干扰素峰。 浓缩：10 ku超滤膜进行。
使用保护剂：EDTA，PMSF。 破碎－20℃菌体：2厘米以下的碎块 搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr 冻融: 细胞完全破裂，释放干扰素。
2.预处理-沉淀：
加絮凝剂聚乙烯亚胺:
2℃～10℃，搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。
加凝聚剂醋酸钙溶液:
2℃～10℃,搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进行沉 淀。
5.凝胶过滤层析
洗涤液：0.15 M NaCl的0.01M磷酸缓冲液 （pH7.0）清洗系统和树脂
上样，相同缓冲液进行洗脱。 合并干扰素部分
6.无菌过滤分装
干扰素制备的工艺流程图
5
以cDNA为模板、干扰素引物为引物,PCR,得到完全的干扰素基因的PCR产物
目的基因与克隆载体进行体 外重组
1.提取载体(质粒、病毒等),双酶切,再 把干扰素基因的PCR产物用相应的 酶酶切,用连接酶连接
2.连接完成后分离纯化,测序,与原干扰 素序列比对。
3.鉴定序列无误后(无义突变也行),导 入受体细胞,筛选
4.菌体收集 将已降温的发酵液转入连续流离心机，16000r/min离心收集。进行干扰
素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目的检测。菌 体于一20 ℃冰柜中保存时，不得超过12个月。每保存3个月，检查一次活性。
干扰素发酵过程控制
在假单孢杆菌的发酵生产中，菌体在培养1.5小时分裂速度最快，到3.5 小时开始下降。而干扰素的迅速合成出现在3.5小时之后，在4小时达到 最大，然后由于降解而迅速下降。可见在发酵生产工艺中，假单孢杆 菌的生长和干扰素的生产基本处于不相关状态，可采用两段培养的策 略进行过程控制。
干扰素制备的工艺流 程图
干扰素
什么是干扰素?
• 概念(interferon,IFN):机体免疫细胞产生的一类细胞因 子,是机体受到病毒感染时,免疫细胞通过抗病毒应答反 应而产生的一组结构类似、功能接近的生物调节蛋白。
• 根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、ω等4个 类型。
• α干扰素又依其结构分为α1b、α2a、α2b等亚型
(3).pH值 发酵过程中，pH的变化由工程菌的代谢、培养基的组成和发酵 条件所决定。干扰素- α的等电点在pH6.0附近，在低酸性条件下稳定，能耐 受pH2.5的酸性环境。因此可在发酵后期降低pH,从而造成大量蛋白酶失活减 少干扰素-α的水解，提高干扰素的积累量。
重组人干扰素生产工艺
4.2、干扰素的纯化工艺过程
4.1 干扰素α-2b分离工艺过程
菌体裂解 预处理 初级分离
(1)菌体裂解
裂解缓冲液：纯化水配制，2℃～10℃ （pH7.5）
使用保护剂：EDTA，PMSF。 破碎－20℃菌体：2厘米以下的碎块 搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr 冻融: 细胞完全破裂，释放干扰素。
对淋巴细胞的作用：干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂，可受剂量和时间等因素的影 响而产生不同的效应。在抗原致敏之前使用大剂量干扰素或将干扰素与抗原同时投入 会产生明显的免疫抑制作用；而低剂量干扰素或在抗原致敏之后加入干扰素则能产生 免疫增强的效果。在适宜的条件下，IFNγ对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用， 但不能促进其增殖。IFNγ能增强TH1细胞的活性，增强细胞免疫功能；但对TH2细胞的 增殖有抑制作用，因此抑制体液免疫功能。IFNγ不仅抑制TH2细胞产生IL-4，而且抑制 IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成IgE。
基因工程假单胞杆菌菌种建立 基因工程假单胞杆菌菌种特性 菌种库的建立与保藏
2.1、基因工程假单胞杆菌菌种建立
第一步：干扰素α-2b基因的克隆 第二步：表达载体的构建 第三步：工程菌的构建
第一步：干扰素基因的克隆(RT-PCR)
制备白细胞，病毒诱导，分离mRNA,反录酶合成cDNA,PCR， 基因连接质粒, 转化E.coli,筛选鉴定克隆。 测序：编码人IFNα -2b基因序列,501bp，165aa。
(1) 溶解粗干扰素
配制纯化缓冲液： 超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45 μm滤器和 10 ku超滤系统，百级层流下收集。冷却至 2℃～10℃。
检查: 缓冲液的pH值和电导值。 溶解：
4.1 干扰素α-2b分离工艺过程
菌体裂解 预处理 初级分离
(1)菌体裂解
裂解缓冲液：纯化水配制，2℃～10℃ （pH7.5）
使用保护剂：EDTA，PMSF。 破碎－20℃菌体：2厘米以下的碎块 搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr 冻融: 细胞完全破裂，释放干扰素。
对淋巴细胞的作用：干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂，可受剂量和时间等因素的影 响而产生不同的效应。在抗原致敏之前使用大剂量干扰素或将干扰素与抗原同时投入 会产生明显的免疫抑制作用；而低剂量干扰素或在抗原致敏之后加入干扰素则能产生 免疫增强的效果。在适宜的条件下，IFNγ对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用， 但不能促进其增殖。IFNγ能增强TH1细胞的活性，增强细胞免疫功能；但对TH2细胞的 增殖有抑制作用，因此抑制体液免疫功能。IFNγ不仅抑制TH2细胞产生IL-4，而且抑制 IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成IgE。
基因工程假单胞杆菌菌种建立 基因工程假单胞杆菌菌种特性 菌种库的建立与保藏
2.1、基因工程假单胞杆菌菌种建立
第一步：干扰素α-2b基因的克隆 第二步：表达载体的构建 第三步：工程菌的构建
第一步：干扰素基因的克隆(RT-PCR)
制备白细胞，病毒诱导，分离mRNA,反录酶合成cDNA,PCR， 基因连接质粒, 转化E.coli,筛选鉴定克隆。 测序：编码人IFNα -2b基因序列,501bp，165aa。
(1) 溶解粗干扰素
配制纯化缓冲液： 超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45 μm滤器和 10 ku超滤系统，百级层流下收集。冷却至 2℃～10℃。
检查: 缓冲液的pH值和电导值。 溶解：
干扰素生产工艺
干扰素生产工艺干扰素是一种重要的抗病毒蛋白质，广泛应用于临床医学中治疗病毒感染和恶性肿瘤。
干扰素的生产工艺包括基因工程和发酵工艺两个部分。
基因工程是干扰素生产的关键步骤之一。
首先，从人体或其他动物中提取相关基因，然后将其插入到融合质粒或细胞株中。
目前常用的融合质粒是质粒pBR322，细胞株则多选用大肠杆菌(E.coli)。
将外源基因与质粒或细胞株插入时，需要加入特定的限制性内切酶进行剪切，以保证外源基因能够正确插入。
接下来，利用转化法将融合质粒或细胞株引入宿主细胞中，形成重组细胞。
重组细胞经过筛选和分离，最终能够获得具有干扰素基因的细胞株。
发酵工艺是干扰素生产的另一个重要环节。
发酵是利用微生物在合适的培养基中进行代谢活动，生产目标产物。
干扰素的生产主要利用大肠杆菌进行发酵。
首先，将重组细胞培养在含有理想培养基的发酵罐中。
理想的培养基是指含有合适的碳源、氮源、矿物质和辅助因子的培养基，能够提供微生物生长所需的养分。
培养基的pH值、温度和搅拌速度等条件也需要适当控制，以保证微生物能够有效地生长和产生干扰素。
在发酵过程中，需要定期对发酵罐中的微生物进行监测和控制。
通过检测微生物的生长情况、溶氧和酸碱度等参数，可以调整培养条件，以提高干扰素的产量和纯度。
此外，还需要对干扰素进行纯化和浓缩处理。
一般采用柱层析和超滤等技术，将发酵液中的干扰素与其他杂质物进行分离和去除，最终得到较纯的干扰素溶液。
总之，干扰素的生产工艺主要包括基因工程和发酵工艺两个部分。
基因工程通过插入外源基因将干扰素基因引入宿主细胞中，形成重组细胞。
发酵工艺则利用重组细胞在合适的培养基中进行发酵，通过监测和控制微生物的生长条件，最终得到较纯的干扰素产物。
随着生物技术的不断发展，干扰素的生产工艺也在不断优化，以提高产量和纯度，满足临床应用的需求。
重组人干扰素生产工艺
重组人干扰素生产工艺一、简介重组人干扰素（Interferon）是一类重要的免疫调节蛋白，在生物制药领域具有广泛的应用，特别是在抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等方面。
重组人干扰素生产工艺是指利用基因工程技术，将人体细胞中制造干扰素的基因导入细菌、真菌或动植物细胞中，并通过发酵、提取等步骤最终制备重组人干扰素的过程。
本文将介绍重组人干扰素生产工艺的关键步骤、技术原理及优化方法。
二、生产工艺步骤1.基因克隆和表达载体构建：–选择适合的重组表达宿主菌，如大肠杆菌、毕赤酵母等。
–将编码重组人干扰素的基因克隆到表达载体中，构建表达载体。
–将表达载体导入宿主菌细胞中，实现干扰素基因的表达。
2.发酵过程：–设计合适的培养基，满足宿主菌的生长和表达需求。
–进行适当的培养条件控制，如温度、pH值、氧气供给等。
–监测培养过程中的生长情况和干扰素的表达水平。
3.重组人干扰素的提取与纯化：–通过离心、超滤等方法将细菌或细胞破碎，释放干扰素。
–采用亲和层析、离子交换层析等技术进行干扰素的纯化和富集。
–进行最终的纯化步骤，得到高纯度的重组人干扰素。
三、关键技术原理•基因克隆：利用PCR扩增目的基因，将其插入适当的表达载体中。
•表达调控：通过调控启动子、转录子等元件来控制干扰素基因的表达水平。
•蛋白质纯化：利用蛋白质的生物特性，如大小、电荷等，选用不同的层析技术进行纯化。
四、工艺优化方法1.菌种优化：选择高表达、稳定的宿主菌株，优化质粒结构。
2.培养条件优化：根据宿主菌的生长情况，调整培养基成分和培养条件。
3.表达调控：利用诱导剂、转录启动子等手段调控干扰素基因的表达水平。
4.提取纯化优化：优化破碎、纯化过程，提高干扰素的产率和纯度。
五、结论重组人干扰素的生产工艺是一项复杂而重要的技术，通过不断优化工艺流程和条件，可以提高干扰素的产量和纯度，满足临床和市场需求。
未来随着基因工程技术的不断发展，重组人干扰素生产工艺将进一步精细化和高效化，为人类健康带来更大的益处。
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干扰素生产工艺
第二步：工程菌构建
假单胞杆菌的构建与保藏
转化腐生型假单胞杆菌 筛选高表达、稳定遗传的工程菌 获得原始菌种
pVG3
干扰素生产工艺
假单胞杆菌的构建与保藏
15.2. 2 基因工程假单胞杆菌菌种特性
具有宿主菌的特征：
➢细菌：革兰氏阴性菌，有荚膜，无芽孢，杆状。 ➢菌落：直径2.5-3.0 mm，灰绿色半透明状，粘稠。 ➢生化特性:Ser —，L-Val、D/L-Arg和L-Thr为碳源。
➢前4h：30℃，pH7.0，DO为30% ➢4h后：20℃，pH6.0，DO为60%，5～6.5h ➢终点控制：OD值达9.0±1.0，5℃冷却水快
速降温至15℃以下
检测：发酵液杂菌检查
干扰素生产工艺
4、菌体收集
发酵工艺过程
连续流离心机：冷却的发酵液，16000 r/min离心收集。 菌体保存：－20℃冰柜，不超过12个月。 检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、
工艺特点：分泌表达，产量低，成本高，过程严格
干扰素生产工艺
路线5
干扰素概述
基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺：
宿主：腐生型假单胞杆菌（Pseudomonas putida） 上市产品：IFN α-2b/Alferon安福隆 表达产物：无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子结构
和生物活性
工艺特点： ➢ 发酵周期短：几个小时 ➢ 无需变性、复性过程，获得有活性产品 ➢ 纯化过程：淘汰抗体亲和层析
5、pH 值
菌体生长：pH 6.8 产物积累：pH 6.0 策略：两段培养
发酵工艺过程
干扰素生产工艺
6、泡沫控制
发酵工艺过程
机械除泡和消泡剂共同使用
第十五章 重组人干扰素生 产工艺
第一节 干扰素概述 第二节 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏 第三节 干扰素的发酵工艺过程 第四节 干扰素的分离纯化工艺过程
质粒结构一致性、质粒稳定性。
干扰素生产工艺
发酵工艺过程
15.3. 2 重组人IFN-α2b 的发酵工艺控制
1、菌体生长与产物合成的关系
指数期：1.5-3.5hr左右 产物合成期：4hr左右最大。
不相关或非偶联型
干扰素生产工艺
2、培养基的配制
发酵工艺过程
种子培养基：C/N比较低的培养基 发酵培养基：C/N比较高的培养基 pH控制：加入缓冲体系
工程菌的特征：SmR、TcR、ApR 具有生产干扰素能力：
干扰素生产工艺
假单胞杆菌的构建与保藏
15.2. 3 主菌种库的建立与保藏
原始菌种
传代扩增
冻干保藏
加入甘油
QC：菌种特性、生产能力、质粒稳定性 菌种检查合格后，方可投产。
干扰素生产工艺
假单胞杆菌的构建与保藏
主菌种库 或上一代 工作菌种 库
15.2. 4 工作菌种库的建立与保藏
工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。
干扰素生产工艺
路线4
动物无限细胞系培养生产工艺：
工程CHO细 胞系构建
细胞培养
收集培养液
干扰素概述
分离纯化
上市产品： rhuIFNβ-1a
➢1996，Avonex(Biogen)
重组人干扰素
➢2002，Rebif(Serono)
表达产物：166 aa糖基化蛋白，22.5 ku
第十五章 重组人干扰素生 产工艺
第一节 干扰素概述 第二节 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏 第三节 干扰素的发酵工艺过程 第四节 干扰素的分离纯化工艺过程
干扰素生产工艺
假单胞杆菌的构建与保藏
第二节 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏
15.2.1 基因工程假单胞杆菌菌种建立 15.2. 2 基因工程假单胞杆菌菌种特性 15.2. 3 菌种库的建立与保藏 15.2. 4 工作菌种库的建立与保藏
干扰素生产工艺
15.4. 2 干扰素的纯化工艺过程
分离纯化工艺
干扰素生产工艺
2、种子罐培养
发酵工艺过程
接种：接入30L种子罐，接种量10% 培养：30℃，pH7.0 控制：级联调节通气量和搅拌转速
DO为30%，3～4h，OD>4.0 检测：显微镜和LB培养基划线检查，控制杂菌。
干扰素生产工艺
3、发酵罐培养
发酵工艺过程
接种：通入300L培养基的发酵罐，接种量 10%。 控制：级联调节通气量和搅拌转速。
裂解缓冲液：纯化水，2℃～10℃（pH7.5） 使用保护剂：EDTA、DTDE、PMSF 破碎-20℃菌体：2厘米 搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr 冻融: 细胞完全破裂，释放干扰素。
将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞 内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞 结构破碎。
测序：编码人IFNα-2b基因序列，501bp，165aa。
ATGTGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTT GATGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAA GGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGGTTGCCAACCAGTTC CAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATC TTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACC CTCCTAGACAAATTCACACGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTCGA AGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGA AGGAGGACTCCATTCTGGCTGTCAGGAAATACTTCCAAAGAATCACCT CTACTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAG AGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAG TTTAAGAAGTAAGGAATGA
干扰素生产工艺
路线2
干扰素概述
人源转化细胞系培养生产工艺：
Namalva培养
合成干扰素
分离纯化
病毒诱导
1999年：IFN α-n1/Wellferon, 批准用于临床。 优点：首次实现大规模商业化生产。 缺点：活性低，退出临床应用。
多亚型混 合干扰素
干扰素生产工艺
路线 3
干扰素概述
基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:
第十五章 重组人干扰素生 产工艺
第一节 干扰素概述 第二节 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏 第三节 干扰素的发酵工艺过程 第四节 干扰素的分离纯化工艺过程
干扰素生产工艺
第一节 干扰素概述
15.1.1 干扰素的种类 15.1. 2 干扰素的临床应用 15.1. 3 干扰素的生产工艺路线
干扰素概述
干扰素生产工艺
OD值 5.5
离心
摇瓶种 子培养
种子 罐 培养
Ependorf 管
OD值 8.0 培养 基
第十五章 重组人干扰素生 产工艺
第一节 干扰素概述 第二节 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏 第三节 干扰素的发酵工艺过程 第四节 干扰素的分离纯化工艺过程
干扰素生产工艺
发酵工艺过程
第三节 干扰素的发酵工艺过程
干扰素生产工艺
2、预处理
分离纯化工艺
菌体自溶、核酸、蛋白质及其它有机粘性物质造成的浑浊，如果不经 过适当的预处理就直接进行过滤或离心沉降，不但速度极慢，甚至得 不到澄清的蛋白质
加絮凝剂聚乙烯亚胺：2℃～10℃，搅拌，对菌体碎片
进行絮凝。
加凝聚剂醋酸钙溶液：2℃～10℃,搅拌，对菌体碎
片、DNA等进行沉淀。
工程菌构建
发酵培养
包涵体
复性
上市产品：重组人干扰素rhuIFN ➢ 1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b；
重组人干扰素
➢ 1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b；
➢ 2001－2002：PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys
表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体
干扰素生产工艺
干扰素的理化性质
143～166aa； MW:18 ～ 40 ku； pI:6.5 ～ 7.5； 乙醚、氯仿敏感 容易吸附介质。
干扰素概述
N C
IFN α结构
干扰素生产工艺
15.1. 2 干扰素的临床应用
干扰素概述
广谱抗病毒活性（rhuIFNα） 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。 直接抗肿瘤活性（rhuIFNα） 白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。 免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFNγ） 多发性硬化症（rhuIFNβ）
1980-1982年，科学家用基因工程方法在大肠杆菌及酵母菌 细胞内获得了干扰素，从每1升细胞培养物中可以得到20-40毫 升干扰素。从1987年开始，用基因工程方法生产的干扰素进 入了工业化生产，并且大量投放市场。
干扰素生产工艺
15.1.1 干扰素的种类
干扰素概述
概念：（interferon，IFN） 机体受到病毒感染时，免疫细胞产生的一组结构类 似、功能接近的细胞因子 功能：干扰病毒在细胞内的增殖 根据干扰素蛋白质的氨基酸结构、抗原性和细胞来源， 可将其分为：IFN-α、IFN-β、IFN-γ 干扰素-α有24种亚型，其中包括干扰素-α2a、干扰素α1b、 干扰素-α2b、干扰素-α2c等 上市重组干扰素: α-2a、α-2b、α-1b、β-1b，γ
干扰素生产工艺
分离纯化工艺
第四节 干扰素的分离纯化工艺过程
15.4.1 干扰素分离工艺过程 15.4. 2 干扰素的纯化工艺过程
干扰素生产工艺