革兰氏染色1
革兰氏染色(1)
菌种鉴定
菌种获取
分离鉴定 保存复壮 革 兰 பைடு நூலகம் 染 色
Gram与革兰氏染色：
革兰氏染色法（Gram stain）是细菌学中广泛使用 的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师、细菌学家Hans Christain Gram创立并以其名字命名的。 Gram在对死于 肺炎的患者肺部组织进行检查时发现某些细菌对特定的染 料有很高的亲和力。他的染色方法是：首先采用苯胺-结 晶紫染液进行初然，然后用卢戈式碘液媒染，最后用乙醇 脱色。经过这样的染色后，发现肺炎球菌保持蓝紫色，肺 部组织背景为浅黄色，达到了将细菌与被感染的肺部组织 区分开的目的。几年以后，德国病理学家Carl weigert （1845-1904）在Gram染色方法基础上加上番红复染， 使其成为微生物学研究领域最常用的染色方法之一。
染色结果
革兰氏阳性菌都呈紫色，革兰氏阴性菌都呈红色。 其中变形杆菌被染成红色为阴性菌，四联球菌被染成紫 色为阳性菌。
变 形 杆 菌
四 联 球 菌
在实验中经常会出现假阳性和假阴性的结果
影响实验成功的因素：
涂片过厚 结晶紫染色过度 导致脱色不完全 （假阳性）
细胞固定过度 细胞培养 时间太长
造成细胞壁通透性的改变 （假阴性）
因此，在实验过程中应注意：
• 选择活跃生长期菌种染色
• 涂片不宜过厚
• 染色及脱色时间得当
实验报告
1》结果
（1）绘出油镜下观察的图像 （2）填表
菌名 大肠杆菌 四联球菌 菌体颜色 细菌形态 结果（G+ G- ）
思考题：
现有一株未知菌，个体明显大于大肠杆菌 请你鉴定该菌是革兰氏阳性还是革兰氏阴 性，如何确定你的染色结果的正确性？
《革兰氏染色》课件
该方法基于细菌细胞壁的构造和成分 差异，通过染色剂对细菌细胞壁的吸 附和渗透作用，显示出不同的颜色， 从而进行鉴别。
革兰氏染色中使用的试剂及其作用
结晶紫
用于初步染色，能与细 胞壁结合，形成不溶性
复合物。
碘液
用于加强结晶紫与细胞 壁的结合，使染色更明
显。
酒精
脱色剂，去除染料与细 胞壁结合的复合物，使
染色
结晶紫染色
将结晶紫染液滴加在载玻片上，覆盖 菌体，染色1-2分钟。
冲洗
用吸水纸吸去多余染液，用清水轻轻 冲洗载玻片，洗去未结合的染料。
水洗和脱色
水洗
用流水冲洗载玻片，洗去未结合的染料。
脱色
将载玻片放入脱色液中染液滴加在载玻片上，覆盖菌体，复染1-2分钟。
色或粉红色。
03
革兰氏染色的操作步骤
涂片
涂片
将待染色的菌体轻轻涂布在载玻 片上，确保菌体均匀分布。
干燥
将涂有菌体的载玻片放在室温下 自然干燥，避免强烈气流或直接 阳光照射。
固定
火焰固定
通过短时间轻触载玻片边缘，用火焰迅速固定菌体，使其与载玻片粘附。
冷却
将固定后的载玻片放在干净的桌面上自然冷却。
染色时间
染色时间过长或过短都会影响 染色效果和观察结果。
脱色时间
脱色时间过长或过短都会影响 染色效果和观察结果。
染色方法
不同的染色方法可能会影响染 色效果和观察结果。
05
革兰氏染色的应用和意 义
在医学诊断中的应用
01
鉴别细菌种类
革兰氏染色是鉴别细菌种类的重要方法之一，通过染色结果的不同可以
将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类，有助于医生对感染进
革兰氏染色名词解释
革兰氏染色名词解释
革兰氏染色是一种针对微生物的染色法，由彼得·革兰（Paul Ehrlich）于1883年发明。
它的主要原理是利用染料的化学色素物质在微生物细胞表皮上形成不同的染料沉积，从而使微生物细胞得到彩色，以此来对微生物进行分类和分析。
革兰氏染色法与其它染色方法相比有三大优势：1.可实现多种不同样式的染色，它可以在一次染色中实现多种染色方式，如单色、双色、三色染色等；2.染色效果很好，革兰氏染色能够将微生物细胞表面染得很彩艳，即使在低倍镜下也非常清晰，能更好的反映微生物的特征；3.染色速度快，革兰氏染色的染色速度比传统的染色方法快几倍，可以在几分钟内完成一次染色。
革兰氏染色是生物学实验中采用最多的染色方法之一，它的法则和技巧都相当成熟，应用范围也广泛。
革兰氏染色技术广泛应用于细菌生理学、药物耐药性研究、病原鉴定、细菌分类学研究以及细胞学研究等多个研究领域，它也被用于食品行业、环境污染检测、放射性检测、肿瘤检测等多个领域。
实验一 细菌的革兰氏染色
实验一细菌的革兰氏染色实验一细菌的革兰氏染色实验一_细菌的革兰氏染色实验一细菌的革兰氏染色生物科学贺冰冰[1**********]5周二9、0节1自学显微镜油镜的采用方法2学习微生物的无菌操作技术3自学细菌的革兰氏染色法1显微镜及油镜物镜的使用原理1)油镜头的标志油镜头上常刻有oi或hi字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记。
在低倍物镜、高被物镜和油镜3种物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径最大，而工作距离最短。
2)显微镜的分辨率显微镜性能主要就是看看它的分辨率的大小，然后看看它的总压缩倍数。
分瓣率是所指显微镜能够辨别出来物体两点间最轻距离（d）的能力。
d值愈小说明分辨率愈低。
d值与光线的波长（λ）成正比，与物镜的数值孔径（na）成反比：d=λ/2na2细菌的革兰氏染色原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家c.gram创立的。
作为细菌学上最常用最重要的鉴别染色法。
革兰氏染色的基本步骤就是：先用初染剂结晶紫展开染色，再用碘液媒染，然后用乙醇脱色，最后里韦县染剂番红复染。
革兰氏染色法可以将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（g+）和革兰氏阴性菌（g－）两大类.g－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。
g+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。
1菌种：培育24h的枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆营养琼脂菌斜面培育物。
2染色液和试剂：生理盐水、草酸铵结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红为丛藓科扭口藓染液,香柏油，显微镜冲洗液.3器材：酒精灯、接种环、镊子、载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、试管夹、显微镜等。
1涂片:挑一整洁载玻片,中央几滴一小几滴生理盐水,无菌操作取菌无菌操作(快):在酒精灯上灼烧接种环(注意手势)---松动试管帽---取下试管帽---灼烧管口---在火焰旁接种环通过火焰进入菌种管---接种环在管壁冷却---挑取菌少许---退出---灼烧管口---盖帽---涂片(调匀涂成薄膜)---灼烧接种环.2潮湿:室温自然肥干活3固定:手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）.4染色:初染(加草酸铵结晶紫一滴,约一分钟,自来水水洗)---媒染(加碘液冲回去残水,并全面覆盖一分钟,水洗)---脱色(将水打翻净,方体白背景,用95%酒精几滴洗至流入的酒精不发生紫色时年才,约20-30秒,立即用水冲净酒精)---复染(用蕃红液染2-3分钟,水洗)5干燥:室温凉干或吹风机吹干6镜检:先低倍观测，再高倍观测，并找到适度的视野后，将高倍镜办理手续，在涂片上有香柏油，油观测细菌的形态。
3[1].革兰氏染色
![3[1].革兰氏染色](https://img.taocdn.com/s3/m/60cbc19f85868762caaedd3383c4bb4cf7ecb79b.png)
球消菌化链: 球菌属
革兰阴性
球伟菌荣球: 菌属 杆类梭普卟菌杆菌氏啉菌属菌单: 属属胞菌属
形态学鉴别要诀——球菌
革兰阴性双球菌——肾型豆子样，平 行纵轴排列=奈瑟菌属
革兰阳性双球菌——拉长，单个纵轴 ，末端呈点状（柳叶刀状）=链球菌 （肺炎链球菌）
实际革兰氏染色
革兰阳性双球菌提示肺炎链球菌
革兰阴性双球菌：在生殖道标本或脑脊液中多为奈瑟菌属；在下呼吸道分泌 物中提示为卡他莫拉菌
血培养中长链的革兰阳性球菌（>6个 细胞）提示化脓链球菌或草绿色链球 菌
更多的革兰氏染色形态学
呈堆或四 联排列的 革兰阳性 球菌提示 葡萄球菌
革兰阳性杆菌的形态学鉴别要诀
革兰氏阳性杆菌可以很规则，如果是需氧菌则非常可能 是芽胞杆菌属，如果是厌氧则非常可能是梭菌属。如果 很小，可能是不呈链状的李斯特菌属，如果呈链状则很 可能是乳酸杆菌属。
3. 粘稠的或脓性的液体
• 如血涂片那样涂片
革兰氏染色的玻片
错误 正确
液体使用离甩片心机
脱色
1. 尽可能除去多余的水。 2. 水池中需要有轻柔流动的流水。 3. 在光亮的背景下观察玻片。 4. 玻片平放时滴加脱色剂。 5. 轻柔晃动玻片的两边，使得结晶紫来回地流动。 6. 当停止流动后立刻将玻片用流水清洗以停止脱色。
性粒细胞减少
酵母菌样，酵母菌是一种很 少引起肺炎的细菌，常 由口腔污染
评述
可以在玻片上看到许多鳞状上皮细胞，说明在采集时受到 了上呼吸道分泌物的污染或口水的污染。
中性粒细胞和上皮细胞都很少的标本需要培养
吸入性肺炎标本革兰氏染色的典型形式，培养只会培养出 正常菌群，所以革兰氏染色是用于诊断的方法。
成双的革兰氏阳性球菌，短链=肺炎链球菌 革兰氏阳性菌成群排列=金黄色葡萄球菌 革兰氏阴性求杆菌（小）=流感嗜血杆菌 革兰氏阴性杆菌大且肥厚=肺炎克雷伯菌或其他肠道菌 革兰氏阴性双球菌=卡他莫拉菌
实验1-细菌的革兰氏染色
环境微生物学实验(参见课本P388-392)实验1 细菌的革兰氏染色一.实验目的(1)了解细菌的涂片和染色在微生物学试验中的重要性。
(2)掌握革兰氏染色法的基本操作技术。
二.实验材料(1)器皿：显微镜、接种环、载玻片、酒精灯。
(2)试剂：草酸铵结晶紫染液、革兰氏碘液、95%乙醇、5g/L沙皇染色液。
(3)材料：常见菌种。
三.实验内容各种细菌经革兰氏染色法染色后，能区分成两大类，一类最终染成紫色，称革兰氏阳性细菌（Gram positive bacteria,G+）；另一类被染成红色，称革兰氏阴性细菌（Gram negative bacteria,G-）。
其过程如下：(1)涂片、固定(干燥)取干净的载玻片于试验台上，在正面边角作几号，并滴一滴无菌蒸馏水于载玻片的中央，灼烧接种环，待冷却后从斜面挑取少量菌种与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过多。
干燥过程最好在空气中自然晾干，为了加速干燥，也可在微小火焰上方烘干。
烘干后再在火焰上方快速通过3~4次，使菌体完全固定在载玻片上。
但不宜在高温下长时间烤干，否则急速失水会使菌体变形。
(2)初染滴加草酸铵结晶紫染色液1―2min,水洗。
(3)媒染滴加革兰氏碘液，染1-2min,水洗。
(4)脱色滴加体积分数为95%的乙醇，约45s后即水洗；或滴加体积分数为95%的乙醇后将玻片摇晃几下即倾去乙醇，如此重复2-3次后即水洗。
(5)复染滴加沙黄液（番红），染2-3min,水洗并使之干燥。
(6)镜检按显微镜的操作步骤观察菌体形态，及时记录。
根据呈现的颜色判断该菌属是G+还是G-细菌。
观察时先用低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察。
四.注意事项（1）涂片所用载玻片要洁净无油污迹，否则影响涂片。
（2）挑菌量应少些，涂片宜薄，过厚重叠的菌体则不易观察清楚。
（3）染色过程中勿使染色液干涸。
用水冲洗后，应甩去玻片上的残水以免染色液被稀释而影响染色效果。
（4）革兰氏染色成败的关键是脱色时间是否合适，如脱色过度，革兰氏阳性细菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性细菌。
7细菌的革兰氏染色 (1)
微生物实验报告细菌的革兰氏染色及形态观察一、目的要求：1、熟悉光学显微镜的使用方法。
2、掌握革兰氏染色法。
3、掌握大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的染色结果和形态特征二、器材和器皿：1、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌2、革兰氏染色液、香柏油、二甲苯3、显微镜、擦镜纸、酒精灯、载玻片、盖玻片、接种环等三、实验原理：革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram 创立。
未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别很小，在显微镜下极难观察。
染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。
革兰氏染色属复染法。
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。
G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。
G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色，呈现蓝紫色。
四、实验步骤：1、取载玻片用纱布擦干，涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。
2、涂片：液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。
固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。
3、晾干：让涂片在空气中自然干燥。
4、固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。
5、染色：在菌膜上滴加草酸铵结晶紫液，染1min。
6、水洗：用蒸馏水轻轻冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。
简单染色结束可观察细胞形态。
革兰氏染色名词解释
革兰氏染色名词解释革兰氏染色（Gram staining）是一种常用的细菌鉴定和分类方法，由丹麦细菌学家克里斯蒂安·格拉默（Christian Gram）于1884年首次提出，并被广泛应用于临床微生物学和实验室研究中。
革兰氏染色的原理是通过对细菌细胞壁的染色特性进行区分。
细菌的细胞壁在结构上分为两种类型：革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
革兰氏阳性菌具有厚实的胞壁，其细胞壁主要由多聚肽和多糖组成，对革兰氏染色染料结构相对稳定。
而革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，含有一个内膜和一个较薄的胞壁，对革兰氏染色染料结构不稳定，容易被清洗脱色。
革兰氏染色方法通常由紫晶染液（crystal violet)、碘液（iodine）、酒精脱色液（ethyl alcohol）和洗净液（wash buffer）组成。
以下是革兰氏染色的步骤：1. 取一块无菌玻璃片，用手套或钳子夹住，然后在玻璃片上滴加一滴样本（可以是细菌培养物或分离纯培养的菌液），将细菌均匀涂抹于玻璃片上形成细菌涂片。
2. 将预先烘干的细菌涂片放置在静止的温和热环境中，使菌液完全固定在玻璃片上。
3. 将预热的紫晶染液倒在细菌涂片上，让染液覆盖整个细菌涂片，静置片上1分钟。
4. 倒掉多余的紫晶染液，用洗净液将染液冲干净。
5. 加一倍稀释的碘液在细菌涂片上，静置片上1分钟。
6. 倒掉多余的碘液，用洗净液将碘液冲洗干净。
7. 用酒精脱色液滴在细菌涂片上，进行制片人定时（通常为15-30秒），直到底色变得非常浅。
8. 倒掉酒精脱色液，用洗净液将细菌涂片冲干净。
9. 加入红粉溶液，让染料覆盖细菌涂片，静置片上1分钟。
10. 倒掉多余的红粉溶液，用洗净液将细菌涂片洗净，待片子晾干。
观察结果时，革兰氏阳性菌会呈现出紫色或蓝色，因为其细胞壁能够保留紫晶染料和碘复合物的结晶。
而革兰氏阴性菌则会呈现出红色或粉红色，因为其细胞壁无法保留紫晶染料和碘复合物的结晶，在酒精脱色过程中已经被去除。
革兰氏染色关键步骤
革兰氏染色关键步骤革兰氏染色是一种广泛应用于微生物学研究中的染色方法，通过染色使细菌分为革兰阳性和革兰阴性两类，这对于鉴定和分类细菌非常重要。
下面将详细介绍革兰氏染色的关键步骤。
一、准备工作1.1 培养基选择首先需要选择适合的培养基进行培养。
不同种类的细菌需要不同的培养基，例如大肠杆菌需要在LB培养基上生长。
1.2 细菌培养将选好的培养基加入试管中，接种适量的细菌，在恒温摇床上进行培养。
通常情况下，需要在24小时内达到足够数量的细菌。
二、制备干片2.1 净化玻璃片用肥皂水或其他清洁剂清洗玻璃片，并用去离子水冲洗干净。
然后用96%乙醇消毒玻璃片。
2.2 制备干片取出消毒好的玻璃片，在干燥无尘环境下放置至少30分钟。
然后用铅笔在玻璃片上标记编号。
三、染色步骤3.1 固定细菌将培养好的细菌取出，滴在制备好的玻璃片上。
然后用火焰将玻璃片加热，使细菌固定在玻璃片上。
3.2 染色将固定好的细菌涂上革兰紫染料，静置1分钟。
然后用去离子水冲洗干净。
3.3 醋酸洗涤将涂有革兰紫染料的细菌加入醋酸中浸泡30秒钟。
然后用去离子水冲洗干净。
3.4 染色再次涂上碘化钾溶液，静置1分钟。
然后用去离子水冲洗干净。
3.5 酒精洗涤将涂有碘化钾溶液的细菌加入95%乙醇中浸泡30秒钟，直到颜色变浅。
然后立即用去离子水冲洗干净。
3.6 洗涤和对比染色最后将细菌涂上对比染料（如苏丹红），静置1分钟。
然后用去离子水冲洗干净，并将玻璃片倒立在滤纸上晾干。
四、观察结果4.1 革兰阳性细菌革兰阳性细菌在染色后呈紫色或紫红色，因为它们的细胞壁含有大量的多糖和类脂质。
4.2 革兰阴性细菌革兰阴性细菌在染色后呈粉红色或红色，因为它们的细胞壁只含有一层较薄的多聚肽和脂质。
总结革兰氏染色是一种简单而有效的方法，用于鉴定和分类微生物。
通过以上步骤可以得到清晰可见的结果，从而为微生物学研究提供了重要依据。
环境微生物：革兰氏染色
二、革兰氏染色原理
为什么通过革兰氏染色G+呈兰色，G-呈红色？
①脱色剂----95%乙醇为脂溶剂破坏G﹣的外膜、肽聚 糖层和 细胞质膜，于是被乙醇溶解的结晶紫和碘的 复合物从细胞中渗漏出来，当再用藩红复染时，显 现红色。
②但在G+细胞中，乙醇使厚的肽聚糖层脱水，导致孔 隙变小， 由于结晶紫和碘的复合物分子较大，不能 通过细胞壁，保持紫色。
革兰氏染色
革兰氏染色步骤 革兰氏染色原理
革兰氏染色
革兰氏染色—由丹麦科学家 Gram在1884年建立，是细菌学上最 重要的鉴别染色法。通过革兰氏染 色法可将细菌分成革兰氏阳性菌和 革兰氏阴性菌两大类。
革兰氏染色
1884年，丹麦医生C.Gram发明 程序： （1）初染（结晶紫1-2min） （2）媒染剂（碘液1min） （3）脱色（95%乙醇20~30S） （4）复染（蕃红1 ~ 2min） 结果判断：菌体呈紫色的为革兰氏阳性菌（G+）
球菌
肺炎链球菌
杆菌
炭疽杆菌
破伤风杆菌
肉毒芽孢杆菌
杆菌
变形杆菌
大肠杆菌
绿脓杆菌
螺菌
幽门螺杆菌
霍乱弧菌
钩端螺旋体
感谢观看，欢 迎批评指正
菌体呈红色的为革兰氏阴性菌（G-）
一、革兰氏染色步骤
3.媒染— 碘-碘化钾 溶液浸湿
1min
4. 脱色—95%乙醇溶液 进行颜色洗脱30s
5.复呈现第一次染色的效果紫色，
革兰氏阳性菌（紫阳G+）；
• 呈现第二次染色的效果红色；称
革兰氏阴性菌（红阴G -）
革兰氏染色法
Ⅱ、革兰氏染色法一、实验原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C．Gram所创立的。
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。
革兰氏染色法的主要步骤是先用结晶紫进行初染；再加媒染剂--碘液，以增加染料与细胞间的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成分子量较大的复合物；然后用脱色剂(乙醇或丙酮)脱色；最后用蕃红复染。
凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色(紫色)者为革兰氏阳性菌，如被脱色后又染上复染剂的颜色(红色)者为革兰氏阴性菌。
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。
G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。
G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。
二、实验器材1、菌种牛肉膏琼脂斜面28℃培养24h的大肠杆菌(Escherichia coli)斜面菌种，牛肉膏琼脂斜面28℃培养16h的枯草杆菌(Bacillussubtilis)斜面菌种；2、仪器显微镜；3、材料载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，染色缸等。
4、染料草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液；三、操作步骤1、涂片在一张载玻片上加两滴蒸馏水后，分别涂布枯草芽孢杆菌和大肠杆菌(注意涂片切不可过于浓厚)。
2、固定将制成的涂片干燥固定，固定时通过火焰1-2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
3、染色⑴初染将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结晶紫染色液(加量以盖满菌膜为度)，染色1-2min。
倾去染色液，用自来水小心地冲洗。
⑵媒染滴加(Lugol)碘液，染1-2min，水洗。
革兰氏染色原理和结果
革兰氏染色原理和结果：1先用结晶紫染色，菌体呈紫色2再加碘液媒染，菌体呈紫色3然后用乙醇脱色，革兰氏阳细菌成紫色，阴性细菌无色4最后用番红复染，革兰氏阳性细菌呈紫色，革兰氏阴性细菌呈红色。
革兰氏染色结果与细胞壁组成有关，革兰氏阳性细胞壁较厚，肽聚糖含量较高，网络结构较密，含脂量又低，当他被酒精脱色时引起了细胞壁肽聚糖层网状结构的孔径缩小，从而阻止了不溶性结晶紫-碘复合物的逸出，故菌体呈紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁肽聚糖层较薄，含量低，而脂类含量高，当酒精脱色时，脂类物质溶解，细胞壁透性增大，结晶紫-碘复合物也随之被抽提出来，故革兰氏阴性细菌呈红色。
立克次体支原体衣原体病毒：立克次体是介于细菌与病毒之间，许多方面又类似于细菌专性活细胞内寄生的原核微生物类群。
支原体是介于细菌与立克次体之间又不具细胞壁的原核微生物衣原体是介于立克次体与病毒之间，能通过细菌滤器，专性活细胞内寄生的一类原核微生物病毒是一类具超显微的没有细胞结构的专性活细胞内寄生的实体，它们在活细胞外具有一般化学大分子特征，一旦进入宿主细胞又具有生命特征。
细菌放线菌属原核生物，细胞壁的主要成分是肽聚糖，脂多糖，酵母菌霉菌属真核生物，酵母菌细胞壁的主要成分是葡萄糖，甘露聚糖，霉菌细胞壁的主要成分是纤维素和几丁质，另有少量的蛋白质和脂类。
细菌菌落：一般呈现湿润、较光滑、较透明、较粘稠、易挑取、质地均匀以及菌落正反面或边缘与中央部位的颜色一致等。
放线菌与细菌有明显差别的菌落：干燥、不透明、表面呈致密的丝绒状，上有一层彩色的“干粉”；酵母菌：菌落与细菌相仿，呈现湿润、较透明，表面较光滑、易挑取、质地均匀以及菌落正反面或边缘与中央部位的颜色一致等特点。
霉菌：外观上很易辨认，形态较大，质地疏松，外观干燥，不透明，呈现或松或紧的蛛网状、绒毛状、棉絮状或毡状；噬菌体是侵染细菌放线菌等细胞型微生物的病毒。
根据噬菌体与宿主细胞的关系可分为烈性噬菌体和温和噬菌体两类。
细菌的简单染色(Simple stain)和革兰氏染色(Gram stain)(1
细菌的简单染色（Simple stain）和革兰氏染色（Gram stain）（1虽然各种类型的显微镜能够观察到微生物的各种形态结构，但一般实验室常用的是普通光学显微镜。
由于细菌体积小且透明，在活体细胞内又含有大量的水分，因此，对光线的吸收和反射与水溶液相差不大。
当把细菌悬浮在水滴内，放在显微镜下观察时，由于与周围背景没有显著的明暗差，难于看清它们的形状，更谈不上识别其细微结构。
而经过染色，就可借助颜色的反衬作用比较清楚地看到菌体形态，亦即菌体表面及内部结构着色与背景形成鲜明对比，这样便可在普通光学显微镜下清晰地观察到微生物的形状和结构，而且还可以通过不同的染色反应来鉴别微生物的类型和区分死、活细菌等，因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。
本实验通过对细菌的染色观察，使同学们在掌握细菌染色技术的基础上，了解各种其他的染色制片技术；观察微生物的各种形态结构，以巩固课堂知识，增强感性认识。
一、目的要求1．学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的单染色方法及无菌操作技术。
2．巩固显微镜的使用方法。
二、基本原理1.简单染色法：所谓单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。
此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。
在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。
碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合而使细菌着色。
例如，美蓝（亚甲蓝）实际上是氯化亚甲蓝盐，它可被电离成正、负离子：带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。
常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫（crystal violet）、碱性复红（basicfu-chsin）、番红（又称沙黄，safranine）等。
细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经着色后，与背景形成鲜明的对比，使易于在显微镜下进行观察。
2.革兰氏染色法：是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。
实验一 细菌革兰氏染色
附 油镜物镜的基本原理和使用方法
一、目的要求 学习掌握油镜的基本原理和使用方法 二、油镜物镜的基本原理 油镜物镜与其它物镜的不同是载玻片与接物镜之间， 油镜物镜与其它物镜的不同是载玻片与接物镜之间，不 时隔一层空气，而是隔一层油质，称为油濅系， 时隔一层空气，而是隔一层油质，称为油濅系，这种油常选用 香柏油，因香柏油的折射率是 香柏油，因香柏油的折射率是n=1.51，与玻璃相同。当光线通 ，与玻璃相同。 过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生曲折， 过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生曲折，如果 载片与物镜之间的介质是空气，则称为干燥系， 载片与物镜之间的介质是空气，则称为干燥系，当光线通过玻 片后，受到曲折，发生散射现象，进入物镜的光线显然减少， 片后，受到曲折，发生散射现象，进入物镜的光线显然减少， 这样一来就降低了视野的照明度。 这样一来就降低了视野的照明度。
实验器材： 实验器材：
显微镜、香柏油等 显微镜、
实验方法： 实验方法：
1、观察前的准备 、 2、低倍镜观察 、 3、油镜观察、 、油镜观察、
当用结晶紫初染后，所有细菌都被染成初染剂的兰紫色， 当用结晶紫初染后，所有细菌都被染成初染剂的兰紫色， 碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫 碘复合物 碘复合物， 碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫-碘复合物，从而增 强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱 强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时， 色效果是不同的。 色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要有舦聚糖形成 的网状结构组成，壁厚，类脂含量低， 的网状结构组成，壁厚，类脂含量低，用酒精脱色时细胞壁脱 水，使舦聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶 使舦聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低， 紫碘复合物不易被洗脱而保留在细胞内， 紫碘复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保 留初染剂的兰紫色。革兰氏阴性细菌则不同， 留初染剂的兰紫色。革兰氏阴性细菌则不同，由于其细胞壁舦 聚糖层较薄，类脂含量较高，，所以当脱色处理时， 聚糖层较薄，类脂含量较高，，所以当脱色处理时，类脂质被 ，，所以当脱色处理时 酒精溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫 碘复合物比较容易被洗 酒精溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘复合物比较容易被洗 脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。
简述革兰氏染色的原理
简述革兰氏染色的原理革兰氏染色是一种常用的细菌染色技术，通过该技术可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。
它是根据细菌细胞壁的结构特点，利用染色剂对其进行着色的一种方法。
革兰氏染色的原理可以简单概括为以下几个步骤：1.基础处理：将培养好的细菌涂片固定在玻片上，使其保持形状。
然后利用酒精进行整理，使细菌表面完整、无损，便于染色。
2.染色剂处理：首先将革兰氏染色的染色剂，紫罗兰碱涂满涂片上的细菌，静置一段时间，使染色剂充分渗透到细菌细胞壁上。
紫罗兰碱是革兰氏染色的第一步，它可与细菌细胞壁内的凝固酸和络合物结合，使细菌呈紫色。
3.碘处理：将碘酒涂满涂片上的细菌，静置片刻。
碘是紫罗兰碱的增鲜剂，它能使紫罗兰碱与凝固酸形成复合物，进一步稳定染色。
4.脱色处理：将涂片漂洗在乙醇或乙醇-醋酸溶液中，直至所染细菌呈现褐色，然后立即用蒸馏水洗净。
脱色的目的是去除细菌细胞壁中的脂类。
5.对比染色：将涂片浸入碱性水溶性染色剂，洋红素溶液，使其充分染色。
洋红素是革兰氏染色的对比剂，它可与细菌细胞壁内的酸类结合，使细菌细胞呈红色。
6.固定：将涂片漂至蓝色后，用蒸馏水洗净，然后将其晾干或进行后续检测。
革兰氏染色的原理主要基于细菌细胞壁的差异。
细菌细胞壁包括外膜、细胞壁和细胞膜。
在革兰氏正常态的细菌中，由于其细胞壁含有大量的多聚糖和蛋白质，紫罗兰碱容易与其结合形成复合物，染色后呈紫色。
而在革兰氏阴性细菌中，由于其细胞壁中的层状结构阻碍了紫罗兰碱的渗透，脱色后革兰氏阴性菌呈现褐色，不易被洋红素染色，所以会进一步对比染色，使其呈现红色。
革兰氏染色的原理虽然简单，但却是一种具有广泛应用的技术。
通过革兰氏染色，可以区分细菌的不同类型，判断其染色属性，以及进一步了解其生态特征和病原性。
因此，革兰氏染色在细菌学研究和临床诊断中得到了广泛的应用。
革兰氏染色原理的主要步骤
革兰氏染色原理的主要步骤革兰氏染色是一种常用的细菌染色方法，用于区分细菌是否为革兰氏阳性或革兰氏阴性。
革兰氏染色的主要步骤包括悬浮细菌、热固定、染色和洗涤。
以下将详细介绍每个步骤的原理及操作过程。
1. 悬浮细菌首先，将待染色的细菌悬浮在一滴水中，然后涂抹在载玻片上，形成细菌涂片。
在这一步骤中，水可以使细菌在载玻片上均匀分布，便于后续的染色和观察。
2. 热固定将涂片置于火焰上进行热固定，使细菌固定在载玻片上。
热固定的目的是杀死细菌、定着细菌在载玻片上，并使细菌细胞的结构更易于染色液的穿透。
3. 染色革兰氏染色的染色液一般包括紫晶染液、碘液、脱色剂和粉红色染液。
首先，将紫晶染液滴在涂片表面，静置一段时间后，用碘液固定染色。
然后使用脱色剂将多余的染色去除。
最后，用粉红色染液染色。
在这一步骤中，革兰氏阳性细菌会在第一次染色后呈现紫色，而革兰氏阴性细菌则在最后一步染色后呈现粉红色。
4. 洗涤最后，用水轻轻冲洗载玻片，使多余的染色剂和脱色剂去除干净。
然后晾干涂片，即可进行观察。
革兰氏染色的主要原理是根据细菌细胞壁的化学成分差异，革兰氏阳性细菌的细胞壁富含乙醇胺胶原蛋白及束缚力多糖，而革兰氏阴性细菌的细胞壁则富含脂多糖。
其中，乙醇胺胶原蛋白和束缚力多糖具有亲和力，可以吸附紫色的染色剂，使革兰氏阳性细菌呈现紫色；而脂多糖则具有亲和力，可以吸附粉红色的染色剂，使革兰氏阴性细菌呈现粉红色。
革兰氏染色的用途非常广泛，不仅可以帮助区分细菌的类型，还可以对细菌的形态与结构特点进行观察。
通过革兰氏染色，可以快速、简便地鉴别和分类细菌，有助于对感染性疾病的诊断和治疗。
因此，革兰氏染色在临床医学、生物学研究以及食品和水质检测等领域具有重要的应用价值。
总之，革兰氏染色是一种简单易行、快速有效的细菌染色方法，通过染色剂对细菌细胞壁成分的选择性亲和性染色，帮助鉴别革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。
掌握革兰氏染色的原理及操作技巧，对于细菌学研究和临床诊断具有重要的意义。
革兰氏染色法
细菌学中鉴别染色法
01 染色原理
03 常见种类
目录
02 操作流程 04 主要作用
革兰氏染色法，是指细菌学中广泛使用的一种重要的鉴别染色法，属于复染法。这种染色法是由丹麦医生革 兰于1884年所发明，最初是用来鉴别肺炎球菌与克雷伯肺炎菌。革兰染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等 四个步骤。未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难区别。经染色后，阳性菌呈 紫色，阴性菌呈红色，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，从而用以分类鉴定。染色原理：通 过结晶紫初染和碘液媒染后，在细菌细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，再用95%乙醇脱色。Fra bibliotek常见种类
常见的革兰氏阳性菌有葡萄球菌（Staphylococcus）、链球菌（Streptococcus）、肺炎双球菌、炭疽杆菌、 白喉杆菌、破伤风杆菌等。
常见的革兰氏阴性菌有痢疾杆菌、伤寒杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、百日咳杆菌及霍乱弧菌等及 脑膜炎双球菌等。
主要作用
革兰氏染色法的意义就在于鉴别细菌，把众多的细菌分为两大类，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
在治疗上，大多数革兰氏阳性菌都对青霉素敏感（结核杆菌对青霉素不敏感）：大多数化脓性球菌都属于革 兰氏阳性菌，它们能产生外毒素使人致病，可以选择青霉素族，头孢曲松钠等。
革兰氏阴性菌，大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌，它们产生内毒素，靠内毒素使人致病。而革兰氏阴性菌 则对青霉素不敏感（但奈瑟氏菌中的流行性脑膜炎双球菌和淋病双球菌对青霉素敏感），可以选择氟喹诺酮类药 物如诺氟沙星，左氧氟沙星等，也可以选择大环内酯类比如克拉霉素、罗红霉素等。所以首先区分病原菌是革兰 氏阳性菌还是阴性菌，在选择抗生素方面意义重大。
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革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师、细菌学家Christain Gram创立。
细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G—）。
为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红等进行复染。
阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。
有芽胞的杆菌和绝大多数和球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。
革兰氏阳性菌对青霉素敏感，革兰氏阴性菌对链霉素敏感。
可根据革兰氏染色法鉴别不同菌种并对症下药。
革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样。
现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱色，这是染色反应的主要依据。
另外，阳性菌菌体等电点较阴性菌为低，在相同PH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反。
所以染色时的条件要严格控制。
例如，在强碱的条件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反应；PH很低时，则可都呈负反应。
此外，两类菌的细胞壁等对结晶紫—碘复合物的通透性也不一致，阳性菌透性小，故不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色。
所以脱色时间，脱色方法也应严格控制。
革兰氏染色原理： G＋菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。
呈紫色。
Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是： 1）涂片固定。
在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，固定。
2）草酸铵结晶紫染1分钟。
3）自来水冲洗，去掉浮色。
4) 用碘-碘化钾溶液媒染1分钟，倾去多余溶液。
5）用中性脱色剂如乙醇或丙酮酸脱色，革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色，革兰氏阴性菌被褪色而呈无色。
6）用蕃红染液复染1分钟，革兰氏阳性菌仍呈紫色，革兰氏阴性菌则呈现红色。
革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌即被区别开。
为了研究细菌的形态，微生物学家发明了对细菌的染色，有用一种染色剂的称单染，仅能对细菌形态观察。
用两种以上的称复染，革兰氏发明了复染色法；先后用两种染色剂和媒染剂、脱色剂组合，由此而命名为革兰染色。
革兰染色不仅可以观察细菌的形态，同时将细菌分为两大类。
一类是染色阳性菌是紫色，另一类染色阴性的是红色。
由于细菌的结构上的差异，形成了不同的染色效果。
了解染色性能有助于临床用药和细菌的鉴定； 如青霉素对革兰染色阳性菌有效，当化脓性细菌感染可首选药物。
而氟哌酸对革兰染色阴性杆菌有效，如肠道病、腹泻为常用药。
当从尿道培养出革兰阴性双球菌，可以作为淋病感染的重要指症。
如出现革兰染色阳性的葡萄球菌，又可作为金黄色葡萄球菌感染依据。
鞭毛染色法
玻片处理：将玻片用洗衣粉煮沸10分钟，水洗，再用清洁液浸泡，加温10分钟，水洗，再放入95%酒精脱脂，同时取出凉干，可制成涂片．
染色液的配制：
20%的鞣酸溶液（加温溶解）2毫升
钾明矾饱和液2毫升
石碳酸饱和液5毫升
10%碱性复红无水乙醇溶液1．5毫升
将上述各液混合后放置2-3日，过滤后备用，此液使用不得超大型过5周．
染色步骤：将细菌接种在琼脂平板上，培养8-18小时，（35-37℃），用无水乙醇浸泡过的而且干燥的新玻片加一滴无菌DW，用接种环挑取菌落，置DW液面上，然后自然干燥．滴加染色液染1-2分钟，水洗干后镜检．
结果：鞭毛染成红色．
细菌的荚膜染色法
一、目的要求
学习并掌握荚膜染色法
二、基本原理
荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质。
由于荚膜与染料的亲和力弱，不容易着色；而且可溶于水，易在用水冲洗时被除去。
所以通常用衬托染色法(负染色法)染色，使菌体和背景着色，而荚膜不着色，从而在菌体周围形成一透明圈。
由于荚膜富含水分，制片时应自然干燥，不可以加热固定，避免加热蒸发，影响观察。
三、菌种：褐球固氮菌（A zotobacter chroococcus）的斜面培养物。
染液：齐氏石炭酸复红染液
四、操作步骤
制片——自然干燥——结晶紫或石炭酸复红染液染色2分钟——水洗——干燥——镜检
五、实验报告
绘图示褐球固氮菌的形态特征。