Gel Filtration
凝胶层析法(凝胶过滤)脱盐和分离蛋白质-1
凝胶层析法(凝胶过滤)脱盐和分离蛋白质-1原理凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。
脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。
前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。
所以，要根据具体情况选择使用。
凝胶达滤后样品体积不会太增加，所以选用凝胶过滤法。
凝胶过滤（gel filtration），又称为凝胶层析（gel chromatograph y）、分子筛过滤（molecularsieve filtration）、凝胶渗透层析（gel osmotic chromatography）等。
它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。
其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。
凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。
网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。
人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。
凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。
分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。
这样被分离物质即被按分子的大小分开。
用于凝胶层析的凝胶均为人工合成的产品，主要有交联葡聚糖（商品名为Sephadex）、琼脂糖（商品名为Sepharose）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio–gel）及具有一定网眼的细玻璃珠等和这些凝胶的衍生物。
生化实验血红蛋白的凝胶过滤
血红蛋白的凝胶过滤植物098 原硕0901080808摘要：用凝胶过滤分离血红蛋白样品，理解凝胶过滤原理，熟悉凝胶过滤操作方法。
关键字：血红蛋白，凝胶过滤一、研究背景及目的：凝胶过滤（gel [filtration] chromatography ; gel filtration chromatography ; GFC）作为一种常用的分离过滤方法，是实验中的常用手段之一，具有它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。
对于高分子物质有很好的分离效果等优点。
在很多方面都有所应用：⑴脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。
本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。
适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6.柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25％-30％，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。
⑵用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。
凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。
⑶测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。
测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗肿后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。
⑷高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液所以理解其原理及应用方法也是很重要的，本实验通对血红蛋白采用凝胶过滤，理解凝胶过滤的基本原理，熟悉和掌握凝胶过滤的基本操作技术。
凝胶过滤色谱名词解释
凝胶过滤色谱名词解释凝胶过滤色谱(gelselution column chromatographic technique)，是一种新型分离技术。
凝胶色谱柱以亲水性高分子凝胶为固定相，利用凝胶良好的吸附、分子筛特性及表面活性等特点将待分离组分吸附在固定相表面上。
凝胶可分为亲水性高分子凝胶与疏水性高分子凝胶，前者为大孔、多孔网状凝胶，后者为微孔、无定形网状凝胶，由于孔径不同，对流动相中不同极性物质有不同选择吸附力，可使极性或非极性物质实现分离。
当样品中混杂的组分经柱子传输至检测器时，样品中组分首先被凝胶中的疏水性成分所吸附，凝胶中的亲水性成分随后被流动相中的流动相携带通过凝胶颗粒间隙向检测器移动，并将其分离。
分析时将被测组分和内标一起加入到样品溶液中，样品中的待测组分会被凝胶中的亲水性成分所吸附，然后样品中被吸附的组分随着流动相向检测器移动，被内标识别并解吸下来，从而得到待测组分的含量。
凝胶过滤色谱的分离机理主要包括吸附和洗脱两个阶段。
吸附过程是在固定相表面发生的。
在这个过程中，柱中的溶剂可能会进入凝胶中，因此样品中的组分被吸附到凝胶颗粒的表面上。
这些固定相颗粒都有各自的孔隙结构，它们的表面积比较大，有利于吸附。
在凝胶吸附过程中，除了样品溶液本身的极性外，溶剂的极性也是吸附过程发生的必要条件。
同时，由于凝胶是高分子材料，因此在受到搅拌作用时，凝胶中会形成较大的内部和外部剪切应力场，这就有利于保证吸附过程的正常进行。
洗脱过程是当样品溶液通过凝胶柱后，由于凝胶的吸附作用，样品溶液中某些组分可能会留在凝胶上，从而影响了后续流动相的吸收，导致浓度信号减弱或消失，这就需要在适当的位置加入流动相把这些“逃逸”的组分重新吸引到柱子上来。
如果不考虑流动相的洗脱能力，则要求样品溶液中被吸附的组分具有较强的洗脱能力。
实际工作中，加入足够量的流动相将样品溶液洗脱下来，是保证仪器稳定运行的关键步骤之一。
所以，要达到好的分离效果，就要选择适合的流动相，且适宜的洗脱条件，但这还远远不够，还需要有好的柱设计，即凝胶色谱柱的理论模型。
gpc原理
gpc原理GPC原理是指凝胶过滤、离心沉淀和电泳分离这三种方法在蛋白质分离中的应用。
GPC即Gel Permeation Chromatography，又称为Gel Filtration Chromatography，中文名为凝胶渗透色谱法。
GPC是一种基于分子大小分离的液相层析技术，主要用于分离高分子化合物，如蛋白质、核酸、多糖等。
凝胶过滤色谱法是GPC原理中的第一步。
凝胶过滤色谱法是利用凝胶孔隙的分子筛作用，将样品中的大分子分离出来。
样品在溶剂中通过凝胶柱时，大分子无法通过凝胶的孔隙，只能在柱中停留，而小分子可以通过凝胶的孔隙流出柱外。
因此，通过凝胶过滤可以将不同分子大小的化合物分离开来。
离心沉淀是GPC原理中的第二步。
离心沉淀是将样品在离心的作用下分离出不同密度的组分。
样品在离心机中高速旋转时，分子按照不同的密度沉淀到离心管的不同位置，从而实现分离。
离心沉淀常用于分离细胞、细胞器和蛋白质等生物大分子。
电泳分离是GPC原理中的第三步。
电泳分离是利用电场的作用将样品中的化合物分离出来。
样品在电场中运动时，不同分子的运动速度不同，从而实现分离。
电泳分离可用于分离DNA、RNA、蛋白质等。
GPC原理可以应用于许多领域，如生物化学、药物研发、环境监测等。
在生物化学中，GPC可以用于蛋白质的分离纯化和质量检测；在药物研发中，GPC可以用于药物的分子量测定和药物的纯化；在环境监测中，GPC可以用于分离和检测污染物。
GPC原理是一种基于分子大小分离的液相层析技术，可以用于分离高分子化合物，如蛋白质、核酸、多糖等。
凝胶过滤、离心沉淀和电泳分离是GPC原理中的三种分离方法，可以分别应用于不同的领域。
GPC原理在生物化学、药物研发、环境监测等领域具有广泛的应用前景。
不同分子量蛋白质的分离――凝胶管柱层析法(gel filtration colu
不同分子量蛋白质的分离――凝胶管柱层析法(gel filtration colu实验原理凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。
该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。
大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。
凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。
这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。
任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数 Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。
Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。
分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。
通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。
该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。
但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。
测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。
本实验使用血红蛋白（分子量64,500左右）和二硝基氟苯－鱼精蛋白（DNP－鱼精蛋白分子量12,000左右）的混合物，通过Sephadex G－25层析后达到分离。
1 Gel Filtration凝胶过滤
12
Group separation
The media suitable for group separations:
5
2. Gel filtration is well suited for biomolecules that may be sensitive to changes in pH, concentration of metal ions or co-factors and harsh environmental conditions.
Sephadex G-10, G-25 and G-50 .
Sampling volume for group separation: Large
sample volumes up to 30% of the total column volume (packed bed) can be applied at high flow rates using broad, short columns. Figure 4 shows the elution profile (chromatogram) of a typical group separation.
The goal may be to isolate one or more of the
components, to determine molecular weight, or to analyze the molecular weight distribution in the sample.
凝胶过滤(gel filtration,GF)的应用
凝胶过滤(gel filtration,GF)的应用1.生物大分子的纯化凝胶过滤是依据分子量的不同来进行分离的，由于它的这一分离特性，以及它具有简单、方便、不改变样品生物学活性等优点，使得凝胶过滤成为分离纯化生物大分子的一种重要手段，尤其是对于一些大小不同，但理化性质相似的分子，用其它方法较难分开，而凝胶过滤无疑是一种合适的方法。
例如对于不同聚合程度的多聚体的分离等。
2.分子量测定外水体积是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。
内水体积是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。
基质体积是指凝胶颗粒实际骨架体积。
而柱床体积就是指凝胶柱所能容纳的总体积。
洗脱体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。
设柱床体积为Vt，外水体积为Vo，内水体积为Vi，基质体积为Vg，则有：Vt＝Vo＋Vi＋Vg由于Vg相对很小，可以忽略不计，则有：Vt＝Vo＋Vi设洗脱体积为Ve，Ve一般是介于Vo 和Vt之间的。
对于完全排阻的大分子，由于其不进入凝胶颗粒内部，而只存在于流动相中，故其洗脱体积Ve＝Vo；对于完全渗透的小分子，由于它可以存在于凝胶柱整个体积内（忽略凝胶本身体积Vg），故其洗脱体积Ve＝Vt。
分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间。
在一定的范围内，各个组分的Kav以及Ve与其分子量的对数成线性关系。
Kav＝－b lg MW＋cVe＝－b’ lg MW＋c’由此通过对已知分子量的标准物质进行洗脱，作出Ve或Kav对分子量对数的标准曲线，然后在相同的条件下测定未知物的Ve或Kav，通过标准曲线即可求出其分子量。
凝胶过滤测定分子量操作比较简单，所需样品量也较少，是一种初步测定蛋白分子量的有效方法。
这种方法的缺点是测量结果的准确性受很多因素影响。
由于这种方法假定标准物和样品与凝胶都没有吸附作用，所以如果标准物或样品与凝胶有一定的吸附作用，那么测量的误差就会比较大；上面公式成立的条件是蛋白基本是球形的，对于一些纤维蛋白等细长的形状的蛋白不成立，所以凝胶过滤不能用于测定这类分子的分子量；另外由于糖的水合作用较强，所以用凝胶过滤测定糖蛋白时，测定的分子量偏大，而测定铁蛋白时则发现测定值偏小；还要注意的是标准蛋白和所测定的蛋白都要在凝胶过滤的线性范围之内。
第四章 凝胶过滤
5
二、分配系数Kd
衡量组分被排阻程度的一个特征参数 介质内部组分的浓度 介质外部组分的浓度 C内 C外
Kd=
=
A：当分子量大到完全不能进入颗粒内部，即完全被排阻，此时C内=0，
Kd=0。
B：当分子量小到完全可以自由进入到凝胶颗粒内部，在分配达到平衡时， 凝胶内部与外部组分的浓度相等，此时Kd=1。 C：在一般情况下，凝胶层析中，流动相和固定相溶液的性质是相同的，所
械强度大于2B，筛孔也小于2B。 以上三种胶：葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶本身的理化性质
不稳定，机械强度比较低，流速慢。称为软胶。
Sepharose 与1，3-二溴异丙醇在强碱条件下反应后，即形成CL型交联琼脂 糖。其筛孔与同浓度的、未交联的琼脂糖相同，但热稳定性和化学稳定性 都有了提高。 琼脂糖凝胶的最大优点是对生物大分子非特异性的吸附最小，回收率高。
它是以甲撑双丙烯酰胺做交联剂，以过硫酸铵为催化剂，在N,N,N`,N`四甲基乙二胺（TEMED）加速剂的作用下，将丙烯酰胺（单体）聚合而 成。当单体浓度改变时，可得到吸水率不同的产物。
产品型号： Bio-gel P-2到P-300，数字相当于排阻限度的1000分之一。 通常聚丙烯酰胺凝胶为珠状颗粒，并以干胶形式出售，使用前必须溶涨。
2014-8-1
Free template from
7
A：Vt-Vo的值太小，洗脱峰便拥挤在一起，不容易分离 B：通过增加Vt来提高分辨率 C：柱床体积不变，减少上样量 D：减少Vo，减少粒径范围 Vt≈ Vo+Vi Vo→Kd=0，选用兰色葡聚糖2000（分子量200万），呈兰色，在各种型号的 凝胶中都被完全排阻。 Vi →Kd=1，选用硫酸铵等与凝胶无吸附力的小分子物质。
凝胶过滤层析法
第12页/共82页
Sephadex经改性后比其母体具有更广泛的用途，适用于脂类、甾类、脂肪酸、激素、维生素及其他小分子的分级分离。
10
15-20
72
5
150
5000-400000
1000-150000
15
20-30
72
5
200
5000-800000
1000-200000
20
30-40
72
5
第10页/共82页
Sephadex的型号及性能
第11页/共82页
3、主要用途：孔径较小的凝胶主要用于脱盐、肽与其他小分子的分离；孔径较大的凝胶用于蛋白质与其他大分子的分离。DNA级的Sephadex适用于DNA或低聚核苷酸的分离。
峰宽：峰的基线宽度，通过层析峰两侧拐点作切线交于基线上的距离。
标准差：样品组分被带出层析柱的分散度，用σ表示。两侧拐点之间的距离为2个标准差。
Wb=4 σ=1.699W1/2
W1/2=2.354 σ
第46页/共82页
保留值：表示样品中各组分在层析柱中停留时间的长短或组分流出时所需流动相体积的大小。
第26页/共82页
第27页/共82页
Sephacryl系列产品性能
第28页/共82页
(五)、Superdex系列产品 是最新的凝胶过滤介质，属BioProcess介质中的一种。是将葡聚糖以共价键方式结合到高交联的多孔琼脂糖珠体上形成的复合凝胶。是将交联葡聚糖优良的过滤选择性及高交联的琼脂糖的物理化学稳定性集于一身的具有优良选择性和高分辨率的产品。可在0.1mol/LHCl或1mol/LNaOH溶液中40℃处理400小时而分辨率保持不变。
提高凝胶过滤层析的分辨率的方法概述
提高凝胶过滤层析分辨率的方法概述摘要：凝胶过滤层析的分辨率高低关系到最后的样品纯度，提高分辨率可得到纯度更高的产物。
分辨率的高低与凝胶柱的选择、凝胶的种类、加样量、流速和洗脱液性质有关，在实验过程中，根据目的和要求综合考虑各因素。
【关键词】凝胶过滤层析；分辨率；流速Abstract：The sample purity is related to the resolution of the Gel filtration chromatography.Thus, to obtain a higher purity product, we need to improve the resolution. the selection of the gel column, the type of gel, the amount of pipetting, flow rate can effect the resolution. Consideration of various factors, during the experiment, according to the purpose and requirements.【Key words】Gel filtration chromatography; resolution; flow rate引言凝胶过滤层析法(gel filtration chromatography)也称分子筛层析法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的分子量进行分离和纯化1959年，Porath和Flodin第一次用凝胶过滤分离水溶液中不同分子量的样品。
凝胶凝胶过滤层析具有设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点，因此广泛用于蛋白质(包括酶)、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。
因此，凝胶层析广泛的应用于生物化学、高分子化学等方面。
凝胶层析法测定蛋白质分子量
凝胶层析法测定蛋白质的分子质量【实验原理】凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶的分子筛作用把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又称为分子筛层析法（molecular sieve chromatography），排阻层析法（exclusion chromatography）。
凝胶本身是一种分子筛，可以把分子按不同大小进行分离，好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。
但这种“过筛”与普通的过筛不一样。
将凝胶颗粒在适宜的溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物，再以同一溶剂洗脱。
在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。
凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。
凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose）；人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel-P）和葡聚糖（dextran）凝胶（商品名称为Sephadex）的各种交联凝胶，它们是具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。
这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与分离物质分子的大小有相应的数量级。
在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。
相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。
利用这种性质可分离不同M r的物质。
为了说明凝胶层析的原理，将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以V t(total volume)表示。
实际上V t是由V O，V t与V g三部分组成，：V t=V O+V t+V gV o称为“孔隙体积”或“外体积”（outer volume）又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相当于一般层析法中柱内流动相的体积；V i为内体积（inner volume），又称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，相当于一般层析法中的固定相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得；V g为凝胶本身的体积，因此V t-V o.等于V i+V g。
考研《生物化学》—名词解释
考研《生物化学》—名词解释考研《生物化学》—名词解释氨基酸（amino acids）:是含有一个碱性氨基和一个酸性羧基的有机化合物，氨基一般连接在α-碳上。
氨基酸是肽和蛋白质的构件分子。
必需氨基酸（essential amino acids）：指人（或其它脊椎动物）自己不能合成，需要从饮食中获得的氨基酸，例如赖氨酸、苏氨酸等氨基酸。
非必需氨基酸（nonessential amino acids）：指人（或其它脊椎动物）自己能由简单的前体合成的，不需要由饮食供给的氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸等氨基酸。
等电点（pI，isoelectric point）：使分子处于兼性分子状态，在电场中不迁移（分子的净电荷为零）的pH值。
茚三酮反应（ninhydrin reaction）：在加热条件下，氨基酸或肽与茚三酮反应生成紫色（与脯氨酸反应生成黄色）化合物的反应。
肽键（peptide bond）：一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基缩合，除去一分子水形成的酰胺键。
肽（peptides）：两个或两个以上氨基酸通过肽键共价连接形成的聚合物。
蛋白质一级结构(primary structure)：指蛋白质中共价连接的氨基酸残基的排列顺序。
层析(chromatography)：按照在移动相（可以是气体或液体）和固定相（可以是液体或固体）之间的分配比例将混合成分分开的技术。
离子交换层析(ion-exchange column chromatography)：使用带有固定的带电基团的聚合树脂或凝胶层析柱分离离子化合物的层析方法。
透析（dialysis）：通过小分子经半透膜扩散到水（或缓冲液）的原理将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。
凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)：也叫做分子排阻层析（molecular-exclusion chromatography）。
一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。
凝胶过滤色谱法
凝胶过滤色谱法
凝胶过滤色谱法（Gel Filtration Chromatography），也被称为分子筛色谱或凝胶渗透色谱，是一种常用的生物分离和纯化技术。
它基于样品分子在凝胶填料中的分子尺寸差异来实现分离。
工作原理是通过在色谱柱中填充具有特定孔径大小的凝胶填料，较大的分子在凝胶中较快通过孔隙，而较小的分子由于进入填料内部的孔隙较多而较慢通过。
因此，分子的分离程度取决于其尺寸，大分子被排除在凝胶颗粒外部，较小分子则更容易渗透到凝胶颗粒内部。
凝胶过滤色谱法通常用于分离和纯化蛋白质、多肽、核酸等生物大分子。
它可以去除小分子杂质，同时可以根据分子大小分离具有不同尺寸的目标分子。
该方法操作简单，无需特殊的溶剂，对生物大分子具有较好的保护性，不会对其结构和活性产生显著影响。
在凝胶过滤色谱法中，填料的孔径大小是一个重要的参数，需要根据目标分子的分子量范围选择适当的凝胶填料。
常用的填料包括琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等，它们具有不同的孔径范围，可满足不同分子大小的分离需求。
凝胶过滤层析gelfiltrationchromatography
凝胶过滤层析gel filtration chromatogra phy定义凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。
凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。
利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用, 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻层析（size 层析（size exclusion chromatography）、分子筛chromatography）、分子筛层析（Molecular 层析（Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗Chromatography）、凝胶渗透层析（Gel 透层析（Gel Permeation Chromatography）Chromatography）应用凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。
分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。
利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、去热源和脱色。
进行脱盐、去热源和脱色。
原理凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。
小分子进入当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子葡聚糖珠内质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱；相对分子质量较小的物质可自由地进相对分子质量较小的物质可自由地进大分子不出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移能进入珠内，经珠动速率慢而最后流出层析柱。
之间缝隙中等大小的分子在大分子物质与小分中等大小的分子在大分子物质与小分流出子物质之间被洗脱。
这样，经过层析柱，混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。
带网孔的葡聚糖珠固定相（凝胶）固定相（凝胶）三维空间网状结构小分子样品流动相大分子分子筛效应：分子筛效应：按分子大小不同, 按分子大小不同,在凝胶受到的阻滞作用有差异有差异, 阻滞作用有差异,从而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。
凝胶过滤层析的基本操作
凝胶过滤层析的基本操作凝胶过滤层析（gel filtration chromatography）是一种广泛应用于生物科学和化学研究中的蛋白质和其他大分子化合物的纯化和分离技术。
它利用凝胶过滤基质，通过分子的大小、形状和电荷等物理性质的差异，将待分离物分离出来。
下面将详细介绍凝胶过滤层析的基本操作步骤。
1.准备工作（1）选择合适的凝胶基质：根据待分离物的分子量范围选择合适的凝胶基质，如分子筛、琼脂糖、琼脂糖-琼脂糖6等。
常用的凝胶基质有不同的孔径大小，可以根据待分离物的分子量范围选择合适的孔径大小。
（2）根据凝胶基质使用说明进行膨胀：将干燥的凝胶基质用适当的缓冲液（如PBS）溶解，并在4°C下放置一段时间使凝胶膨胀成固定的形状。
2.样品处理（1）将待分离物样品稀释至合适的浓度：样品浓度过高可能会导致凝胶基质的饱和和堵塞，因此需要根据实验要求和待分离物的特性合理调整样品的浓度。
（2）加入适当的缓冲液：为了保持待分离物的生物活性和稳定性，需要在样品中加入适当的缓冲液，如PBS、Tris-HCl等。
3.装填柱子（1）将膨胀好的凝胶基质均匀地填充到层析柱中：可以使用手动装填或压力装填的方法将膨胀好的凝胶基质均匀地填充到层析柱中。
填充时需要轻轻振动层析柱，以排除气泡并获得均匀的填充。
（2）用缓冲液预洗柱子：用适当的缓冲液预洗填充好的层析柱，以去除杂质和预平衡凝胶基质。
4.样品加载和洗脱（1）注射样品：将处理好的样品缓慢地注射到已经平衡的层析柱上。
为了保持柱子的稳定性和样品分离的准确性，需要控制好注射的速度和量。
（2）收集分离的组分：将通过凝胶过滤层析分离的组分逐一收集，可以根据样品分离和实验要求，设置适当的收集管。
5.数据分析（1）测定峰值分离量：可以通过对收集的每个分离组分进行浓度测定，然后计算分离量和回收率。
通过浓度测定可以得到每个分离组分的峰值浓度。
（2）分子量估算：可以将已知分子量的标准品（如蛋白质标准品）以及待分离物的峰值分离量和峰值位置进行对比，从而估算待分离物的分子量。
GE公司的葡聚糖凝胶填料LH-20的使用说明
equilibration
sample injection volume
wash
5–10 CV
5–10 CV
non-bound molecules elute before
gradient begins
gradient elution
10–20 CV
salt-free elution buffer
2–5 CV
Highly hydrophobic proteins bind tightly to highly hydrophobic ligands. Screen several hydrophobic media. Begin with a medium of low hydrophobicity if the sample has very hydrophobic components. Select the medium which gives the best resolution and loading capacity at a low salt concentration.
Weak ion exchangers DEAE and ANX (anion exchange) and CM (cation exchange): fully charged over a narrower pH range (pH 2 to 9 and pH 6 to 10, respectively), but give alternative selectivities for separations.
Choice of ion exchanger Begin with a strong exchanger, to allow work over a broad pH range during method development .
凝胶分离法
观察凝胶与水分层, 此间不能使胶面干掉。
注：如床表面不平整，可在凝胶表面用玻璃棒轻轻 搅动，再让凝胶自然沉降，使床面平整。
③调节流速：调节凝胶床所能承受的最大水压，
使出口流速7-8d/min。
3、加 样、洗脱、收集
①.放水： 将出口打开，使床面上的蒸馏水缓慢下流， 达到床面将近露出为止，关紧出口。 （注意：不可使床面干掉，以免气泡进入凝胶）
交联葡聚糖凝胶（Sephadex）
• 葡聚糖和3-氯-1，2环氧丙烷以醚键相互交联形成。
• 按交联度大小分8种型号，G值代表不同交联度。
• Sephadex G-10，15，25，50，75，100，150，200
• 数字表示每克干胶膨胀时吸水量的10倍。 Sephadex
G-25代表每克干胶膨胀时可以吸水2.5克。
②加样：用吸管吸取0.5ml脲酶粗提取液，缓慢地沿着 层析柱内壁加于床表面 注意：尽量不使床面扰动
③洗脱、收集：接上贮液瓶，进行洗脱，流出的液体分别 收集在小离心管中， 流速：7- 8d/分钟， 收集量：为3ml/管 (先用一支刻度离心管, 后可根据高度用普通管) 数量：共收集约8-9管（澄清后在收集1-2管） 注意：必须保持床面平整，而且不能干，随时加蒸馏水。
实验2
脲酶的凝胶过滤 分离纯化
实验 原理
脲酶分子量较大，脲酶粗制品通过交 联葡聚糖Senhadex G－150层析柱 酶本身不能进入凝胶颗粒的网络内， 而其他小分子物质及分子量较小的蛋白质可 扩散进入凝胶颗粒。
用蒸馏水作为洗脱剂，分子量大的脲酶 首先被洗脱下来，从而达到与其他物质分离 的目的。
0.1ml 2.9ml 2滴
充分混匀
Nessler试剂 0.75ml 0.75ml 0.75ml
胶体过滤法(Gel filtration)蛋白质纯化
胶体过滤法（Gel filtration）蛋白质纯化一、仪器设备：1.色析管柱（Pharmacia C column, 1.6×100 cm）、铁架、铁夹及水平仪；2.分划收集器（fraction collector, 需准备干净试管约100 支）；3.浓缩用离心机（低速5,000 rpm）；4.浓缩用离心管Centriprep-30 （Amicon 4322）。
二、药品试剂：1.胶体Sephacryl S-300 （Pharmacia）：（1）预先以缓冲液buffer A-150 平衡好，并且使完全沈降后的胶体体积，占全部体积的七至八成；要先预估好胶体的使用量。
（2）胶体温度要与操作场所的温度一致，否则温度变化会产生气泡。
（3）Sephacryl 系列胶体有相当大的吸附力，因此要在缓冲液加入0.15 M 以上的NaCl 以除去非专一性吸附。
2.Buffer A-150：注意使用时的温度要与管柱胶体的温度一致。
3.标准分子量组合（Bio-Rad 151-1901）：溶于1 mL 后每组取0.4 mL。
含有thyroglobulin （670 kD）， bovine gamma globulin （158 k D）， chicken ovalbumin （44 kD）， equine myoglobin （17 k D）， vitamin B12 （1,350kD）。
三、方法步骤：1.管柱装填：（1）以纯水冲洗玻璃管柱（以纯水上下冲洗即可，严禁使用试管刷）；并了解管柱的构造与拆装方法，垂直架好管柱，以软管连接分划收集器，并以 bufferA-150 试看管路是否通畅；可以用止血钳或长尾文书夹夹住出口软管，则可控制溶离的进行。
注意系统的摆设要适当，不要装置于交通要冲。
（2）依预估量取出Sephacryl 胶体，注意胶体的温度与缓冲液是否一致；将瓶中的胶体上下震荡，使其完全悬浮，但勿产生太多气泡。
凝胶渗透色谱仪的工作原理
凝胶渗透色谱仪的工作原理
凝胶渗透色谱仪（Gel Permeation Chromatography，GPC），
又称为凝胶过滤色谱（Gel Filtration Chromatography，GFC），是一种分离物质的方法，常用于分离高分子化合物。
其工作原理如下：
1. 样品准备：将待分离的高分子样品溶解在适当的溶剂中，并过滤除去杂质。
2. 注射样品：将样品溶液注入色谱柱的样品区域。
3. 进样和洗脱：样品溶液通过柱中的凝胶填充物，填充物一般是具有可控孔径大小的凝胶颗粒。
大分子物质无法进入凝胶颗粒的内部，只能绕过颗粒，从而通过色谱柱较快地洗脱；而小分子物质则能够进入凝胶颗粒的内部，因此洗脱时间较长。
4. Elution曲线：通过检测溶液的吸光度或浓度，并绘制出洗
脱时吸光度/浓度与时间的曲线（即elution曲线），从而得到
不同分子量组分的相对排列顺序。
5. 分析和结果解释：根据elution曲线，可以得到样品中不同
分子量组分的峰值，并通过比较峰值位置和峰值面积来确定样品中的不同分子量成分。
总之，凝胶渗透色谱仪通过利用凝胶颗粒的孔径分布，将样品中的分子按照大小分离，从而实现对高分子物质的分析。
biorad gel filtration standard 凝胶过滤层析标准 hanliang
Biorad凝胶过滤层析标准是一种用于生物分子分离和纯化的常用工具。
Hanliang作为一名研究人员对此有着浓厚的兴趣，因此我将在本篇文章中，按照Hanliang的要求，对Biorad凝胶过滤层析标准进行全面评估和深入探讨，并撰写一篇有价值的中文文章。
1. Biorad凝胶过滤层析标准的基本概念Biorad凝胶过滤层析标准是一种用于分离生物大分子的方法，它基于分子在凝胶颗粒中的截留和渗透的原理，通过不同大小的分子在凝胶中的渗透速率不同来实现生物大分子的分离和纯化。
凝胶过滤层析标准的选择对于研究人员在生物大分子分离和纯化过程中起着至关重要的作用。
2. Biorad凝胶过滤层析标准的应用领域Biorad凝胶过滤层析标准广泛应用于生命科学领域，包括但不限于蛋白质纯化、核酸分离、细胞组分的纯化等。
在生物医药研究以及生物工程领域，Biorad凝胶过滤层析标准也发挥着重要的作用。
3. Biorad凝胶过滤层析标准的优势与局限性Biorad凝胶过滤层析标准具有高分辨率、高效率、易操作、可扩展性强等优点，但是在一些特定的情况下也存在一些局限性，比如对于极小分子的分离可能效果不佳。
4. 我对Biorad凝胶过滤层析标准的观点在我看来，Biorad凝胶过滤层析标准在生物大分子分离和纯化方面有着很大的应用前景，但是在实际应用中也需要根据具体的情况进行选择和优化。
我也希望未来能够有更多的研究工作能够针对Biorad凝胶过滤层析标准的局限性进行改进和优化。
总结回顾通过本篇文章的撰写，我对Biorad凝胶过滤层析标准有了更深入的了解。
我清楚地认识到了其在生物大分子分离和纯化中的重要作用，也认识到了其在具体应用中的一些局限性。
希望通过不断地学习和探索，能够更好地应用Biorad凝胶过滤层析标准，推动生命科学领域的发展。
总字数：3662在这篇文章中，我按照Hanliang的要求，对Biorad凝胶过滤层析标准进行了全面评估和深入探讨，并撰写了一篇有价值的中文文章。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Vr
Volume of the gel matrix Vs
Vo
Vt
Pore volume Vi
Vcห้องสมุดไป่ตู้
1 2 3
GF v03 Aug 2000
27
The void volume Vo
Elution volume for very large molecules, Vo
•Unexpected results and what to do about them
GF v03 Aug 2000
2
What is gel filtration?
Gel filtration is a technique of liquid chromatography which separates molecules according to their sizes.
Gel structure
A good gel for gel filtration contains about
95% water
AGAROSE
GF v03 Aug 2000
22
Gel structure
Agarose
Dextran
A hypothetical structure for Superdex
Limited Poor
sample volume
gentle, high yields
in any buffer solution dimers and by size
Works
selectivity compared with SDS-PAGE
Removes
aggregates
Separates
Column: Buffer: System:
0
GF v03 Aug 2000
1
min
8
Buffer exchange using HiPrep 26/10 Desalting column
Sample: Column: Buffer: System: BSA dissolved in 50 mM piperazine, 0.5 M sodium chloride, pH 6.2 HiPrep 26/10 Desalting 20 mM sodium phosphate, 0.15 M sodium chloride, pH 7.0 ÄKTAprime, 20 ml/min
14
Estimating molecular size
Measure elution position
Calculate molecular size
GF v03 Aug 2000
15
Why choose gel filtration?
Pros
Fastest Very
Cons for buffer exchange
GF v03 Aug 2000
5
Desalting proteins
Highly efficient desalting in less than 1 minute
10
20
30
40
50 sec
GF v03 Aug 2000
6
Desalting proteins
Desalting in a simple column
Dimer Oligomer VO
GF v03 Aug 2000
10
20
VC
Time (min)
13
Characterisation: Size homogeneity
mAU %B 100 1200 1000 800 600 400 200 0 0 50 100 150 ml 20 0
8
8
80 60 40
GF v03 Aug 2000
11
Enzyme purification - SDS-PAGE analysis
M 1 2 3 4 M
67k 43k 30k
M 1 2 3 4
- LMW markers - Start material - Pool from ion exchange - Pool from HIC - Pool from Superdex 75 pg
•Group separations: Desalting, Buffer exchange, Removing reagents •Purification of proteins and peptides: complex samples, monomer/dimer •Estimation size & size homogeneity
GF v03 Aug 2000
16
Use in group separations
Adjusting pH, buffer type, salt concentration during sample preparation, e.g. before an assay.
Removing interfering small molecules, e.g. EDTA, Gu.HCl Removing small reagent molecules, e.g. fluorescent labels, radioactive markers. But not when the protein will precipitate
Gel Filtration
GF v03 Aug 2000
1
Gel filtration
•What is gel filtration and why use it? •Some typical results •Why and when to choose gel filtration •Model of the mechanism •How to get the expected results
GF v03 Aug 2000
9
Purification of recombinant IGF-1
AU280
0.1
0.05
IGF-1
Column: HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade Sample: IGF-1, ZZ fusion protein and uncleaved material Buffer: 0.15 ammonium acetate, pH 6.0 Flow rate: 0.75 ml/min (22.5 cm/h)
18
GF v03 Aug 2000
Use for size estimation
'Free' information Gives an estimate of molecular size in any practically any solution Precision is not so good
• Gel permeation chromatography
(Moore, 1964)
GF v03 Aug 2000
20
Separation mechanism
Qualitative model • Gel structure • Steric exclusion
GF v03 Aug 2000
21
1
2
Time (h)
GF v03 Aug 2000
10
Purification of recombinant phosphatase
Sample: Column: Buffer: System: 4 ml concentrated eluate from a HIC run containing rPhosphatase HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade 25 mM Tris-HCl, 0.3 M sodium chloride, 1 mM EDTA, 2 mM DTT, pH 7.4 ÄKTAprime, 0.5 ml/min (15 cm/h)
12
Separating dimer and oligomers from monomer
A
280 nm
Monomer
0.05
Column: Superdex 75 HR 10/30 Sample: A special preparation of rhGH in distilled water
0.025
mAU 11.84 10
Mr 160 000
mS/cm 60
mAU 11.94 10 mS/cm 60
6 40 4
6 40 4
HiTrap Chelating 5 ml
2 20 0 0 5 10 15 20 ml
2 20 0 0 5 10 15 20 ml
Superdex 200 HR 10/30
GF v03 Aug 2000
Vo= Void volume Vr = Elution volume within the separation range of the gel Vi = Inner pore volume = Vc - Vs - Vo Vc = Total (geometric) volume of the column
GF v03 Aug 2000
3
Gel filtration in the lab
•Simple to do •Easy to understand
•Nothing to go wrong
GF v03 Aug 2000
4
Why use gel filtration?
Some typical results