十单核细胞增生李斯特氏菌检验标准操作程序

DBS22 DBS22/019-2012吉林省食品安全地方标准食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测2013年发布 2013年实施吉林省卫生厅发布前言本标准根据GB/T1.1-2000《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》的要求编写。

本标准分为两种检测方法：第一法：单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法；第二法：MPN计数法。

其中第一法适用于污染较严重的食品，第二法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较低而杂菌含量较高的食品。

本标准负责起草单位：吉林省疾病预防控制中心、长春市疾病预防控制中心。

本标准负责起草人:刘桂华、龚云伟、李月婷、赵薇吉林省食品安全地方标准食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测1 范围本操作程序规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的定量检验方法。

本操作程序适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定量检验。

2 设备和材料除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 冰箱：2℃～5℃和-18℃。

2.2 恒温培养箱：30℃±1℃、36℃±1℃。

2.3 均质器。

2.4 显微镜：10×～100×。

2.5 电子天平：感量0.1 g。

2.6 锥形瓶：100 mL、500 mL。

2.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。

2.8 无菌平皿：直径90 mm。

2.9 无菌试管：16 mm×160 mm.。

2.10 离心管：30 mm×100 mm。

2.11 无菌注射器：1 mL。

2.12 金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）。

2.13 马红球菌（Rhodococcus equi）。

2.14 全自动微生物生化鉴定系统。

3 培养基和试剂3.1 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE）：见附录A中A.1。

3.2 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）：见附录A中A.2。

3.3 李氏增菌肉汤LB（LB1，LB2）：见附录A中A.3。

3.4 1%盐酸吖啶黄（acriflavine HCl）溶液：见附录A中A.3.2.1。

3.5 1%萘啶酮酸钠盐（naladixic acid）溶液：见附录A中A.3.2.1。

3.6 PALCAM琼脂：见附录A中A.4。

3.7 革兰氏染液：见附录A中A.5。

3.8 SIM动力培养基：见附录A中A.6。

3.9 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红（MR）和V-P试验用]：见附录A中A.7。

3.10 5%-8%羊血琼脂：见附录A中A.8。

3.11 糖发酵管：见附录A中A.9。

3.12 过氧化氢酶试验：见附录A中A.10。

3.13 李斯特氏菌显色培养基。

3.14 API listeria 10300生化鉴定试剂盒。

第一法单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法4 检验程序单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法检验程序见图1。

图1 单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法检验程序5 操作步骤5.1 样品处理冷冻样品应在45℃以下不超过15 min或在2℃～5℃不超过18 h解冻，若不能及时检验，应放于-15℃左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于2℃～5℃冰箱保存，24 h内检验。

5.2 样品制备称取样品25g，放入盛有225mL PBS或生理盐水的无菌均质杯内，用旋转刀片式均质器以8000 r/min～10000 r/min均质1 min～2 min，或放入盛有225 mL PBS或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min。

若样品为液态，吸取25 mL 样品至盛有225 mL PBS或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀，作为1：10的样品匀液。

5.3 样品的稀释吸取上述1：10的样品匀液1 mL加到装有9 mL PBS或生理盐水的稀释管中，充分混匀制成1：100的样品匀液。

据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。

每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。

5.4 样品接种根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 接种量分别入三块李斯特显色或PALCAM琼脂培养基，然后用无菌L 棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。

使用前，如李斯特显色或PALCAM琼脂培养基表面有水珠，可放在25℃～50℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。

5.5 分离、培养在通常情况下，涂布后，将平板静置10 min。

如样液不易吸收，可将平板放在培养箱36℃±1℃培养1 h，等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，36℃±1℃培养24 h±2 h。

如果菌落不典型,可继续培养至48 h±2 h再观察。

在科玛嘉李斯特氏菌显色培养基上，典型菌落为小的圆形蓝色菌落，周围有白色晕圈（其它品牌李斯特氏菌显培养基上的菌落特征按照产品说明书判定）。

典型菌落在PALCAM琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷。

6 确证实验6.1 初筛自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典型或可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李糖发酵管于36℃±1℃培养24 h；同时在TSA-YE平板上划线纯化，于30℃±1℃培养24 h～48 h。

选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。

6.2鉴定6.2.1染色镜检：李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌，大小为（0.4 μm～0.5 μm）×（0.5 μm～2.0 μm）；用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。

6.2.2动力试验：李斯特氏菌有动力，呈伞状生长或月牙状生长。

6.2.3生化鉴定：挑取纯培养的单个可疑菌落，进行过氧化氢酶试验，过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验和MR-VP试验。

单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表1。

6.2.4溶血试验：将羊血琼脂平板底面划分为20个～25个小格，挑取纯培养的单个可疑菌落刺种到血平板上，每格刺种一个菌落，并刺种阳性对照菌（单增李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌）和阴性对照菌（英诺克李斯特氏菌），穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂，36℃±1℃培养24 h～48 h，于明亮处观察，单增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环，英诺克李斯特氏菌无溶血环，伊氏李斯特氏菌产生大的透明溶血环。

6.2.5协同溶血试验（cAMP）：在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌，挑取纯培养的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间，垂直线两端不要触及平行线，于30℃±1℃培养24 h～48 h。

单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌的接种端溶血增强，斯氏李斯特氏菌的溶血也增强，而伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌的接种端溶血增强。

6.2.6 可选择API listeria 10300生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统等生化鉴定系统。

7 结果计算7.1 典型菌落计数和确认7.1.1 选择有典型单核细胞增生李斯特氏菌平板，且同一稀释度3 个平板所有菌落数合计在20 CFU～200 CFU 之间的平板，计数典型菌落数。

如果：a）只有一个稀释度的平板菌落数在20 CFU～200 CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；b）所有稀释度的平板菌落数均小于20 CFU且有典型菌落，应计数最低稀释度平板上的典型菌落；c）某一稀释度的平板菌落数大于200 CFU 且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；d）若所有稀释度的平板菌落数大于200 CFU 且有典型菌落，应计数最高稀释度平板上的典型菌落；e）若所有稀释度的平板菌落数均不在20 CFU～200 CFU 之间且有典型菌落，其中一部分小于20 CFU 或大于200CFU 时，应计数最接近20 CFU 或200 CFU的稀释度平板上的典型菌落。

以上按公式（1）计算。

f）若2 个连续稀释度的平板菌落数均在20 CFU～200 CFU 之间，按公式（2）计算7.1.2从典型菌落中至少挑取5个典型菌落（小于5个全选），划线接种于营养琼脂平板做纯培养，30℃±1℃培养24 h±2 h。

7.2 结果计数公式（1）：T =CdAB…………………………………………………………… （1） 式中：T ——样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数；A ——某一稀释度单核细胞增生李斯特氏菌典型菌落的总数；B ——鉴定结果为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数；C ——用于单核细胞增生李斯特氏菌鉴定的菌落数； d ——稀释因子。

公式（2）： (2)式中：T ——样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数；A1——第一稀释度（低稀释倍数）单核细胞增生李斯特氏菌典型菌落的总数； A2——第二稀释度（高稀释倍数）单核细胞增生李斯特氏菌典型菌落的总数； B1——第一稀释度（低稀释倍数）鉴定结果为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数； B2——第二稀释度（高稀释倍数）鉴定结果为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数； C1——第一稀释度（低稀释倍数）用于单核细胞增生李斯特氏菌鉴定的菌落数； C2——第二稀释度（高稀释倍数）用于单核细胞增生李斯特氏菌鉴定的菌落数； 1.1——计算系数（如果第二稀释度单核细胞增生李斯特氏菌鉴定结果为0，计算系数采用1）； d ——稀释因子（第一稀释度）。

8 结果与报告8.1 根据李斯特氏菌显色培养基或PALCAM 琼脂平板上单核细胞增生李斯特氏菌的典型菌落数，按7中公式计算，报告每g （mL ）样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌数，以CFU/g(mL)表示；如T 值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。

第二法 单核细胞增生李斯特氏菌MPN 计数法9 检验程序单核细胞增生李斯特氏菌MPN 计数法检验程序见图2图2 单核细胞增生李斯特氏菌MPN 计数法检验程序.1d1222111C B A C B A T +=9.1 基于“三管”MPN法，取检样25 g（mL）加入装有225 mL LB1增菌液中，均质制成1:10稀释液，用灭菌吸管吸取1:10稀释液1 mL，注入含有9 mL LB1增菌液的试管内，振摇试管混匀，制备1:100的稀释液。

9.2 另取1 mL灭菌吸管，按上条操作依次制备10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1 mL灭菌吸管。

9.3 根据对检样污染情况的估计，选择三个连续的适宜稀释度（液体样品可选择原液），每个稀释度接种3支含有9 mL LB1增菌液的试管，每管接种1 mL（如果接种量超过1 mL，则用双料LB1增菌液）。