酵母细胞壁糖肽的结构

糖肽A
无
经盐酸甲醇溶液 处理的糖肽A 甘露聚糖 甘露糖
无
甘露单糖，痕量寡糖和痕量 葡萄糖 无 甘露糖和痕量葡萄糖
无 —
结果
• 氨基酸氧苷键在不同酸浓度下的稳定性
样品进行酸水解后，进行β-消除反应。在0.5 N（●）和1.0 N（▲）盐 酸的稳定性，纵坐标代表根据水解后的产物得到的β-消除发生率。
结果
4.9 mg糖肽A2
1 μmole糖肽A2 氨基酸 质量 （μg） 266 833 420 294 230 150 267 230 65 66 45 41 73
1 mole糖 蛋白质 肽A中氨 含量 基酸的摩 尔数 （%）
3.0 7.0 4.0 3.0 3.0 3.0 4.0 3.0 1.5 1.5 0.5 0.5 1.5 痕量 痕量 1.0
氨基酸残基 0h Asp Thr Ser Glu 510 950 420 530 氨基酸含量（μmoles） 24 h 530 680(-28%) 328(-21%) 525 144 h 540 375(-60%) 240(-42%) 470 168 h 525 342(-64%) 240(-42%) 550
• 从糖肽A2制备甘露糖：
糖肽A2与2 N氢氧化钠在21℃下进行β-消除反应， 2 h内逐渐升高至 98℃。
结果
• 糖肽A2的高碘酸氧化：
被还原的高碘酸量如Fig. 9所示，甲酸的生成量则如Fig. 10所示。 在最初的阶段，酸迅速生成；而在随后的第二阶段，酸的产生速 度大大降低。
结果
• 甲酸的生成量
Table 3 糖肽A和A2中的氨基酸组成
氨基酸残基
1 mole糖 氨基酸/氨 肽A2中氨 氨基酸 蛋白质含量 基葡萄糖 基酸摩尔 含量 (μmoles/μm （%） 数 （μg） ole)
17.8 51.2 26.2 17.8 14.0 8.7 16.0 10.9 3.9 4.0 2.5 2.3 4.5 痕量 痕量 2.19 7.05 4.09 1.98 2.00 1.90 2.95 1.52 0.42 0.58 0.23 0.23 0.58 2.0 7.0 4.0 2.0 2.0 2.0 3.0 2.0 0.5 0.5 0.2 0.2 0.5 痕量 痕量 1.0
结果
• 甘露聚糖中乙酰氨基葡萄糖的含量：
糖肽A2 （100 mg）在0.5 N盐酸中，100℃反应5 h，通过纸色谱 检测到N-乙酰氨基葡萄糖。
糖肽A2与Helix pomatia蜗牛酶在不同pH值（pH 3.3、5.0、7.0和
8.2）作用，得到的消化液均未检出N-乙酰氨基葡萄糖。
Asp Thr Ser Glu Pro Gly Ala Val Ile Leu Tyr Phe Lys His Arg 氨基葡萄糖
3.7
3.9
结果
• 糖肽A2的稳定性：
糖肽A2在1%（w/v）HCl甲醇溶液中反应7 h，总糖量为（●） 和总蛋白量为（▲），发现蛋白质和糖类是逐步释放的。
结果
• 糖肽A2的稳定性：
Scheme 2
甘露糖-6-
高压纸电泳 纸色谱法
• 糖肽A2的碱处理发生β-消除
糖肽A2与不同浓度的氢氧化钠在不同温度下反应，水解释 放氨基酸，检测发现苏氨酸和丝氨酸的释放呈渐进性 （Table 4）。 推测可能是由于糖肽A2的醇盐部分发生β-消除反应得到脱 氢产物。
Table 4 4℃下20 mg糖肽A2经0.1 N氢氧化钠β-消除后， 特定氨基酸的浓度变化
摩尔质量（平均数） 糖肽A2的氨基葡萄糖含量 DNP-甘露聚糖 糖肽A2的轴比
3.88×10-13 3.60×10-7 0.66
7.6×104 5.9×104 8.0×104 7.3×104 20（扁椭球体）
结果
• 氨基酸鉴定
糖肽A2样品进行两次酸水解，每次水解后均用自动分析器 进行检测（如Table 2）。 酸水解的条件为6 N盐酸，100℃下，反应16 h，得到每一 种氨基酸的绝对含量（Table 3）。
酵母细胞壁糖肽的结构
讲解人 郑珊珊
结论
• 均一物质，分子量为76000，为一非对称性的类椭球体，轴比为 20。 • 甘露聚糖和大约4%的氨基酸 • 氨基酸种类已经确定，它的结构中含有丰富的丝氨酸和苏氨酸， 同时还含有氨基葡萄糖 • 稀碱处理，发生β-消除反应，降解糖肽→氧苷键是糖类和氨基 酸之间的连接方式之一 • β-消除反应，大部分甘露聚糖仍连接在肽链上，存在其他连接 方式。 • 热碱液处理，得到相同当量的天冬氨酸和氨基葡萄糖（唯一） • 6-甘露糖磷酸盐是糖肽组成成分之一 • Helix pomatia蜗牛消化酶无法游离结构中的氨基葡萄糖
实验材料和方法
一、原料和提取
面包酵母为原料 提取方法：
酸法浸提、碱法浸提、有机溶剂浸提、酶法提取、热 水提取
得到糖肽：糖肽A、B、C
链霉蛋白酶水解 葡聚糖凝胶柱分离纯化
A2、B2、C2
实验材料和方法
二、分析方法
超速离心分析、沉降分析、部分比容、粘度测定、高电压纸电 泳、 纸色谱法、组合色谱法
Table 2 100℃下6 N盐酸水解糖肽A2得到的氨基酸
氨基酸残基
Asp Thr Ser Glu Pro Gly Ala Val Leu Ile Tyr Phe Lys His Arg 乙酰丙酸
4h
133 390 254 121 122 80 190 93 30 31 14 14 31
16 h
Pro Gly Ala Val Ile Leu 乙酰丙酸
480 370 730 430 160
469 370 660 422 169 痕量 存在
425 368 708 400 160
480 398 700 435 160
结果
• 通过分光光度计（Beckman，DK 2A）测定反应液在241 mμ 下的消光率，可以检测氨基酸脱氢产物的形成。●代表含 碱的糖肽量，▲代表不含碱的糖肽量。
结果
• 证实丝氨酸和苏氨酸脱氢产物的生成：
将糖肽的残余物用硼氢化钾还原、水解→丙氨酸、α氨基丁酸 将脱氢氨基酸与亚硫酸钠反应→磺酸衍生物
Table 5 糖肽A在21℃下用0.1 N氢氧化钠水解（β-消 除反应）24 h后，经透析得到的糖类
物质 β-消除反应前的分散性糖 β-消除反应后的分散性糖 甘露单糖，二糖以及寡糖， 痕量葡萄糖
当底物与0.1 N硫酸反应时，初始阶段，糖肽水解仅释放 糖类；随着水解的进行，氨基酸逐渐被释放。
结果
• 糖磷酸盐的鉴定
糖肽A2在2 N盐酸中100℃下回流75 min 甘露糖-6高压纸电泳 磷酸盐
纸色谱法 Scheme 2
Scheme 2
结果
• 糖磷酸盐的鉴定
糖肽A2在2 N盐酸中100℃下回流75 min 磷酸盐
碳水化合物鉴别：苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法
氨基酸和氨基糖鉴别：自动分析仪 磷含量测定：Fiske-Subbarow法
高碘酸盐的吸收度测量、甲酸释放量的测定、高碘酸盐氧化后甘露糖
的测定、碱处理β-消除反Biblioteka Baidu等
结果
• 沉降系数
S20 = 3.88×10-13 cm· g-1sec-1
结果
134 380 201 120 133 85 185 93
24 h
40 h
110 h
129 118 37 118 122 116 183 91
推算至水解0时或最 大值
134 430 250 121 122 116 190 93 30 31 14 14 31
135 139 306 239 150 101 119 123 115 119 90 93 187 178 101 87 无明显变化 无明显变化 无明显变化 无明显变化 无明显变化 痕迹量 痕迹量 存在
• 扩散系数
D20 = 3.6×10-7 cm2· sec-1
• 部分比容
值为0.66 mL/g
• 分子量的测定
Svedberg方程
• 粘度的测量
特性粘度 = 32.5
Simha方程
轴比值20（扁椭球体）
Table 1 糖肽A2和甘露聚糖的化学和理化常数总结
糖肽A2
S20 (cm.g.-1sec.-1) D20 (cm.2sec.-1) 部分比容 由沉降分散系数得到的摩尔 质量（平均质量） 糖肽A2 甘露聚糖