大肠菌群平板计数法

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大肠菌群平板计数法的注意事项

大肠菌群是经常用来衡量食品卫生情况的重要指标，绝大部分食品都会要

求检测的项目。在食品微生物实验室里，大肠菌群和菌落总数的检测频次应该是最高的，但检测过程中总会有一些小问题困扰着大家，以下来讲解一下大肠

菌群平板计数法的注意事项。

方法选择

相比于MPN计数法，平板计数法更适用于大肠菌群含量较高的食品。但大肠菌群多少算是含量较高呢国标里没有明确规定，但通常认为，产品大肠菌群以100CFU/g（mL）为界，超过这个含量一般认为是含量较高。但具体什么时候选用平板计数法进行大肠菌群的检测，大部分情况还是要看你的产品执行的标准。假如产品标准要求大肠菌群含量的单位为CFU/g（mL），那必须选用平板计数法。若是/g(mL)或者MPN/100g(mL)，就应选择MPN计数法，MPN法具体选用哪版国标

此处不再赘述。因此，根据自己产品的情况选择适当的检测方法。

培养基的要求

平板计数法使用的培养基为结晶紫中性胆盐琼脂培养基，简称VRBA。无论是国标，还是培养基的使用说明中都明确表示，VRBA是不需要进行灭菌的，煮沸2min即可使用。特地点出这一点是因为很多朋友都在问VRBA的灭菌条件，对不灭菌的培养基不信任，害怕出现检测异常，那是因为这些小伙伴们对其中的原理不清楚。大肠菌群的定义是在一定培养条件下能够在发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，因此大肠菌群是不能形成芽孢的，在VRBA培养基煮沸的过程中，即使有大肠菌群存在也会被杀灭，所以从培养基带入污染的可能性是没有的。当然盛装培养基的容器是需要进行灭菌的，以免容器引入污染。另外，VRBA是一种选择性的培养基，含有的结晶紫对革兰氏阳性菌有比较强的抑制作用而对革兰氏阴性菌几乎没有作用，而且平板培养产生的菌落还需要进行复发酵的验证，因此VRBA培养基就不需要进行灭菌了。但值得注意

大肠菌群平板计数法

一、操作步骤

1.样品的稀释

2.选取2个～3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1mL 生理盐水加入无菌平皿作空白对照。

3.及时将15 mL～20 mL冷至46 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL～4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。

4.平板菌落数的选择

选取菌落数在15 CFU～150 CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm 或更大。

5.证实试验

从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，36 ℃±1 ℃培养24 h～48 h，观察产气情况。凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。

6.大肠菌群平板计数的报告

经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：

100×6/10×104/g（mL）=6.0×105CFU/g（mL）

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大肠菌群平板计数法实验报告

一、实验目的

本实验旨在通过大肠菌群平板计数法，检测两种不同类型的样品，分

别研究其大肠菌群的数量。

二、实验原理

大肠菌群平板计数法是一种测定复合微生物群落中不同细菌种群数量

的方法，通过在培养基上培养细菌分离特定细菌和其他微生物，然后在培

养基表面形成菌落，把形成的菌落数目统计出来就可以测定某一种细菌的

数量。

三、实验材料

1.无菌培养环：用于现场取样，主要成分是聚丙烯，尺寸为20

cm×40 cm；

2.筛选液：用于本实验的筛选液是根据微生物学原理，采用等量的乳

酸盐，氯化钠和磷酸盐等有机物质制备而成的液体，用于筛选出大肠菌群；

3.抗生素优势培养基：用于本实验，培养基由甘露醇、尿素、抗生素

等制备而成，用于培养出大肠菌群；

4.保存液：用于本实验的液体是根据微生物学原理，采用等量的乳酸盐、氯化钠和磷酸盐等有机物质制备而成，用于保存细菌；

5.透明细菌示踪液：用于本实验，示踪液由甘露醇、尿素、抗生素等

有机物质制备而成，用于追踪细菌的繁殖情况。

四、实验步骤

1.采样：用无菌环把样品和筛选液放在瓶中，搅拌均匀，然后加入适量。

计量大肠菌群数量的计数方法

大肠菌群是指在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。

直接或间接来自人与温血动物的肠道：包括肠杆菌科的大肠埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属和克雷伯菌属，其中大肠埃希氏菌属为最典型大肠埃希氏菌。

一、卫生学意义

人与温血动物粪便污染的指示菌：

•大肠埃希氏菌——粪便近期污染；

•其他菌属——粪便陈旧污染。

肠道致病菌污染食品的指示菌：

•与肠道致病菌（如沙门氏菌、志贺氏菌）来源相同；在外界生存的时间与主要肠道致病菌一致。

二、修订的主要内容

本标准与GB4789.2-2010相比，主要修改如下：

1、删除了标准的英文名称

2、修改了发布单位名称

2010版本“中华人民共和国卫生部”

2016版本“中华人民共和国国家卫生盒计划生育委员会”和“国家食品药品监督管理总局”

3、前言：

本标准代替GB4789.3—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》、GB/T4789.32—2002《食品卫生微生物学检验大肠菌群的快速检测》和SN/T0169—2010《进出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测

方法》大肠菌群计数部分。

本标准与GB4789.3—2010相比,主要变化如下:

———增加了检验原理;

———修改了适用范围;

———修改了典型菌落的形态描述;

———修改了第二法平板菌落数的选择;

———修改了第二法证实试验;

———修改了第二法平板计数的报告。

三、大肠菌群计数的两种方法

第一法MPN法

适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数。

检验原理：MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后,根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度,应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。

肉制品中大肠菌群的检验—第二法大肠菌群平板计数法

大
1. 样品的稀释
肠菌
同大肠菌群MPN计数法中的样品稀释操作。
群平
2. 样品的接种和培养
板计
2.1 选取2个~3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿,每皿1mL。
数
法同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。
2.2 及时将15mL~20mL融化并恒温至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)约
观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气,即可报告为大肠菌群阳性。
五、大肠菌群平板计数检样操作Baidu Nhomakorabea骤
大
5. 大肠菌群平板计数的报告
肠菌
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以3中计数的平板菌落数,再乘以
群平
稀释倍数,即为每g(mL)样品中大肠菌群数。
板计
例:10-4样品稀释液1mL,在VRBA 平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中
数法
10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为：
100×6/10×104/g(mL)=6.0×105CFU/g(mL)。若所有稀释度(包括液体样品原
液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
可疑大肠菌群菌落(如菌落直径较典型菌落小)。典型菌落为紫红色,菌落周围有
板计
红色的胆盐沉淀环,菌落直径为0.5mm或更大,最低稀释度平板低于15CFU 的记

大肠菌群平板计数法方法学验证报告

实验步骤如下：

1.准备培养基：将大肠杆菌选择培养基加入培养基瓶中，并用自来水

洗净外面的杂质，随后用蒸馏水冲洗内表面。将瓶口用无菌布覆盖，用锡

箔纸包好，然后高温高压灭菌，储存在无菌环境中备用。

2.取少量待检样品：将待检食品样品（例如牛奶、蔬菜、饮用水等）

取一适量，在无菌的条件下进行操作。先将样品摇匀使其均匀分布，然后

用无菌吸管取1毫升待检样品。

3.稀释样品：用无菌吸管将1毫升待检样品转移至无菌试管中，再向

试管分别加入9毫升无菌生理盐水，摇匀使其均匀混合。此时的样品为

10倍稀释样品，将试管中的液体倒入下一个试管中，再加入9毫升无菌

生理盐水，以此类推，制备出一系列浓度递减的稀释样品。

4.接种培养基：将每个稀释样品分别倒入标记好的平板培养基上，倒

入后轻轻晃动，使其均匀分布在培养基上，然后在无菌工作台上用无菌铂

丝铲取纱球大小的韧带状菌液涂抹在固体培养基表面，使细菌均匀生长。

5.培养和计数：将培养基板反面朝上，放入37°C恒温培养箱中进行

培养，培养的时间一般为24小时。待培养结束后，观察培养基表面是否

出现典型的大肠菌群菌落。使用菌落计数器对每个平板上的菌落进行计数。

根据以上实验步骤进行大肠菌群平板计数法的实验后，得出以下结论：

1.适用性验证：通过本实验，我们可以验证大肠菌群平板计数法的适

用性。在我们的实验中，使用该方法对不同类型的食品样品进行了检测，

并得出了相应的菌落计数。这表明该方法适用于不同类型的样品，可以准确地测定大肠菌群数量。

2.优点：大肠菌群平板计数法具有以下优点：简单易行，操作方便；可定量测定大肠菌群数量，结果可靠；适用于不同类型的食品样品。

大肠菌群检测(MPN法)

移1ml
101
102
均质器固体样品
225ml生理盐水
9ml生理盐水
各1ml
各1ml
103
9ml生理盐水
各1ml
各10mL LST
接种
25mL
玻璃珠
液体样品
225ml 生理盐水
其他相同
产气管
10mL BGLB
大肠菌群计数MPN法操作 MPN法
LST不产气（-）小导管里无气泡
LST产气（+）
大肠菌群计数MPN法流程图
GB 4789.3-2016（第一法）
检样
稀释
月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）36±１℃，24~48±2h
不产气
产气煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 36±１℃，24~48±2h
不产气大肠菌群阴性
产气大肠菌群阳性
报告
初发酵复发酵
大肠菌群计数MPN法示意图
25g
移1ml
有肠道致病菌（如大肠杆菌O157、沙门氏菌、志贺氏菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌等），因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。大肠菌群数量越多则肠道致病菌存在的可能性就越高，但两者之间并不总是呈平行关系。通常情况下，粪大肠菌群与大肠菌群，在人和动物粪便中所占的比例较大，而且由于在自然界容易死亡等原因，粪大肠菌群的存在可认为食品直接或间接的受到了比较近期的粪便污染。因而，粪大肠菌群在食品中的检出，与大肠菌群相比，说明食品受到了更为不清洁的加工，肠道致病菌和食物中毒菌的可能性更大。

食品大肠菌群的测定(平板计数法).

• 任务七结果报告 • 经最后证实为大肠菌群阳性的BGLB管的百分比乘以计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g (mL)样品中大肠菌群数。 • 例：10-4样品稀释液1ml在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取10个接种BGLB肉汤，证实6 个为阳性。则样品大肠菌群数为： 100×6/10×10-4/g(mL)=6.0×105cfu/g(mL)
加入46℃结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)培养基 12~15ml待琼脂凝固后，再加3-4mL培养基覆盖。挑选菌落接种BGLB
典型菌落为紫红色 , 菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为 0.5mm 或更大。
实践操作
任务一仪器试剂准备
任务二仪器试剂灭菌
任务三样品稀释制备
全过程遵循无菌操作程序，考虑如何满足要求？ ⑴检样处理以无菌操作取经过充分摇匀的检样25mL，放入含有225mL灭菌生理盐水的灭菌广口瓶内做成1:10的均匀稀释液。 ⑵样品稀释用1mL灭菌吸管,吸取1:10稀释液1mL,沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液),充分振摇试管，使之混合均匀,制备成1:100的稀释液。另取1mL灭菌吸管,按上项操作顺序，作10倍递增稀释液,如此每递增稀释一次, 即换用1支1mL灭菌吸管。
任务五典型和可疑菌落计数
• 选择菌落数在15~150之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。 • 典型菌落为紫红色，菌落周围有胆盐与酸形成的沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。

大肠菌群平板计数限量标准

1. 引言

大肠菌群是一类存在于人体肠道中的细菌，其计数可以作为评估肠道菌群健康状态的

重要指标。为确保食品安全和公共卫生，制定一份大肠菌群平板计数限量标准具有重要意义。

2. 目的

本标准的目的是通过设定大肠菌群平板计数的限量，以减少食品和饮用水中的大肠菌

群污染，保障公众健康。

3. 定义

3.1 大肠菌群：指在大肠中常见的一类细菌菌群。

3.2 平板计数：采用平板培养方法，通过计数可成满足一定生长条件的菌落形成单位，来确定大肠菌群数量。

4. 大肠菌群平板计数限量标准

4.1 食品中的大肠菌群平板计数限量标准：

4.1.1 食品类别 | 大肠菌群平板计数限量（单位：CFU/g）

鲜肉类食品| ≤100

熟肉或熟制品| ≤10

生鲜水果蔬菜| ≤100

加工水果蔬菜| ≤10

食品类加工品| ≤10

4.1.2 大肠菌群的检验方法：采用标准的培养基和平板计数法，培养温度为37°C，

培养时间为24-48小时。

4.2 饮用水中的大肠菌群平板计数限量标准：

4.2.1 饮用水类别 | 大肠菌群平板计数限量（单位：CFU/mL）

自来水| ≤10

包装饮用水| ≤10

4.2.2 大肠菌群的检验方法：采用标准的培养基和平板计数法，培养温度为37°C，培养时间为24-48小时。

5. 检测与监管

5.1 大肠菌群平板计数的检测应由具备相应技术与资质的实验室进行。

5.2 相关部门应定期进行食品和饮用水的大肠菌群平板计数检测，确保其符合本标准要求。

5.3 如超出限量标准，则需要采取相应措施，例如立即终止生产、销售或使用，并进行卫生处理等。

大肠菌群检测MPN法与平板计数法全方位比较

1、二者范围不同：

GB 4789.3-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》范围中规定：“本标准第一法适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数；第二法适用于大肠菌群含量较高的食品中大肠菌群的计数。”

这里所说的含量高低通常以100CFU为准，即含量低于100CFU采用MPN 计数法，含量高于100CFU采用平板计数法。

2、概念不同：

MPN（most probable number）计数法：即最近似数法，也称为最可能数法，是食品检验中常用的方法。1915年，McCrady首次发表了用MPN法 (最大可能数法) 来估算细菌浓度的方法，这是一种应用概率理论来估算细菌浓度的方法。

平板计数法(colony forming units）：CFU 即菌落形成单位，样品经过处理培养后我们数出平板上所生长出的菌落个数，从而计算出每毫升或每克待检样品中可以培养出多少个菌落，以CFU/mL或CFU/g报告之。

滤膜法（membrane filter method）：将一定量水样注入已灭菌的微孔薄膜的滤器中，经过抽滤，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴于培养基上，经培养后计数和鉴定滤膜上生长的菌落，依据过滤水样计算每升或每100毫升水样中的菌落总数。

菌落：是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。

3、原理不同：

MPN法：利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群

的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。因为细菌在样本内的分布是随机的，所以检测细菌时，可应用概率理论计算菌数，实验结果以MPN值表示，但MPN值并不能表示实际菌落数，实际菌落数有可能落在置信区间内的任何一点，MPN值是落在这个置信区间内概率最大的一点。

大肠菌群测定步骤

食品大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测步骤

一、培养基制备

1、生理盐水

氯化钠 8.5g

蒸馏水 1000.0ml

将氯化钠溶于蒸馏水中，搅拌均匀后用量筒量取225ml分装到各个广口瓶中，1210C高压灭菌15min，备用。

2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤

称取37克放入烧杯，将各成分溶解于1000ml蒸馏水中，放电炉子上加热并搅拌均匀，分装于装有倒立发酵管的试管中，每管10ml，装完盖帽，1210C高压灭菌15min，双料培养基除蒸馏水不变外，其余成分加倍。

3、样品制备（在无菌室中进行）

（1）固体或半固体样品

无菌操作称取样品25g置于装有225ml生理盐水的广口瓶中，充分振摇、混匀，制成1：10的样品稀释液备用。

（2）液体样品

以无菌吸管吸取样品25g置于装有225ml生理盐水的广口瓶中，充分混匀，制成1：10的样品稀释液备用。

4、样品稀释

用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1ml,沿管壁缓慢注于盛有9ml 生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管混匀，制成1：100的样品匀液。

按照该操作程序，可制备1：1000，1：10000。。。。。。等10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释一次，换用1次1ml无菌吸管或吸头。

根据对样品污染状况的估计，选择2-3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1ml样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时分别吸取1ml空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。

二、大肠菌群的测定（MPN法）

1、选取适宜的三个连续稀释度的样品匀液，每个稀释度均接种三管月桂基硫酸

大肠菌群平板计数法计算公式

构建类肠杆菌群计数技术是衡量卫生水中大肠杆菌群的一个重要手段。大肠杆菌群平板计数法是大肠杆菌群计数法中一种比较常见的技术，主要是利用培养基的抗血清特异性效能吸附技术，将水样中大肠杆菌群从环境介质中捕获、纯净、总数计算。其计数法主要有以下几步：

（1）采样：从相应环境或样品中采集所需细菌样本；

（2）分离：用特定培养基培养，在合适的条件下，将沾染大肠杆菌群的样本分离出来；

（3）分析：采用抗血清特异性吸附技术，将纯化的大肠杆菌群模拟出来；

（4）计数：合理设置计数条件，将模拟出来的大肠杆菌群数目计算出来，得出大肠杆菌群数量。

大肠杆菌群平板计数法可以用于解决卫生水建筑中节水管道、游泳池和地下水渠等设备的安装的卫生检查问题，因为这类设备的渗漏可能会引起重要的公共卫生及环境污染问题。由此可见，大肠杆菌群平板计数法也给建筑的正常使用 and 经营提供了较为准确的分析依据。

大肠杆菌群平板计数法是测定建筑环境中大肠杆菌群的一种有效手段，它为建筑安装和使用提供了较高精度的细菌数量测定结果，可以有效预防建筑环境传染疾病的发生。这种技术可以广泛用于水处理厂、公共卫生毒理实验室、游泳池、室内健身中心、精湛的安装建筑市场以及大型建筑工程布置。

大肠菌群检验原始记录(平板计数法)

XX公司

食品微生物检验记录

检品编号：检品名称：

【大肠菌群】按GB 4789.3-2010第二法平板计数法进行检验

环境条件：温度：湿度:

仪器设备：超净工作台编号:；培养箱(36℃±1℃)编号：

电子天平编号：

培养基及试剂：（配制日期：年月日）

①结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）；②无菌生理盐水；③煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤

样品操作

取 5 份独立包装的样品，分别取（）、、、、做为测试样品,按如下述操作,测得结果；

每份测试样品加入225 mL无菌生理盐水,均质，制成1:10样品均液（调节pH值为6。5～7.5），吸取 1 mL（1：10）样品均液至9 mL灭菌生理盐水中做10倍递增稀释。

选、和稀释液检测，培养基为结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA），

℃，培养h(从月日: 到月日:），

挑选10个不同类型典型和可疑菌落，接种煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管，℃培养h（从月日: 到月日:)。

标准规定：（标准号: ）

n=5 c= m= CFU/g（mL）M= CFU/g(mL）结论：□符合规定□不符合规定

检验者：复核者：检验日期: