大肠菌群平板计数法
大肠菌群检测(MPN法)
大肠菌群检测(MPN法)大肠菌群检测(MPN法)是一种常用的微生物学技术，可用于检测土壤、水源、食品等中的大肠菌群进行水质和食品安全监测。
本文将介绍大肠菌群及其检测方法-最可能数法(MPN法)。
一、大肠菌群概述大肠菌群是以肠道菌属为主体的一类细菌，包括肠道埃希菌、沙门氏菌、志贺菌、伤寒杆菌等成员，它们可以在人类和动物的肠道中生存并繁殖。
在自然界中，大肠菌群也是广泛存在的微生物家族，如彗星菌、副肠杆菌、耶尔森氏菌等都属于大肠菌群。
1.菌落计数法该方法主要是利用琼脂平板培养皿在水培的条件下，大肠菌群在培养基上经不同时间的生长，形成菌落来进行菌数计数。
缺点是容易受到其他微生物的干扰，只能算出概略的数值，一定误差，没有国家标准。
2. 硝酸德钠试剂法将测样加硝酸德阳试剂进行加热，最终乳黄色的镜检测前进行比色，得出含大肠菌群的细菌群落达标后延迟显色的时间。
该方法已被最可能数(MPN)法所替代。
3. 最可能数法(MPN法)该方法先将测量的样品分别稀释到不同浓度下，再将每一份稀释液添加到以琼脂平板固化培养基为基础的不同培养液中，观察哪一份培养液出现大肠菌群的生长，最后通过MPN表格计算每85ml或100ml的水样中最可能含有的大肠菌群数量，计算公式为：10^x = n / 联合效价（即dilution rate的倒数）其中，x代表最可能数，n代表测量到大肠菌群的样品数。
在实际工作中，MPN法检测显示出了较好的结果，优点是用固定方法，可重复性好，而且可以通过相关将分析获得定量值，便于与相关的标准进行比较。
三、大肠菌群的检测范围1. 水源：大肠菌群检测是办公室里检测饮用水可能携带的最佳方法。
一般情况下，检测过程是检测水中的微生物是否合乎标准。
2.食品：由于食品生产经常存在卫生要求，因此食品也是大肠菌群检测重要的一环。
例如，必须检测火腿或肉类制品中的大肠菌群是否合格以确保食品安全。
3. 其他领域：大肠菌群检测可以用于医学、农业、环境和建筑等领域，如医院污水浑浊度的检测和土壤中大肠菌群的检测。
食品安全国家标准 大肠菌群计数
食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数1范围本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。
本标准适用于食品中大肠菌群的计数。
2术语和定义2.1 大肠菌群coliforms在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
2.2 最可能数most probable number，MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。
3检验原理3.1 MPN法MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。
待测样品经系列稀释并培养后，根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。
3.2 平板计数法大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色，带有或不带有沉淀环的菌落。
4 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：4.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。
4.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
4.3 恒温水浴箱：46℃±1℃。
4.4 天平：感量0.1 g。
4.5 均质器。
4.6 振荡器。
4.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。
4.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。
4.9 无菌培养皿：直径90 mm。
4.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。
4.11 菌落计数器。
5 培养基和试剂5.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A 中A.1。
5.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A 中A.2。
5.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：见附录A 中A.3。
5.4 磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.4。
5.5 无菌生理盐水：见附录A 中A.5。
5.6 无菌1 mol/L NaOH：见附录A 中A.6。
大肠菌群平板计数法检验流程
大肠菌群平板计数法检验流程
朋友！今天咱来唠唠这大肠菌群平板计数法的检验流程。
先说准备工作哈，这可重要啦！得把那些培养皿、移液器啥的都准备好。
我跟你说，我刚开始学的时候，就老忘这忘那的，被师傅好一顿骂！
然后呢，就是取样。
这取样可得小心，千万别弄撒了，不然又得重来，那可烦死个人！我记得有一次，我手一抖，样本撒了一地，唉，当时我那个心呐，哇凉哇凉的。
接下来就是接种啦！这一步可得仔细，就跟绣花似的。
我记得好像是用移液器吸取一定量的样品，加到培养皿里。
不过也可能记错喽，嘿你可得自己多注意。
培养的时候，你就等着吧。
这期间你可别着急，着急也没用。
我以前就老着急，总想着快点出结果，结果啥也没弄好。
等培养好了，就开始计数啦！这时候你得瞪大眼睛，一个一个数清楚。
要是数错了，那可就白忙活了。
哦，对了！之前说的取样，一定要保证无菌操作，不然结果就不准啦！这可是关键中的关键。
我跟你讲，这检验流程啊，就得多练。
我刚开始也是笨手笨脚的，现在不也熟练了嘛！
要是你在操作过程中遇到啥问题，别慌，慢慢琢磨，或者来问我也行。
我这又扯远啦，反正按照这步骤来，多练几次，你肯定能掌握！怎么样，朋友，加油干吧！。
大肠菌群平板计数法的注意事项
大肠菌群是经常用来衡量食品卫生情况的重要指标，绝大部分食品都会要求检测的项目。
在食品微生物实验室里，大肠菌群和菌落总数的检测频次应该是最高的，但检测过程中总会有一些小问题困扰着大家，以下来讲解一下大肠菌群平板计数法的注意事项。
方法选择相比于MPN计数法，平板计数法更适用于大肠菌群含量较高的食品。
但大肠菌群多少算是含量较高呢国标里没有明确规定，但通常认为，产品大肠菌群以100CFU/g（mL）为界，超过这个含量一般认为是含量较高。
但具体什么时候选用平板计数法进行大肠菌群的检测，大部分情况还是要看你的产品执行的标准。
假如产品标准要求大肠菌群含量的单位为CFU/g（mL），那必须选用平板计数法。
若是/g(mL)或者MPN/100g(mL)，就应选择MPN计数法，MPN法具体选用哪版国标此处不再赘述。
因此，根据自己产品的情况选择适当的检测方法。
培养基的要求平板计数法使用的培养基为结晶紫中性胆盐琼脂培养基，简称VRBA。
无论是国标，还是培养基的使用说明中都明确表示，VRBA是不需要进行灭菌的，煮沸2min即可使用。
特地点出这一点是因为很多朋友都在问VRBA的灭菌条件，对不灭菌的培养基不信任，害怕出现检测异常，那是因为这些小伙伴们对其中的原理不清楚。
大肠菌群的定义是在一定培养条件下能够在发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，因此大肠菌群是不能形成芽孢的，在VRBA培养基煮沸的过程中，即使有大肠菌群存在也会被杀灭，所以从培养基带入污染的可能性是没有的。
当然盛装培养基的容器是需要进行灭菌的，以免容器引入污染。
另外，VRBA是一种选择性的培养基，含有的结晶紫对革兰氏阳性菌有比较强的抑制作用而对革兰氏阴性菌几乎没有作用，而且平板培养产生的菌落还需要进行复发酵的验证，因此VRBA培养基就不需要进行灭菌了。
但值得注意的是，VRBA需要现配现用，配制出的培养基应当在3h之内使用完毕。
稀释度的确定国标中要求选择2-3个适宜的连续稀释度。
大肠菌群平板计数法方法学验证报告
GB 4789.3-2016大肠菌群平板计数法方法学验证报告一、验证目的验证GB4789.3-2016《食品微生物学检验大肠菌群计数（大肠菌群平板计数法）》在本实验室的适用性。
二、验证方法本实验样品取不同不同类型产品进行实验，严格按照GB4789.3-2016进行，除上述实验程序外，为保证本次验证的科学性和准确性，本次实验添加阳性对照组，对照组由标准菌株大肠埃希氏菌（CICC10389）接种培养而成，与样品实验程序同时进行。
三、验证设备和试剂1.冰箱：BCD-212DG/A 海信（北京）电器2.生化培养箱：LRH-70 上海一恒科学仪器3.电位pH计：PHS-3C+（精确度0.01）成都世纪方舟科技有限公司4.无菌均质器：SCIENTZ-04 宁波新芝生物科技有限公司5.恒温振荡器：SHA-A 江苏金坛环宇科学仪器厂6.菌落计数仪：Scan-500 北京五洲东方科技发展有限公司7.天平:JE-502 上海浦春计量仪器有限公司8.超净工作台:SW-CJ-2FD 上海博迅实业9.显微镜：B203LED 重庆奥特光学仪器有限公司培养基和试剂：1.结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）北京陆桥技术股份有限公司2.煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤北京陆桥技术股份有限公司3.无菌生理盐水：同GB 4789.3项下制法。
四、验证环境1.依据《消毒与灭菌效果的评价方法与标准GB15981-1995》定期对高压蒸汽灭菌锅的灭菌效果进行检测评价并记录；2.依据《无菌室消毒灭菌操作规程》定期对对无菌室、超净台进行清洁消毒灭菌并记录；3.依据《实验室质量控制规范食品微生物检测GB/T27405-2008》定期对对无菌室及超净台进行沉降菌检测并记录；4.无菌室检验：详见《xxxx》；五、验证步骤1.样品的稀释1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品放入盛有225 mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成1:10 的样品匀液。
10食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程
规范食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程。
2范围本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。
本标准适用于食品中大肠菌群的计数。
3术语和定义3.1 大肠菌群coliforms在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
3.2 最可能数most probable number，MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。
4责任质量部组织制订、化验室负责实施。
5内容5.1 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：5.1.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。
5.1.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
5.1.3 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。
5.1.4 天平：感量0.1 g。
5.1.5 均质器。
5.1.6 振荡器。
5.1.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。
5.1.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。
5.1.9 无菌培养皿：直径90 mm。
5.1.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。
5.1.11 菌落计数器。
5.2培养基和试剂5.2.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A 中A.1。
5.2.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A 中A.2。
5.2.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：见附录A 中A.3。
5.2.4 磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.4。
5.2.5 无菌生理盐水：见附录A 中A.5。
5.2.6 无菌1 mol/L NaOH：见附录A 中A.6。
5.2.7 无菌1 mol/L HCl：见附录A 中A.7。
5.3大肠菌群MPN 计数法5.3.1 检验程序大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。
大肠菌群计数
2
0
3
2
1
3
2
2
3
2
3
3
3
0
3
3
1
3
3
2
3
3
3
MPN
21 28 35 29 36 23 38 64 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 >1100
95%置信区间
低
高
4.5
42
8.7
94
8.7
94
8.7
94
8.7
94
4.6
94
8.7 110
17
180
9
180
平板菌落数的选择
选择菌落数在30~150之间的平板，分别计 数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。
典型菌落为紫红色，菌落周围有胆盐与酸形 成的沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。
证实试验
从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和 可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，进 行证实试验。
BGLB肉汤管产气者，所对应的菌落即为大 肠菌群阳性菌落。
36℃±1℃
18~24h
计数典型和可疑菌落
注：VRBA(结晶紫中性 红胆盐琼脂)又称为： VRB或VRBL
BGLB肉汤证实试验
36℃±1℃
18~24h
报告结果
操作要点
样品稀释同第一法。
选取适宜的2~3个连续稀释度, 每个稀释度 接种两个灭菌平皿, 每皿1mL。另取1mL生 理盐水做个空白对照。将冷至46℃的结晶 紫中性红胆盐琼脂(VRBA)约15mL倾注于每 个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样 液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL~4 mLVRBA覆盖平板表层。
大肠菌群检测中平板计数法主要操作要领
大肠菌裙检测是一项非常重要的微生物检测工作，它可以帮助我们了解环境和食品中是否存在大肠菌裙，从而保证人们的健康安全。
在大肠菌裙检测中，平板计数法是一种常用的检测方法。
下面将介绍大肠菌裙检测中平板计数法的主要操作要领。
1.准备工作在进行大肠菌裙检测之前，需要准备相应的实验器材和培养基。
实验器材包括平板计数仪、移液器、无菌培养皿等。
培养基一般选择大肠埃希氏菌（EC）培养基。
2.样品处理将待测样品取适量放入无菌容器中，进行适当的稀释。
这一步要确保样品的稀释倍数适中，以保证后续的计数结果准确。
3.接种和培养取一定量的处理过的样品，在无菌工作台上均匀涂抹于含有适量培养基的培养皿上，然后进行培养。
培养条件一般为37摄氏度，培养时间为24小时。
培养后会形成菌落，这些菌落代表了原始样品中的细菌数量。
4.计数和记录在培养后，利用平板计数仪对菌落进行计数。
计数的时候需要注意避免重复计数同一菌落，保证计数准确。
需要记录计数结果，包括菌落数量和相应的单位。
5.结果分析根据计数结果，可以对原始样品中的大肠菌裙数量进行估算。
可以通过对对照组和样品组的比较来判断样品中大肠菌裙的数量是否合格。
大肠菌裙检测中平板计数法的主要操作要领就是以上几点。
通过严格按照这些要领进行操作，可以确保检测结果的准确性和可靠性。
在进行操作过程中，还需要遵守无菌操作规范，确保实验过程中不受外界污染。
希望大家在进行大肠菌裙检测时能够严格按照操作要领进行，保证测试结果的准确性，从而更好地保障人们的健康安全。
大肠菌裙检测中的平板计数法是一种经典的微生物计数方法，它主要用于测定食品、饮用水、环境等样品中大肠菌裙的数量。
在这个过程中，我们需要注意几个关键的环节，来保证实验的准确性和结果的可靠性。
在准备工作环节，我们需要保证实验器材和培养基的质量。
实验器材一定要经过严格的消毒和清洁，以免外来细菌的污染影响实验结果。
培养基的选用也尤为重要，要选择与待测细菌的生长要求相适应的培养基，以保证细菌在培养基上的正常生长。
饮料—大肠菌群的测定—平板计数法
3.3 乳糖发酵管 3.3.1 成分
蛋白胨
20g
乳糖
10g
0.04％溴甲酚紫水溶液
25mL
蒸馏水 3.3.2 制法
1000mL
将蛋白胨及乳糖溶于水中,校正 pH7.4,加入指示剂,分装 3mL,并放入一个小倒管,115℃高
压灭菌 15min。
3.4 EC 肉汤
3.4.1 成分
1
胰蛋白胨
20g
3 号胆盐(或混合胆盐)
匀稀释液。
5.2.2 用 1 mL 灭菌吸管吸取 1：10 稀释液 1 mL，注入含有 9 mL 灭菌生理盐水或其他稀释
液的试管内，振摇试管混匀，做成 1：100 的稀释液。
5.1.3 另取 1 mL 灭菌吸管，按上条操作依次做 10 倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用 1
支 1 mL 灭菌吸管。
5.1.4 根据饮料卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种 3 管。
FSPYL026 饮料 大肠菌群的测定 平板计数法
F_SP＿ YL＿026
饮料—大肠菌群的测定—平板计数法
1 范围 本方法采用平板计数法测定饮料中的大肠菌群。
本方法适用于饮料中大肠菌群的测定，饮料中大肠菌群数系以 １００ ｍＬ（ｇ）检样内大肠
菌群最可能数（ＭＰＮ）表示。
2 原理
饮料检样经处理，在需氧及兼性厌氧、37℃条件下培养，通过计数报告检样中大肠菌群 最可能数。大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
3.2.1 成分
蛋白胨
10g
乳糖
10g
磷酸氢二钾
2g
琼脂
17g
2%伊红 Y 溶液
20mL
大肠菌群计数
4. 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样 品匀液1mL，沿管壁缓缓注入装有9mL磷酸 盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸 管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试 管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其 混合均匀，制成1:100的样品匀液。
5. 根据对样品污染情况的估计,按上述操作， 依次制成系列十倍递增系列稀释样品匀液。 每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或 吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全 过程不得超过15min。
1.本表采用三个稀释度【0.1g(ml),0.01g(ml),0.001g(ml),】每个稀释度接种三管。
2.表内所列检样量如改用 1g (ml),0. 10 1 3 0 16 4.5 1g(ml),0.01g(ml), 42 3 2 表内数字相应降低 1 150 37 倍；420
2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1,000
2 0.01g(ml),0.001g(ml),0.0001g(ml) 0 0 9.2 1.4 38 时，则表内数字应相应增高 3 2 2 210 10倍，其余类推。 40 430 如改用
稀释度的选择
将待检样品选取适宜的2~3个连续稀释度, 每个稀释度接种两 对照。及时将15mL~ 20mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂
0.001 0 1 0
1 0 0 0 1 2 0 1 0 1
高 9.5 9.6 11
18 18 38 18 18 38 20 38 42 42
0.01 2 2 2
3 3 0 0 0 1 1 1 1 2
0.001 0 1 2
0 1 0 1 2 0 1 2 3 0
MPN
95%置信区间 低 4.5 8.7 8.7
食品安全国家标准——食品微生物学检验大肠菌群计数.pdf
食品安全国家标准食品微生物学检验 大肠菌群计数1 范围本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。
本标准适用于食品中大肠菌群的计数。
2 术语和定义2.1 大肠菌群coliforms在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
2.2 最可能数most probable number，MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。
3 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。
3.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
℃℃。
3.3 恒温水浴箱：46 ±13.4 天平：感量0.1 g。
3.5 均质器。
3.6 振荡器。
3.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。
3.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。
3.9 无菌培养皿：直径90 mm。
3.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。
3.11 菌落计数器。
4 培养基和试剂4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A中A.1。
4.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A中A.2。
4.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：见附录A中A.3。
4.4 磷酸盐缓冲液：见附录A中A.4。
4.5 无菌生理盐水：见附录A中A.5。
4.6 无菌1 mol/L NaOH：见附录A中A.6。
4.7 无菌1 mol/L HCl：见附录A中A.7。
第一法 大肠菌群MPN计数法5 检验程序大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。
图1 大肠菌群MPN计数法检验程序6 操作步骤6.1 样品的稀释6.1.1 固体和半固体样品：称取25 g样品,放入盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内, 8000 r/min～10000 r/min均质1 min～2 min,或放入盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成1:10的样品匀液。
大肠菌群平板计数法的注意事项
大肠菌群平板计数法的注意事项大肠菌群是经常用来衡量食品卫生情况的重要指标，绝大部分食品都会要求检测的项目。
在食品微生物实验室里，大肠菌群和菌落总数的检测频次应该是最高的，但检测过程中总会有一些小问题困扰着大家，以下来讲解一下大肠菌群平板计数法的注意事项。
方法选择相比于MPN计数法，平板计数法更适用于大肠菌群含量较高的食品。
但大肠菌群多少算是含量较高呢国标里没有明确规定，但通常认为，产品大肠菌群以100CFU/g（mL）为界，超过这个含量一般认为是含量较高。
但具体什么时候选用平板计数法进行大肠菌群的检测，大部分情况还是要看你的产品执行的标准。
假如产品标准要求大肠菌群含量的单位为CFU/g（mL），那必须选用平板计数法。
若是/g(mL)或者MPN/100g(mL)，就应选择MPN计数法，MPN法具体选用哪版国标此处不再赘述。
因此，根据自己产品的情况选择适当的检测方法。
培养基的要求平板计数法使用的培养基为结晶紫中性胆盐琼脂培养基，简称VRBA。
无论是国标，还是培养基的使用说明中都明确表示，VRBA是不需要进行灭菌的，煮沸2min即可使用。
特地点出这一点是因为很多朋友都在问VRBA的灭菌条件，对不灭菌的培养基不信任，害怕出现检测异常，那是因为这些小伙伴们对其中的原理不清楚。
大肠菌群的定义是在一定培养条件下能够在发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，因此大肠菌群是不能形成芽孢的，在VRBA培养基煮沸的过程中，即使有大肠菌群存在也会被杀灭，所以从培养基带入污染的可能性是没有的。
当然盛装培养基的容器是需要进行灭菌的，以免容器引入污染。
另外，VRBA是一种选择性的培养基，含有的结晶紫对革兰氏阳性菌有比较强的抑制作用而对革兰氏阴性菌几乎没有作用，而且平板培养产生的菌落还需要进行复发酵的验证，因此VRBA 培养基就不需要进行灭菌了。
但值得注意的是，VRBA需要现配现用，配制出的培养基应当在3h之内使用完毕。
大肠菌群平板计数法标准号
大肠菌群平板计数法标准号大肠菌群平板计数法是指在实验室条件下，通过将待检样品分散在含有特定培养基的平板上，利用培养基对大肠菌群产生的特异性反应，以及对大肠菌群可生长的特定条件进行培养和计数，从而评估样品中大肠菌群的数量。
该方法已被广泛应用于食品、环境和医疗卫生等领域的微生物检测。
大肠菌群平板计数法标准号是《食品微生物学通则》GB 4789.3-2016。
该标准是由中国国家标准化管理委员会于2016年发布的，是用于食品微生物检测的基本规范。
根据该标准，大肠菌群平板计数法的操作流程主要包括样品制备、平板培养、菌落计数和结果表达。
下面将对每个步骤进行详细介绍。
首先，样品制备是指将待检样品进行预处理，以提高大肠菌群的检测效果。
根据不同样品的特点，可以采取不同的处理方法，如加入适量的缓冲液进行搅拌均匀、加热杀菌和稀释等。
此外，还需要注意样品制备过程中的卫生要求，以防止交叉污染。
然后，将样品均匀地分散在含有选择性培养基的平板上。
选择性培养基可以抑制非大肠菌群的生长，从而增加大肠菌群在平板上的菌落形成，方便后续的计数。
常用的选择性培养基有MacConkey琼脂、立兰肠杆菌培养基等。
接下来，将含有样品的平板置于适宜的温度和湿度条件下进行培养。
大肠菌群在一定的温度范围内可迅速繁殖，通常将培养温度控制在37摄氏度。
此外，还需要为培养提供适当的湿度，可以通过在培养箱内放置含水的培养皿或湿度控制器来实现。
菌落计数是大肠菌群平板计数法的核心步骤。
通常，在培养一定时间后，将平板上的菌落进行计数。
菌落计数可以手工进行，也可以使用计数仪来实现。
在进行计数时，需要注意区分出不同的菌落，并排除其他非大肠菌群的菌落。
最后，根据菌落计数的结果，可根据标准对样品中大肠菌群的数量进行评估。
通常，大肠菌群的计数结果以CFU/g（或CFU/mL）表示，即每克（或每毫升）样品中大肠菌群的菌落数。
需要注意的是，大肠菌群平板计数法在应用中存在一定的局限性。
大肠菌群平板计数法原始记录
校核人员： 检验人员： 年 月 日
样品名称检验方法gb47893平板计数法收样日期使用仪器设备名称型号精度设备编号状态电热恒温培养箱hhb11420sb005正常不正常检验项目操作步骤及培养条件空白对照检验结果cfugml样品稀释倍数原液10vrba平板试验361培养18h24h典型菌落数bglb肉汤试验361培养24h48h样品稀释倍数原液10vrba平板试验361培养18h24h典型菌落数bglb肉汤试验361培养24h48h样品稀释倍数原液10vrba平板试验361培养18h24h典型菌落数bglb肉汤试验361培养24h48h样品稀释倍数原液10vrba平板试验361培养18h24h典型菌落数bglb肉汤试验361培养24h48h样品稀释倍数原液10vrba平板试验361培养18h24h典型菌落数bglb肉汤试验361培养24h48h备注校核人员
原液
10倍
100倍
VRBA平板试验36℃±1℃培养18h±24h
典型菌落数
BGLB肉汤试验36℃±1℃培养24h±48h
样
2
样品稀释倍数
原液
10倍
100倍
VRBA平板试验36℃±1℃培养18h±24h
典型菌落数
BGLB肉汤试验36℃±1℃培养24h±48h
样
3
样品稀释倍数
原液
10倍
100倍
VRBA平板试验36℃±1℃培养18h±24h
典型菌落数
BGLB肉汤试验36℃±1℃培养24h±48h
样
4
样品稀释倍数
原液
10倍
100倍
VRBA平板试验36℃±1℃培养18h±24h
典型菌落数
BGLB肉汤试验36℃±1℃培养24h±48h
大肠菌群检验原始记录-平板计数法5样
10-1
24 26 10
10-2
3
2
0
10-3
0
0
0
BGLB 阳性管数
6
稀释度
第一稀释度 第二稀释度 第三稀释度
样
品 VRBA 疑似大肠菌群菌落数
5
接种 BGLB 管数
10-1
20 22 10
10-2
1
2
0
10-3
0
0
0
BGLB 阳性管数
7
VRBA 空白（仅 VRBA）
-
-
空 白
稀释液空白（稀释液+VRBA）
样品名称
xxxx
样品批次
2022xxxx
仪器设备及耗材： 天平：( xxxx) 培养箱: ( xxxx)
洁净工作台: (xxxx)
培养基及试剂： 结晶紫中性红胆盐琼脂培养基（VRBA）： xxxx 煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）： xxxx 磷酸盐缓冲液：xxxx 0.1mol/L 氢氧化钠：
配制日期 2022/xx/xx 配制日期 2022/xx/xx 配制日期 2022/xx/xx 配制日期：2022/xx/xx
实验过程： 1.样品处理和稀释： 1.1 如需要，使用 0.1mol/L 氢氧化钠或 0.1mol/L 盐酸将样品调整 pH 在 6.5~7.5 之间。 1.2 制备样品稀释液
根据样品状态，无菌操作，称取/吸管吸取 25g（mL）样品，加入到 225mL 无菌磷酸盐缓冲液中均质（混 匀），制成 1:10 样品匀液。根据对样品污染情况的估计，按上述操作将样品稀释至所需浓度。 2.接种 VRBA
-
-
BGLB 空白（仅 BGLB）
-
-
大肠菌群平板计数法检测结果不确定度的评定
152 食品安全导刊 2017年8月Tlogy科技科技文苑大肠菌群是一组存在于肠道中的与粪便污染有关的细菌，通常用来作为评价食品卫生状况的指示菌。
食品中大肠菌群数量的高低与受粪便污染的程度相关，大肠菌群也可以预示食品中存在肠道致病菌的可能性。
由测量所得的测得值只是被测量的估计值，测量过程中的随机效应及系统效应会导致测量不确定度[1]。
对大肠菌群检测结果的测量不确定度进行评定，能以充分完整的信息表示检测结果，提高大肠菌群检测结果的可信度。
1 不确定度评定方法采用《GB 4789.3-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》[2]中第二法平板法进行检测，主要检测步骤如下：样品制备—10倍梯度稀释—选取2～3个合适稀释度的样品匀液接种—倾注VRBA 平板—计数典型和可疑菌落数—接种BGLB 肉汤—报告结果。
本文对奶粉样品进行大肠菌群人工污染后进行10次重复测定，以此结果为依据，分析不确定度各分量的来源和大小，并参照JJF1059.1-2012《测量结果不确定度的评定与表示》做不确定度评定。
2 各不确定度分量的评定2.1 样品制备过程中引入的不确定度样品制备过程中，可能引入不确定度的因素有样品称量、量筒量取稀释液、均质器均质等。
用均质器进行拍击均质，拍击时间和拍击速度是固定的，可以忽略由此产生的不确定度。
电子天平精度0.1 g，样品称样量25.0 g，检定证书规定的最大允许误差为±0.5 g。
则天平称量的标准不确定度μ（ｍ样）为：用250 mL 量出式量筒量取225 mL 稀释液，制成1︰10的样品匀液。
量筒按JJG196-2006常用玻璃量器的容量允差为±2.0 mL [3]，则量筒量取的标准不确定度μ（ｖ样）为：因此，电子天平和量筒的相对标准不确定度U rel （m 样）和U rel （v 样）分别为：则样品制备过程中产生的相对标准不确定度为：大肠菌群平板计数法检测结果不确定度的评定□ 徐武俊 吕腾飞 李仕祥 刘伟平 江西出入境检验检疫局综合技术中心摘 要：通过对《GB 4789.3-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》第二法平板法中不确定度来源进行分析和计算，得出检测结果的不确定度为U=0.057 54，k=2.26，主要影响因素是样品制备、样品稀释、加样和重复检测，其中重复检测对检测结果不确定度的贡献最大。
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大肠菌群平板计数法集团标准化小组：[VVOPPT-JOPP28-JPPTL98-LOPPNN]
大肠菌群平板计数法
一、操作步骤
1.样品的稀释
2.选取2个～3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。
同时取1mL 生理盐水加入无菌平皿作空白对照。
3.及时将15mL～20mL冷至46 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。
小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆盖平板表层。
翻转平板，置于36 ℃±1 ℃培养18h～24h。
4.平板菌落数的选择
选取菌落数在15CFU～150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。
典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。
5.证实试验
从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36℃
±1℃培养24h～48h，观察产气情况。
凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
6.大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。
例：10-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105CFU/g（mL）。