单增李斯特菌检测技术2012

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单核细胞增生李斯特氏菌检验技术

1mL
•小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷
10mLLB2
TSA-YE
鼠李糖
TSA-YE
阳性
选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定
革兰氏染色
单增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环；在靠近金黄色葡萄球菌的接种端溶血增强
革兰氏阳性短杆菌
动力试验
MR试验
一、单核增生李斯特氏菌概况
生物学特性
该菌对理化因素抵抗力较强，在土壤、粪便、青储饲料和食品中能长期存活；对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20min可杀死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min 可杀死此菌；湿热灭菌（121℃，至少15min）和干热灭菌（160-170℃，至少1hr）可杀灭该菌，对紫外线和γ射线敏感；对青霉素、氨苄青霉素、氨基糖苷类、氯霉素均敏感。
食品中单核增生李斯特氏菌检验
食品微生物检验技术
李斯特氏菌属（Listeria ）普遍存在于环境中，最新的分类学研究表明，其分为六个种：单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、绵羊（伊氏）李斯特氏菌、英诺克（无害）李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌、威氏李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌在李斯特氏菌属只有两种致病菌：单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他动物发病。但是，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类的李斯特氏菌症（listeriosis）相关。因此，李斯特氏菌中最有检测意义是单核增生李斯特氏菌。
一、单核增生李斯特氏菌概况
李斯特氏菌属
革兰氏阳性,老龄培养物多转为革兰阴性;兼性厌氧,无芽孢、无荚膜;生长温度范围为2-42℃（也有报道在0℃能缓慢生长）,pH范围pH4.4-pH9.6;LM的幼龄菌（16~24h的培养物），为革兰阳性小杆菌，常呈V字形，成对排列。在22~25℃环境中形成4根鞭毛，故在25℃肉汤培养液中出现轻微旋转或翻滚样的运动。而在32℃时仅形成一根鞭毛，动力缓慢。

单增李斯特氏菌及其检测方法

单增李斯特氏菌及其检测方法一、单增李斯特氏菌单增李斯特氏菌，学名Listeria monocytogenes，一种革兰氏阳性菌，是李斯特菌属。

李斯特菌属(Listeria)共分为2个群，7个种：第一群包括单核细胞增生性李斯特菌(L monocytogenes，LM)(亦称产单核细胞李斯特菌)、伊氏李斯特菌(L ivanovii)(亦称绵羊李斯特菌)、英诺克李斯特菌(L innocua)(亦称无害李斯特菌)、韦氏李斯特菌(L welshimei)、塞氏李斯特菌(L seeligeri)，第二群包括格氏李斯特菌(L grayi)和莫氏李斯特菌(L mulTayi)。

其中，单增李斯特菌是唯一能引起疾病的人畜共患病的病原菌。

它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。

二、单增李斯特氏菌检测方法1.细菌培养法该菌营养要求不高，兼性厌氧，最适在含有CO2的微需氧环境中生长，生长温度范围-1.5℃-45℃，最适温度为30℃-37℃，能在普通冰箱冷藏室生长，是一种典型的耐冷性细菌，同时还具有耐盐性。

LM在普通琼脂平板上呈细小直径约0.2-0.4μm、半透明露水样菌落。

在血琼脂平板上有β溶血环。

在显色培养基上呈蓝绿色。

2.生化鉴定法该菌主要生化特性如下：①触酶阳性；②氧化酶阴性；③发酵多种糖类；④产酸不产气；⑤不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二塘；⑥不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解；⑦吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性；⑧VP、甲基红试验和精氨酸水解试验阳性；⑨对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20分钟可杀死，70%酒精5min、2.5%石碳酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min可杀死此菌。

⑩该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺均敏感。

3.血清凝集法根据菌体抗原和鞭毛抗原，LM分为16个血清型：1／2a、1／2b、1／2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b、7。

(十)-单核细胞增生李斯特氏菌检验标准操作程序

DBS22 DBS22/019—2012吉林省食品安全地方标准食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测2013年发布 2013年实施吉林省卫生厅发布前言本标准根据GB/T1。

1—2000《标准化工作导则第1部分:标准的结构和编写规则》的要求编写.本标准分为两种检测方法：第一法:单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法；第二法：MPN计数法。

其中第一法适用于污染较严重的食品，第二法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较低而杂菌含量较高的食品。

本标准负责起草单位：吉林省疾病预防控制中心、长春市疾病预防控制中心.本标准负责起草人:刘桂华、龚云伟、李月婷、赵薇吉林省食品安全地方标准食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测1 范围本操作程序规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的定量检验方法.本操作程序适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定量检验。

2 设备和材料除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2。

1 冰箱：2℃～5℃和—18℃.2.2 恒温培养箱：30℃±1℃、36℃±1℃.2.3 均质器。

2.4 显微镜:10×～100×.2。

5 电子天平:感量0。

1 g。

2.6 锥形瓶:100 mL、500 mL。

2。

7 无菌吸管:1 mL（具0。

01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。

2.8 无菌平皿:直径90 mm。

2。

9 无菌试管：16 mm×160 mm.。

2。

10 离心管:30 mm×100 mm.2。

11 无菌注射器:1 mL。

2。

12 金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）。

2.13 马红球菌（Rhodococcus equi）。

2。

14 全自动微生物生化鉴定系统。

3 培养基和试剂3。

1 含0。

6％酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE)：见附录A中A。

1.3。

2 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）：见附录A中A.2。

食品中单核细胞增生李斯特菌检测技术方法进展

食品中单核细胞增生李斯特菌检测技术方法进展【中图分类号】R155 【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）15-0112-01 单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，简称LM，以下简称单增李斯特菌），广泛存在于自然界，如土壤、污水、青饲料、食品生产加工器具、多种食品。

动物和人体也带有此菌[1]，是一种重要的食源性致病菌。

该菌具有很强的环境适应性，存活温度范围在-1℃～45℃，PH范围为4.0～9.5，耐盐性相当强，Nacl浓度范围为0.5%～10%，所以在食品加工、生产过程中单增李斯特菌很难被杀灭，而且单增李斯特菌在4℃仍能生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一[2][3]。

单核细胞增生李斯特菌中毒严重时可引起人类的败血症、脑膜炎及单核细胞增生等多种疾病，死亡率高达35%～70%[4]，所以对实验室检验人员来说，提高单增李斯特菌的检出率具有重要的现实意义。

食品中单增李斯特菌的检测方法大致分为三类，即分离培养法、免疫学方法和分子生物学方法。

1 分离培养法是最传统的检测方法，应用国标法，即GB/4789.30—2010作为检测方法，先两次增菌，即LB1增菌液36℃±1℃培养24小时，然后再移取到LB2增菌液36℃±1℃培养18～24小时，对被检样品进行增菌，然后取LB2增菌液划线接种在科玛嘉李斯特菌显色培养基和PALCAM琼脂平板，36℃±1℃培养24～,48小时，然后经初筛鉴定等试验步骤，结果符合生化试验和溶血试验结果进行报告，但该菌革兰氏染色和镜检时要特别加以注意，因为单增李斯特菌在新鲜培养液为G+小杆菌，但在陈旧的培养液中菌体多转为G－,特别是该菌在22℃～25℃环境中能形成4根鞭毛，运动活泼，在32℃环境中仅能形成1根鞭毛，运动缓慢，在36℃培养则无动力，所以容易误判。

虽然该方法实验设备要求不高，可操作性强，但检验周期长，需6～7d，这种传统的检测方法已无法满足食品生产过程中的在线检测、食品上市和消费前的快速检验要求 [5]。

单增李斯特氏菌说明书安全操作及保养规程

单增李斯特氏菌说明书安全操作及保养规程一、引言单增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种常见的食品中毒病原菌，可引起人类严重的感染。

为了确保操作过程的安全性和实验结果的准确性，本文档将介绍单增李斯特氏菌的安全操作和保养规程。

二、实验前准备1.工作区域：选择干净整洁、通风良好的实验室，并确保无人员流动和非实验人员进入实验区域。

2.实验器材：准备好需要使用的培养皿、试管、移液器、离心机等实验器具，并进行消毒处理。

3.个人防护措施：穿戴实验服、手套、护目镜等个人防护装备，避免直接接触菌株。

三、操作步骤1.培养基准备：根据实验需求，制备适当培养基，并严格按照配方进行配置、混合和消毒。

2.菌株接种：取一支保存有单增李斯特氏菌的细菌种子液，并使用无菌的移液器将其接种到培养基中。

3.培养条件：将接种好的培养基置于恒温培养箱中，以适当的温度和湿度进行培养。

根据具体需要，可以选择不同的培养条件。

4.培养时间：根据菌株的生长特性和实验目的，设定适当的培养时间。

在培养过程中，定期观察培养基的变化情况。

四、实验后处理1.菌株保存：实验结束后，将培养好的菌株进行分装并保存。

使用无菌的容器和保护液，防止菌株失活或变异。

2.器材清洗：实验器材需要彻底清洗，以防止交叉污染。

使用适当的消毒剂和清洁剂，对实验教具进行彻底清洁和消毒处理。

3.工作区清理：清理工作区域，包括实验台面、废弃物和其他杂物的清理。

确保实验室的环境整洁，以减少潜在的污染风险。

五、安全注意事项1.个人防护：在实验操作过程中，要正确佩戴实验服、手套、护目镜等个人防护装备，避免直接接触菌株。

2.实验环境：选择合适的实验环境，保持实验室的通风良好，并避免非实验人员进入实验区域。

3.消毒处理：在实验前后对实验器材、工作区域进行彻底的消毒处理，以减少交叉污染的风险。

4.废弃物处理：将实验中产生的废弃物，如培养基、菌株等，正确处理和清理，并根据实验室的要求进行垃圾分类处理。

单核细胞增生性李斯特菌快速检测技术研究

单核细胞增生性李斯特菌快速检测技术研究引言：单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种潜伏在食品中常见的致病菌，能引起严重的食物中毒，威胁着人类的健康与生命安全。

因此，研究和发展一种快速、高效的检测技术对于食品安全至关重要。

本文旨在探讨目前关于单核细胞增生性李斯特菌快速检测技术的研究进展，并为进一步的研究和应用提供参考。

一、单核细胞增生性李斯特菌简介单核细胞增生性李斯特菌是一种革兰氏阳性菌，能在广泛的温度（0-45℃）和pH（4.4-9.6）范围内生长，且具有金属抗药性。

在食品中，该菌可以通过肉类、蔬菜和奶制品等途径传播，使其成为食品安全的重要隐患之一。

由于该菌对常规的煮沸和加热处理具有一定的抵抗能力，因此需借助有效的检测技术对其进行快速、准确的检测。

二、传统检测方法的局限性目前常用的单核细胞增生性李斯特菌检测方法主要包括传统培养方法、蛋白酶结合效应（ELISA）和分子生物学方法等。

然而，这些方法存在着以下局限性：1. 传统培养方法耗时长，需要较长的培养时间才能获得结果，无法快速检测；2. ELISA方法虽然具有较高的灵敏度和特异性，但其需要复杂的样品处理和实验步骤，使得检测过程繁琐；3. 分子生物学方法虽然能够提供较快的检测结果，但其仪器成本高，技术要求较高，限制了其在实际应用中的推广。

三、快速检测技术的研究进展随着科学技术的发展，研究人员不断探索和开发更为快速、准确的单核细胞增生性李斯特菌检测技术。

以下是几种常见的快速检测技术：1. 荧光定量聚合酶链反应（qPCR）技术：该技术以其高效、精确和快速的特点，被广泛应用于单核细胞增生性李斯特菌的检测。

qPCR技术可以快速扩增和定量样品中的特定基因片段，结合荧光定量技术实现李斯特菌的快速检测和定量。

2. 微生物芯片技术：微生物芯片是基于生物芯片技术的一种新型检测平台，可实现对多种菌种的快速识别和检测。

研究人员通过设计特定的探针，可以在芯片上同时检测多种致病菌，包括单核细胞增生性李斯特菌，提高了检测效率和准确性。

单核细胞增生李斯特菌检验

《动物检疫检验技术专业教学资源库》
单核细胞增生李斯特菌检验
一、生物学特性
形态及染色：该菌为革兰氏阳性短杆菌，大小约0.5um×1.0um～2.0um，直或稍弯，两端钝圆，常呈v字型排列，偶有球状、双球状，兼性厌氧、无芽胞，一般不形成荚膜，但在营养丰富的环境中可形成荚膜，在陈旧培养基中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性，该菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脱落。
产道感染胎儿或新生儿，栖居于阴道、子宫颈的该菌也引起感染，性接解也是本病传播的可能途径，且有上升趋势。临床表现，健康成人个体出现轻微类似流感症状，新生儿、孕妇、免疫缺陷患者等表现为呼吸急促、呕吐、出血性皮疹、化脓性结膜炎、发热、抽搐、昏迷、自然流产、脑膜炎、败血症直至死亡。
《动物检疫检验技术专业教学资源库》
《动物检疫检验技术专业教学资源库》
单核细胞增生李斯特菌检验
胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂(TSA-YE)平板
用途：用于单增李氏菌分纯、培养。
原理：胰蛋白胨、多价胨和酵母浸粉提供氮源、维生素和生长因子；氯化钠维持均衡的渗透压；葡萄糖提供碳源；磷酸氢二钾为缓冲剂。
《动物检疫检验技术专业教学资源库》
动物检疫检验技术专业教学资源库
动物性食品微生物检验
单核细胞增生李斯特菌检验
主讲人：王福红
单核细胞增生李斯特菌检验
知识目标：
• 理解单核细胞增生李斯特菌的生物学特性。 • 了解单核细胞增生李斯特菌的致病性。 • 掌握单核细胞增生李斯特菌标准检验方法。
能力目标：
• 会制备单核细胞增生李斯特菌检验用培养基。 • 会对单核细胞增生李斯特菌进行检验。
电镜下的李特氏菌
《动物检疫检验技术专业教学资源库》
单核细胞增生李斯特菌检验

单增李斯特菌检测技术

进口PALCAM 、进口OXA菌落较典型，易与杂菌区分
CHROMagar菌落较典型，易与杂菌区分，对高污染食品中的杂菌抑制性较差
L.M在PALCAM培养基生长特征
L.M在OXA培养基生长特征
单增李斯特菌在科玛嘉李斯特显色培养基上的菌落形态
染色镜检
将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片检查; 利斯特菌为革兰氏阳性短杆菌, 大小为0.4～ 0.5μm×0.5～2.0μm；用生理盐水制成菌悬液, 在油镜或相差显微镜下观察, 该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。
单增李斯特菌溶血反应阳性对照：CMCC54004、
CMCC54007 阴性对照：英诺克李斯
特菌（Lin） L1：（-）；L2、L3、L4、
L5：（+）
协同溶血试验 (cAMP)
在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红
球菌 (R.equi), 在它们中两者之间垂直接种
可疑利斯特菌, 但不要触及它们, 于30℃培养24h～48 h, 检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。靠近金黄色葡萄球菌接种点的单核细胞增生李斯特菌的溶血增强, 斯氏李
加拿大由单增李斯特氏菌污染肉制品引发李斯特菌病暴发，导致十几人死亡。很多国家都已经采取措施来控制食品中的单增李斯特氏菌，并制定了相应的标准。
形态与染色
革兰氏阳性小杆菌，长 0.5~2 μ m ，宽 0.4~0.6 μ m，直或稍弯，常呈 V 字形，成对排列。
无芽胞，一般不形成荚膜。
22~25 ℃环境中形成 4 根鞭毛，运动活泼； 32 ℃时仅形成一根鞭毛，动力缓慢。
腹腔注射 3～5只, 每只0.5 mL，观察小鼠死亡情况。致病株于2～5d 内死亡。试验时可用已知菌作对照。单核细胞增

单增李斯特菌的检验方法

单增李斯特菌的检验方法
一.增菌：
1.EB肉汤
2.LB肉汤（根据我的实验结果和请教其他老师的说法，LB增菌
效果优于EB）
LB分为LB1和LB2，两者基础培养基相同，区别在于添加辅助试剂丫啶黄、萘啶酮酸的量（基础培养基--杭州天河生物试剂公司；丫、萘—上海疾控中心。

上海的辅助试剂已按一定浓度配置成溶液，使用起来比较方便）
25g样品加入到225mlLB1增菌液中，30℃培养24h，吸0.1mlLB1增菌液到LB2增菌液中，30℃培养24h。

二.选择分离
挑一环LB2增菌液划线接种到科玛嘉选择性培养基上，37℃培养24h，观察现象，可疑菌落在此培养基上为兰色，周围有白晕的菌落。

（国标上使用的选择性培养基是MMA，但是其选择性不强，科玛嘉选择性培养基是法国制造，选择性比MMA强的多，而且现象明显，许多发达国家使用。

此培养基是国标编委白萍女士向我推荐的）三.生化实验
挑可疑菌落穿刺接种到SIM，25℃培养3---5d，观察伞状生长情况、TSI（三糖铁）斜面30℃培养24h—48h，观察，单增李斯特菌在TSI上应该是底面、斜面均产酸，不产H2S，不产气的培养物.
这是单增李斯特菌落在SIM动力培养基上的伞状情形再挑取TSI上培养物接种其他生化管。

七叶苷鼠李糖木糖甘露醇尿
素
硝
酸
盐
还
原
VP MR H2O2
++----+++。

单核增生李斯特氏菌检测概述

单核增生李斯特氏菌检测概述单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性的致病菌，能够在低温下生存繁殖，并在恶劣环境中形成生物被膜，使其对抗不良条件。

该菌可引起人类的李斯特菌病（Listeriosis），也是一种可以通过食品传播的重要病原体。

李斯特菌病在免疫功能低下的人群中很容易引起严重感染，包括孕妇、老年人、免疫抑制患者和新生儿。

检测单核增生李斯特氏菌的方法主要包括传统的培养方法和现代的分子生物学方法。

1.传统培养方法传统的培养方法是检测单核增生李斯特氏菌的主要方法之一、常用的培养基包括PALCAM（Polymyxin, Acriflavine, Lithium chloride and Cycloheximide）和OXOID Listeria Selective Agar等。

培养温度通常在30-37℃之间，因为单核增生李斯特氏菌可以在低温下生长。

在培养过程中，从食品样品或其他可能受污染的样品中提取菌落，并在培养基上进行培养。

培养时间通常为1-2天，培养过程中需要注意去除其他菌落的干扰。

2.分子生物学方法分子生物学方法是现代检测单核增生李斯特氏菌的常用方法，主要包括聚合酶链反应（PCR）和实时荧光定量PCR等。

这些方法的优势在于其高度敏感性和特异性。

通过检测单核增生李斯特氏菌特有的基因或序列，可以快速准确地鉴定与检测其存在。

3.培养与分子生物学相结合的方法为了更好地检测单核增生李斯特氏菌，有些方法将传统培养与分子生物学相结合。

这种方法通常先进行培养，然后使用PCR或实时荧光定量PCR等技术进行进一步检测和鉴定。

这种方法较为耗时，但能够进一步提高检测的准确性。

需要注意的是，由于单核增生李斯特氏菌能够在低温下生存，因此在食品或样品中的检测非常重要。

常见的食品样品包括生肉、海鲜、冷冻食品、奶制品等。

对于食品企业来说，建立完善的食品安全管理体系和进行规范的监测是防止单核增生李斯特氏菌传播的重要措施。

食品源单增李斯特菌的分离鉴定及耐药性检测

食品源单增李斯特菌的分离鉴定及耐药性检测食品源单增李斯特菌的分离鉴定及耐药性检测引言：李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性杆菌，可以通过食物传播给人类，并引发李斯特菌感染。

李斯特菌感染是一种严重的食物中毒疾病，可能导致严重的并发症甚至死亡。

因此，对食品中的李斯特菌进行分离鉴定及耐药性检测非常重要，以确保食品的安全性。

分离鉴定方法：1. 样本采集：从怀疑被污染的食品中，选择不同部位的样本进行采集，如肉类、奶制品、蔬菜等。

2. 李斯特菌分离：将样本加入到富营养培养基中，在适宜的温度下（37℃），培养16-24小时。

然后将培养液进行测定，寻找典型的李斯特菌菌落。

3. 形态特点观察：通过显微镜观察菌落的形态特征，如形状、颜色等。

4. 生化性质检测：经过形态观察后，选取具有典型形态特征的菌落用于进一步的生化测试，如靶心李斯特菌鉴定板、鲁埃斯鸟氏培养基等。

5. PCR检测：利用李斯特菌特异性基因进行PCR鉴定，以确认是否为李斯特菌。

耐药性检测方法：1. 选择抗生素：选择常见的抗生素，包括头孢呋辛、青霉素、氨基糖苷类药物等，同时也选择一些非常见的抗生素，以探索其耐药性情况。

2. 可兰霉素敏感测试：可通过培养基中加入不同浓度的可兰霉素，观察菌落的生长情况，确定最低抑菌浓度（MIC）。

3. 扩散法：将李斯特菌涂布在富营养培养基上，然后将不同抗生素药片放置在不同区域，观察菌落生长与否。

4. PCR检测：利用PCR方法检测耐药基因的存在情况，进一步确定李斯特菌的耐药性。

讨论：通过以上的分离鉴定及耐药性检测方法，可以有效地检测食品样本中的李斯特菌，并了解其耐药性情况。

应用这些方法，可以及早发现李斯特菌的污染源，并采取相应的措施来控制和预防李斯特菌感染的发生。

此外，这些方法也可为食品监测部门提供参考，加强对食品安全的监管。

结论：李斯特菌是一种严重的食源性病原菌，对人类健康构成潜在威胁。

单增李斯特氏菌及其检测方法

单增李斯特氏菌及其检测方法一、单增李斯特氏菌单增李斯特氏菌，学名Listeria monocytogenes，一种革兰氏阳性菌，是李斯特菌属。

其中，单增李斯特菌是唯一能引起疾病的人畜共患病的病原菌。

它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。

LM在普通琼脂平板上呈细小直径约0.2-0.4μm、半透明露水样菌落。

在血琼脂平板上有β溶血环。

在显色培养基上呈蓝绿色。

⑩该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺均敏感。

3.血清凝集法根据菌体抗原和鞭毛抗原，LM分为16个血清型：1／2a、1／2b、1／2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b、7。

单增李斯特菌的检验方法

单增李斯特菌的检验方法
一. 增菌：
1. EB肉汤
2. LB 肉汤（根据我的实验结果和请教其他老师的说法，LB 增菌效
果优于EB）
LB分为LB和LR,两者基础培养基相同，区别在于添加辅助试剂丫啶黄、萘啶酮酸的量（基础培养基-- 杭州天河生物试剂公司；丫、萘—上海疾控中心。

上海的辅助试剂已按一定浓度配置成溶液, 使用起来比较方便）
25g样品加入到225mlLB增菌液中，30C培养24h，吸O.lmlLB i
增菌液到LR增菌液中，30C培养24h。

二.选择分离
挑一环LB2增菌液划线接种到科玛嘉选择性培养基上，37 C培养24h,观察现象，可疑菌落在此培养基上为兰色，周围有白晕的菌落。

（国标上使用的选择性培养基是MM,A 但是其选择性不强,科玛嘉选择性培养基是法国制造，选择性比MMA强的多，而且现象明显，许多发达国家使用。

此培养基是国标编委白萍女士向我推荐的）
三.生化实验
挑可疑菌落穿刺接种到SIM, 25C培养3---5d ,观察伞状生长情况、TSI （三糖铁）斜面30C培养24h—48h,观察，单增李斯特菌在TSI上应该是底面、斜面均产酸，不产H2S不产气的培养物•
这是单增李斯特菌落在SIM动力培养基上的伞状情形再挑取TSI上培养物接种其他生化管。

单增李斯特氏菌检测详解

鉴定
血清学检验菌悬液于80℃水域中加热1h，离心弃上清，剩余液与沉淀混匀制成菌悬液，进行血清学玻片凝集试验。
单核细胞增生李斯特氏菌：1/2A，1/2B， 1/2C，3A，3B，3C，4A，4AB，4B，4C， 4D，4E，7
质量控制
每次检验均需用标准阳性菌株和阴性菌株进行质量控制。样品制备的同时，在空白对照FB1增菌液中加入新鲜配制的每毫升含有10个～100个单核细胞增生李斯特氏菌的稀释液1mL和阴性培养物，按检验程序进行同步检验。
报告结果
协同溶血试验、血清学试验可根据需要进行，常规检验可不进行这些试验。
报告阳性结果：检出单核细胞增生李斯特氏菌。
报告阴性结果：未检出单核细胞增生李斯特氏菌。
新旧标准的主要不同
增菌培养基 EB Fraser 选择性培养基MMA OXA和PALCAM 生化试验和协同溶血试验 API鉴定增加VIDAS快速筛选取消小鼠毒力试验
鉴定
溶血试验
刺种7％羊血琼脂平板，并刺种阳性对照菌（单核
细胞增生李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌）和阴性
对照菌（英诺克李斯特氏菌），30℃培养24h～ 48h。
单核细胞增生李斯特氏菌窄小的β溶血环
西尔李斯特氏菌
窄小的β溶血环
绵羊李斯特氏菌
大的β溶血环
其他
不溶血
鉴定
动力试验穿刺SIM半固体培养基，于室温（20℃～25℃）
＋＋＋＋＋＋－－＋/ 产酸，＋＋＋－－＋＋不产H2S
＋＋＋＋－＋－－＋/ 产酸，＋＋＋＋－－＋不产H2S
鉴定
协同溶血试验（cAMP）
在羊血琼脂平板上各

单核增生李斯特氏菌检测

在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小的β-溶血环。在0ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)琼脂上，用45°角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。
单核增生李斯特氏菌检测概述
李斯特氏菌属

李斯特氏菌属（Listeria ）普遍存在于环境中，最新的分类学研究表明，其分为六个种：单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）绵羊（伊氏）李斯特氏菌（Listeria ivanovii）英诺克（无害）李斯特氏菌（Listeria innocua）斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri）威氏李斯特氏菌（Listeria welshimeri）格氏李斯特氏菌（Listeria grayi）在李斯特氏菌属的六个种中，只有两种致病菌：单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他动物发病。但是，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类的李斯特氏菌症（listeriosis）相关。因此，李斯特氏菌中最有检测意义的是单核增生李斯特氏菌。
LB和BLB

只有选择性没有区别性
LEB是在TSB-YE的基础上加入盐酸吖啶黄、萘啶酮酸和放线菌酮等选择性因子；加入的丙酮酸钠，有助于受损细胞的恢复；不含七叶灵和柠檬酸铁铵，无颜色反应 BLB是在LB基础上加入缓冲体系：磷酸二氢钾和磷酸氢二钠

检测程序---分离

分离培养基有：OXA、PALCOM、LPM、MOX 等。分离原理主要是基于李斯特氏菌具有β－D－葡萄糖苷酶的活性，能水解培养基中的七叶灵，产生七叶苷，与铁离子产生颜色反应而使菌落为棕褐色，并带有褐色晕圈，而致病性和非致病性李斯特氏菌病都能发生这种反应

单核细胞增生李斯特菌三种检测方法的比较

ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＴｈｒｅｅＭｅｔｈｏｄｓｏｆＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＤｅｔｅｃｉｔｏｎ
ＺＨＡＮＧＸｕａｎｒｏｎｇ，ＹＡＮＪｕｎ，ＬＩＷｅｎｌｏｎｇ，ＨＯＵＭｉｎ，ＪＩＡＮＧＶｕｊｉａ，ＢＵＳｈｕ，ＬＩＧｕｉｍａｎ
高、特异性强、快速高效和低成本，适合基层实验室应急检测和现场监测使用。
［关键词］国标法；ＬＡＭＰ；ＰＣＲ；单核细胞增生李斯特．５［文献标志码］Ａ［文章编号］１６７２ — ２３４５（２０１３）０６ — ００３８ — ０５
单核细胞增生李斯特菌三种检测方法的比较
张垣榕，颜军，李文龙，侯敏，蒋玉佳，卜舒，李桂满
（昆明市疾病预防控制中心，昆明６５０２２８）
［摘要］目的：通过比较国标法、ｒｅａｌ — ｔｉｍｅＰＣＲ法￣ＺＬＡＭＰ方法，得到适合基层实验室快速检测单核细胞增生李斯特菌的方法。方法：分别用国标法、ｒｅａｌ — ｔｉｍｅＰＣＲ法和环介导的等温扩增（１ｏｏｐ — ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）法检测李斯特菌，并进
ＧＢｌａｗ，ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲａｎｄＬＡＭＰｗｅｒｅａｄｏｐｔｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔＬＭ，ｔｈｅｎ，ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｅｖａｌｕａｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｔｈｒｅｅｍｏｔｈｏｄｓｗｅｒｅｑｕｉｔｅｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ．ＴｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｆＧＢｌａｗｔｏｏｋ５ｔｏ７ｄａｙｓ．Ｗｈｉｌｅｔｈｅｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲｒｅｑｕｉｒｉｎｇｈｉｇｈｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓａｎｄｃｏｓｔｔｏｏｋ２．５ｄａｙｓ．ＬＡＭＰｍｅｔｈｏｄ，ｒｅｑｕｉｉｒｎｇｌｏｗｅｘｐｅｉｒｍｅｎｔａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓａｎｄｃｏｓｔ，ｔｏｏｋｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅａｓｔｈｅｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴｈｅＬＡＭＰａｓｓａｙｗａｓａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｓｐｅｃｉｉｆｃ，ｒａｐｉｄａｎｄｅｃｏｎｏｍｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＬＭ，

单增李斯特菌检测技术

穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂。于明亮处观察洁净的血琼脂平板，单增李斯特菌和斯氏李斯特菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环，无害李斯特菌无溶血环，伊氏利斯特菌产生大的透明溶血环。注意：不要据此来区别李斯特氏各种菌，仅仅是一种溶血现象。用CAMP试验来确证李斯特氏各种菌。
单增李斯特菌溶血反应阳性对照：CMCC54004、
CMCC54007 阴性对照：英诺克李斯
特菌（Lin） L1：（-）；L2、L3、L4、
L5：（+）
协同溶血试验 (cAMP)
在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红
球菌 (R.equi), 在它们中两者之间垂直接种
可疑利斯特菌, 但不要触及它们, 于30℃培养24h～48 h, 检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。靠近金黄色葡萄球菌接种点的单核细胞增生李斯特菌的溶血增强, 斯氏李
初筛
在我们前期工作中发现，高污染样品在选择性琼脂平板上可疑菌落较多，为避免漏检和减少工作量，增加初筛步骤：挑取典型或可疑菌落接种在木糖、鼠李糖发酵管中，无须烧环同时TSA-YE平板上划线分离纯菌。
初筛及纯培养
自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典型或可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李糖发酵管，于37℃培养24h；同时在胰酪胨大豆琼脂培养基（TSA-YE）平板上划线纯化，于30℃培养24h-48h。木糖阴性为蓝色，鼠李糖阳性为黄色，在TSA-YE平板上可疑菌落为淡蓝色。
斯特菌（L.seeligeri）的溶血也增强, 而伊氏李斯特菌（L.ivanovii）在马红球菌附近的
溶血增强。
商业生化鉴定系统的应用
原国标中未涉及，FDA、AOAC标准使用API 10300、Vitek GNI（AOAC 989.13），这些方法都比较成熟，稳定性较好，已被许多国家和组织的标准采用。