革兰氏染色法
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• 分析和讨论 • 思考题
实验一、油镜的使用、细菌的革兰氏染色和细菌 形态的观察
教学目标或要求：
※巩固和掌握显微镜油镜的正确使用； ※学习细菌制片和单染色技术； ※观察细菌的三种基本形态； ※对人体上的微生物染色检查，初步建立无菌操作的
概念； ※学习细菌的革兰氏染色原理和方法 。
显微镜油镜的使用
革兰氏阳性杆菌
革兰氏阴性杆菌
实验内容
1、用石炭酸复红对苏云金芽孢杆菌、大肠 杆菌进行单染色，在显微镜油镜下观察 形态；
2.用混合涂片的方法对大肠杆菌、苏云金 芽孢杆菌进行革兰氏染色
3.自选材料：用牙签挑取牙垢观察
注意事项
1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色 过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性 菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被 染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂 片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以 严格规定。
• 思考题：你认为那些环节会影响革兰氏染色结果的 正确性？其中最关键的环节是什么？如何使你的染 色结果可信？
方法与步骤
（1）涂片 （2）晾干 （3）固定 （4）结晶紫染色：加适量（以盖满细菌涂
面）的结晶紫染色液染色1min；水洗：倾 去染色液，用水小心地冲洗。 （5）媒染：碘液，媒染1min；水洗：用水 洗去碘液。
（6）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇 脱色15—20s至流出液无色，立即水洗。
（7）复染：滴加复红复染1min；水洗：用水 洗去涂片上的复红染色液。
G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少， 经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降 低，因此细菌仍保留初染时的颜色。
实验材料
• 1、活材料：培养24小时的大肠杆菌和 苏云金芽孢杆菌。
• 2、染色液和试剂：结晶紫、碘液、95% 酒精、石炭酸复红 、蒸馏水、香柏油。
• 3、器材：载玻片、接种杯、酒精灯、 擦镜纸、显微镜。
2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后， 应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释 而影响染色效果。
3.选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h， E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死 亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
实验报告
• 绘出革兰氏染色后大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌的形 态图并说明染色结果。
5、观察完毕。上升镜筒，转动物镜转换器，使油镜物镜偏位。 用干净擦镜纸擦去镜头上的油迹，再取一张擦镜纸醮上二甲 苯擦去镜头上残留的香柏油，最后再用一张干净的擦镜纸擦 去残留在镜头上的二甲苯。
6、将显微镜各部分还原，放回箱中。
细菌的制片与染色
单染色 复染色
染料
多数染料都是中性有机盐。据着色基的不同可分为 以下类型：
1、用低倍镜对光。最大光圈 2、低倍镜观察（寻找观察目标）。适当缩小光圈 3、高倍镜观察（选取理想的观察目标）。 4、油镜观察：高倍镜观察后- 上升镜筒-油镜转至正下方，在
载玻片上加一小滴油-小心地下降镜筒使镜头浸在油里-用粗 螺旋将镜筒缓慢上升，寻找目标（物象）用细螺旋调节，使 物象清晰-观察记录。最大光圈
• 油镜头的识别和重要参数 • 油镜物镜的工作原理 • 油镜的使用方法和注意事项
油镜头的识别和重要参数
放大倍数 数值口径 工作距离
油镜物镜的工作原理
• 使用油质作为玻片与接物镜 之间的介质——油浸系
• 可以增加显微镜的放大倍数 • 可以增加视野的照明度 • 可以增大显微镜的分辨率
油镜的使用方法和注意事项
革兰氏染色法基本原理
• 革兰氏染色法：是1884年由丹麦病理学家 C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的 细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴 性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴 别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌 和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分 的不同所决定的。
G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且 肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂 质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复 合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经复红复染后就 成红色。
（8）晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干。
（9）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最 后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色结 果。
• 操作步骤
革兰氏染色法
涂片——干燥——固定
结晶紫1min——水洗
95%乙醇脱色约1Baidu Nhomakorabea~20s——水洗
I-KI 1min——水洗
沙黄或石炭酸复红 1min——水洗
干燥——镜检
①碱性染料—带正电染料。其阳离子部分为发色基团，
可与细胞中带负电的组分结合。如结晶紫沙黄, 甲基蓝,碱 性复红等。
②酸性染料—带负电染料。其阴离子部分为发色基团，
可与细胞中带正电的组分结合。如刚果红、酸性复红 等。
③脂溶性染料—如Sudan black。
细菌的单染色
涂片
干燥
固定
镜检
水洗、吸干
染色1~2min
实验要求
• 坚持课前预习 • 不迟到，不早退，更不能无故缺课； • 严格按正确规范实验方法进行实验，作好记录； • 保持实验室整洁 • 注意安全 • 事实求是地、独立地写好实验报告
实验报告
• 姓名、班级和学号 • 实验题目 • 实验原理（略写） • 实验操作（略写） • 实验结果
– 画图 – 文字描述
实验一、油镜的使用、细菌的革兰氏染色和细菌 形态的观察
教学目标或要求：
※巩固和掌握显微镜油镜的正确使用； ※学习细菌制片和单染色技术； ※观察细菌的三种基本形态； ※对人体上的微生物染色检查，初步建立无菌操作的
概念； ※学习细菌的革兰氏染色原理和方法 。
显微镜油镜的使用
革兰氏阳性杆菌
革兰氏阴性杆菌
实验内容
1、用石炭酸复红对苏云金芽孢杆菌、大肠 杆菌进行单染色，在显微镜油镜下观察 形态；
2.用混合涂片的方法对大肠杆菌、苏云金 芽孢杆菌进行革兰氏染色
3.自选材料：用牙签挑取牙垢观察
注意事项
1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色 过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性 菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被 染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂 片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以 严格规定。
• 思考题：你认为那些环节会影响革兰氏染色结果的 正确性？其中最关键的环节是什么？如何使你的染 色结果可信？
方法与步骤
（1）涂片 （2）晾干 （3）固定 （4）结晶紫染色：加适量（以盖满细菌涂
面）的结晶紫染色液染色1min；水洗：倾 去染色液，用水小心地冲洗。 （5）媒染：碘液，媒染1min；水洗：用水 洗去碘液。
（6）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇 脱色15—20s至流出液无色，立即水洗。
（7）复染：滴加复红复染1min；水洗：用水 洗去涂片上的复红染色液。
G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少， 经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降 低，因此细菌仍保留初染时的颜色。
实验材料
• 1、活材料：培养24小时的大肠杆菌和 苏云金芽孢杆菌。
• 2、染色液和试剂：结晶紫、碘液、95% 酒精、石炭酸复红 、蒸馏水、香柏油。
• 3、器材：载玻片、接种杯、酒精灯、 擦镜纸、显微镜。
2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后， 应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释 而影响染色效果。
3.选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h， E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死 亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
实验报告
• 绘出革兰氏染色后大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌的形 态图并说明染色结果。
5、观察完毕。上升镜筒，转动物镜转换器，使油镜物镜偏位。 用干净擦镜纸擦去镜头上的油迹，再取一张擦镜纸醮上二甲 苯擦去镜头上残留的香柏油，最后再用一张干净的擦镜纸擦 去残留在镜头上的二甲苯。
6、将显微镜各部分还原，放回箱中。
细菌的制片与染色
单染色 复染色
染料
多数染料都是中性有机盐。据着色基的不同可分为 以下类型：
1、用低倍镜对光。最大光圈 2、低倍镜观察（寻找观察目标）。适当缩小光圈 3、高倍镜观察（选取理想的观察目标）。 4、油镜观察：高倍镜观察后- 上升镜筒-油镜转至正下方，在
载玻片上加一小滴油-小心地下降镜筒使镜头浸在油里-用粗 螺旋将镜筒缓慢上升，寻找目标（物象）用细螺旋调节，使 物象清晰-观察记录。最大光圈
• 油镜头的识别和重要参数 • 油镜物镜的工作原理 • 油镜的使用方法和注意事项
油镜头的识别和重要参数
放大倍数 数值口径 工作距离
油镜物镜的工作原理
• 使用油质作为玻片与接物镜 之间的介质——油浸系
• 可以增加显微镜的放大倍数 • 可以增加视野的照明度 • 可以增大显微镜的分辨率
油镜的使用方法和注意事项
革兰氏染色法基本原理
• 革兰氏染色法：是1884年由丹麦病理学家 C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的 细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴 性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴 别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌 和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分 的不同所决定的。
G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且 肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂 质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复 合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经复红复染后就 成红色。
（8）晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干。
（9）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最 后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色结 果。
• 操作步骤
革兰氏染色法
涂片——干燥——固定
结晶紫1min——水洗
95%乙醇脱色约1Baidu Nhomakorabea~20s——水洗
I-KI 1min——水洗
沙黄或石炭酸复红 1min——水洗
干燥——镜检
①碱性染料—带正电染料。其阳离子部分为发色基团，
可与细胞中带负电的组分结合。如结晶紫沙黄, 甲基蓝,碱 性复红等。
②酸性染料—带负电染料。其阴离子部分为发色基团，
可与细胞中带正电的组分结合。如刚果红、酸性复红 等。
③脂溶性染料—如Sudan black。
细菌的单染色
涂片
干燥
固定
镜检
水洗、吸干
染色1~2min
实验要求
• 坚持课前预习 • 不迟到，不早退，更不能无故缺课； • 严格按正确规范实验方法进行实验，作好记录； • 保持实验室整洁 • 注意安全 • 事实求是地、独立地写好实验报告
实验报告
• 姓名、班级和学号 • 实验题目 • 实验原理（略写） • 实验操作（略写） • 实验结果
– 画图 – 文字描述