CHIP染色质免疫共沉淀实验方法简介_PPT幻灯片
ChIP实验课件-PPT资料32页
阳性与阴性对照
注意
还应考虑目的蛋白抗体与DNA的非特异性结合的可能， 所以通常还会选择一对阴性引物，即目的蛋白肯定不会结合
的DNA序列，作为该抗体的阴性对照。
最佳的阴性对照引物是在靶序列上游的一段与目的蛋白肯定不能结合的序列。
ChIP技术的基本步骤
细胞的固定
染色质的断裂
优D基N秀A本的幻分步析灯骤鉴片定
染色质免疫沉淀
Input 对照 Beads 选择 抗体的选择 阳性与阴性对照
Input 对照
在进行免疫沉淀前，需要取一部分断裂后的染色质做Input对照。 Input是断裂后的基因组DNA，需要与沉淀后的样品DNA一起经 过逆转交联，DNA纯化，以及最后的PCR或其他方法检测。
必不可少的步骤 Input对照可以验证染色质断裂的效果，还可以根据Input中的靶
抗体的选择
不是所有的抗体都能做ChIP实验的， 只有经过ChIP实验验证后的抗体才能确保实验结果的可靠性，
实验成功的关键
因为在蛋白质与染色质交联结合时，抗体的抗原表位可能因为与结合 位点的距离太近，不能被抗体识别，所以不能有效地在体内形成免疫
沉淀复合物，直接影响ChIP的结果。
染色质免疫沉淀
Input 对照 Beads 选择 抗体的选择 阳性与阴性对照
染色质的断裂
优D基N秀A本的幻分步析灯骤鉴片定
交联反应的逆转及DNA的纯化
染色质免疫沉淀
DNA的分析鉴定
如果目的蛋白的靶序列是已知的或者怀疑某个序列是 目的蛋白的序列，可以采用狭缝杂交和PCR分析。
如果目的蛋白质的靶序列未知或者高通量的研究目的蛋白在基因 组上的分布情况，找出反式作用因子的结合位点，可以采用 Southern 杂交，ChIP克隆和DNA芯片方法。
《免疫共沉淀》课件
检查所需的仪器设备是否齐全和正常 工作，如离心机、摇床、离心管等。
实验操作流程
抗体与蛋白质样品的结合
将抗体与蛋白质样品混合，确保抗体与目标 蛋白质充分结合。
共沉淀物的分离
通过离心或过滤等方法将共沉淀物与溶液分 离。
清洗非特异性结合
通过洗涤去除未结合的蛋白质和其他杂质。
结果分析方法
统计学分析
采用t检验或方差分析等统计学方法，对实验数据进行处理和分析，以确定共沉淀物之间的相互作用 是否具有统计学显著性。
生物信息学分析
利用在线生物信息学工具对共沉淀物进行功能注释、基因本体论（GO）分类和蛋白质相互作用网络 分析，以深入了解共沉淀物的生物学功能和相互作用关系。
结果解读与讨论
值的实验数据和结论。
未来可以对这些蛋白质复合物的 功能进行深入研究，探讨其在生 物学和医学中的意义和作用机制
。
同时，随着技术的不断进步和应 用领域的拓展，免疫共沉淀技术 还有望在更多领域发挥重要作用
。
未来研究方向与建议
1
进一步优化免疫共沉淀实验条件和方法，提高实 验的特异性和灵敏度，以分离和鉴定更多蛋白质 复合物。
结果解读
根据实验结果，分析共沉淀物的生物学 意义和功能，探讨它们与目标蛋白的相 互作用机制。
VS
结果讨论
结合已有研究，对实验结果进行深入讨论 ，提出可能的生物学模型或假设，为后续 研究提供思路和方向。同时，对实验的局 限性进行说明，并提出改进方向。
05
结论与展望
结论总结
免疫共沉淀技术是研究蛋白质相互作用的经典方法之一，在生物学和医学 研究中具有广泛应用。
பைடு நூலகம்
染色质免疫沉淀法
染色质免疫沉淀法
染色质免疫沉淀法（Chromatin immunoprecipitation，ChIP）是一种用于研究染色质上特定蛋白质与DNA相互作用的实验方法。
该方法主要包括以下几个步骤：
1. 交联：将细胞或组织交联以固定染色质结构，一般使用甲醛作为交联剂。
2. 酶切：使用限制酶或超声波等方法将染色质切割成适当的片段。
3. 免疫沉淀：将特定抗体与染色质混合，使其与特定蛋白质结合。
随后使用蛋白A/G磁珠等材料将抗体结合的染色质选择性地沉淀下来。
4. 解交联：将染色质与抗体复合物从蛋白质上解离，并解开DNA与蛋白质之间的交联结构。
5. DNA纯化：将沉淀下来的DNA纯化出来，以供后续实验分析，如PCR、测序等。
通过染色质免疫沉淀法，可以研究特定蛋白质与DNA的相互作用、染色质结构与功能以及基因表达的调控机制等。
该方法在生物学研究中广泛应用，为研究基因组学、表观遗传学等领域提供了重要工具。
ChIP实验精讲(做科研的必看)
ChIP实验精讲(做科研的必看)染色质免疫共沉淀（ChIP）概述ChIP：chromatinimmunoprecipitation assay，染色质免疫沉淀技术。
研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。
ChIP是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法原理在活细胞状态下固定“蛋白质-DNA”复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
ChIP应用1、检测体内反式因子与DNA的动态作用，研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系；2、CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-ChIP 方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；3、CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；4、RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。
试验流程一、交联染色质免疫沉淀技术1. 细胞甲醛交联和收集注意事项：①需要优化甲醛使蛋白质和DNA交联的时间。
②交联的时间很关键。
交联的时间一般为2-30 分钟。
③交联过度会降低抗原的可结合性和超声的效率，也会被遮盖抗原的表位。
④甘氨酸可抑制甲醛的作用，终止交联反应。
1.1 取1直径10cm培养皿的细胞。
加入甲醛至终浓度为0.75%（V/V），使蛋白和DNA 交联。
1.2 室温下，轻摇10 分钟。
1.3 加入甘氨酸至终浓度为125 mM，室温下放置5 分钟，以终止交联。
1.4 吸去培养基，用冰冷PBS 洗细胞2 次。
1.5 使用细胞刮刀，加入5ml 冰冷PBS，刮下细胞，收集至一个50 ml 离心管中。
1.6 再用 3 ml 冰冷PBS 洗培养皿2次，至50ml 离心管中。
1.7 4℃，1000 g，离心5分钟收集细胞。
1.8 吸弃上清，用SDSLysis Buffer重悬沉淀（每1 X 107 个细胞加800 μl）。
染色体免疫共沉淀(chip)步骤
染色体免疫共沉淀(chip)步骤
染色体免疫共沉淀（ChIP）是一种常用的实验技术，用于研究染色体上特定蛋白质与DNA的相互作用。
以下是染色体免疫共沉淀的基本步骤：
1. 交联：将细胞或组织与形成蛋白质-DNA复合物的交联剂（如甲醛）处理，使蛋白质与DNA之间形成致密的交联。
这一步骤有助于保持蛋白质与DNA的相互作用并固定其在细胞或组织中的位置。
2. 细胞破碎和核裂解：将交联后的细胞或组织进行破碎和核裂解，以释放细胞内的染色质。
这可以通过机械方法（如超声波处理）或化学方法（如利用细胞裂解缓冲液和蛋白酶进行破碎）完成。
3. 免疫共沉淀：在破碎的细胞或组织提取物中，加入特异性抗体，该抗体可以与目标蛋白质结合。
免疫抗体与目标蛋白质形成免疫复合物，并与形成蛋白质-DNA复合物的目标区结合。
4. 洗涤：通过一系列洗涤步骤，去除非特异性和非特定结合的蛋白质和核酸，以减少背景信号的干扰。
5. 解交联：通过加热或酶处理等方法，解除细胞或组织中的蛋白质-DNA交联，并将DNA释放出来。
6. DNA提取：通过加入DNA提取缓冲液和有机溶剂，从溶液中沉淀出DNA，并用适当的方法进行纯化和浓缩。
7. 分析：对提取的DNA进行进一步的分析，可使用PCR、测序等技术，以检测免疫共沉淀的蛋白质与目标DNA的相互作用。
这些步骤旨在允许研究人员从细胞或组织中获得特定蛋白质与DNA的结合信息，并进一步了解基因调控、表观遗传学等相关的生物学过程。
实际操作时，具体的步骤和条件可能会因实验目的和样本类型而有所不同。
因此，在进行染色体免疫共沉淀实验时，建议参考相关文献和实验室经验，以确保实验的准确性和
可重复性。
02 CHIP染色质免疫共沉淀实验方法简介
Ago----argonaute蛋白
谢 谢！
概述 原理 方法 比较 举例
Saleh A, Alvarez-Venegas R, Avramova Z. An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc. 2008;3(6):1018-1025.
概述
原理 染色质免疫沉淀实验(CHIP)
方法 比较
举例 ➢ 研究体内DNA－蛋白质相互作用的重要 工具。 它不仅可以灵敏地检测目标蛋 白与特异DNA 片段的结合情况，还可以 用来研究组蛋白与基因表达的关系。
概述
原理 CHIP原理
方法
比较 在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物
举例
将其随机切断为一定长度范围内的染色质
概述
原理 应用举例
方法
比较
举例
Mantovani F, Tocco F, Girardini J, et al. The prolyl isomerase Pin1 orchestrates p53 acetylation and dissociation from the apoptosis inhibitor iASPP. Nat Struct Mol Biol. 2007 Oct;14(10):912-920.
方法
比较
举例
条 超声波破碎条件的选择
件 选
抗体量的选择
择 PCR反应条件的选择
对 Input对照
照 设
阳性对照：如组蛋白抗体
置 阴性对照：阴性引物
chip-seq产品演示
ChIP-seq经典案例
ZBED6蛋白作为抑制因子调控基因表达的 方式： 用siRNA将小鼠C2C12成肌细胞中的Zbed6 基因沉默后的相关实验结果，证实了 ZBED6蛋白作为抑制因子是通过与位于Igf2 基因第三内含子中的QTN（Quantitative trait nucleotide）位点结合来抑制Igf2基因 的表达。当Zbed6基因沉默后，Igf2基因的 表达量升高、细胞增殖（肌管形成）加快、 创伤愈合加快。
ChIP-seq与组蛋白修饰
③甲基化。仅发现于H3的9和27位和H4的 20位的赖氨酸，鸭红细胞组蛋白H1和H5的 组氨酸。 ④ADP-核糖基化。组蛋白H1、H2A、H2B 及H3和多聚ADP-核糖的共价结合，ADP核糖基化被认为是在真核细胞内启动复制过 程的扳机。 我们目前仅研究组蛋白甲基化修饰
ChIP-seq的高级分析1
当向我们提供两组或更多组样本时，我们 可以提供如下高级分析 1）根据片段信息，分析不同样本之间被 特异调控的基因(Differentially regulated gene，DRE)； 2）如果样本量超过两个，可以做两组样 本(或更多)相对于另一组样本共同被特异 调控的基因(Co-DRE)； 3）对DRE和Co-DRE的基因做GO-Term 分析，用来推断它们的调控机制和生物学 功能。
ChIP-seq的高级分析2
分析我们ChIP实验得到的这种特异蛋白 的结合位点和DNA上其他遗传标记之间 的关系，一个典型的例子是CG islands和 组蛋白标记之间的关系(John P. Thomson et al.; Nature 2010)
ChIP-seq的高级分析3
对于转录区域，我们可以做如下分析： 在转录起始位点(Transcription Start SiteTSS)附近片段分布情况分析； 在转录结束位点(Transcription Terminal Site-TTS)附近片段分布情况分析； 由于测序片段的丰度反映基因的转录水平， 因此这类结合蛋白量得改变也表明转录水 平的改变，所以我们可以结合已有的 RNA-Seq数据来对ChIP-Seq数据做更深 一步的分析；
染色质免疫共沉淀(ChIP)实验
染色质免疫共沉淀（ChIP）染色质免疫共沉淀可以：（1）组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”；（2）转录调控分析；（3）药物开发研究；（4）DNA损失与凋亡分析。
1实验方法原理：在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。
IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
2实验材料、试剂、仪器耗材：细胞样品甲醛、甘氨酸、PBS、SDS、Lysis Buffer、洗脱液、RNaseA、蛋白酶K、omega胶回收试剂盒等离心管、超声仪、电泳仪、离心机等3实验步骤：一、细胞的甲醛交联与超声破碎（第一天）1. 取出1平皿细胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9 ml）。
2. 37℃孵育10 min。
3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。
450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。
混匀后，在室温下放置5 min即可。
4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。
预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。
6. 倒去上清。
按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。
使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。
这样每100 ul溶液含1×106个细胞。
再加入蛋白酶抑制剂复合物。
假设MCF7长满板为5×106个细胞。
本次细胞长得约为80%。
即为4×106个细胞。
因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。
CHIP--YJH
启动子
➢ RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。 启动子是基因(gene) 的一个组成部分，控制基因表达 (转录)的起始时间和表达的程度。
转录因子
➢ 分子生物学中，转录因子（Transcription factor）是指能够结合 在某基因上游特异核苷酸序列上的蛋白质，这些蛋白质能调控其 基因的转录。
概念及原理 流程 CHIP扩增原理 注意事项 实验费用
染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）
➢ 染色质免疫共沉淀技术的原理是在保持组蛋白和DNA联合的同时， 通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成 很小的片断，并沉淀下来。
转录因子就像一面“旗子”，指挥着酶RNA聚合酶RNA polymerases) 的活动，这种酶指导着RNA复制。
甲醛固定 超声破碎
免疫沉淀
细胞收集及体内交联 细胞裂解及DNA剪切 蛋白-DNA免疫沉淀 DNA解交联及DNA纯化 常规PCR或QPCR检测
Primer F
Binding site
➢ 这项技术主要用来分析启动子与转录因子的结合情况，目标基因 有没有活性、或者分析一种已知蛋白（转录因子）的靶基因有哪 些。
染色质是指间期细胞核内由DNA、组蛋白及非组蛋白及少量RNA 组成的线性复合结构，是间期细胞遗传物质存在的形式。
染色体是指细胞在有丝分裂或减数分裂的特定阶段，由染色质聚 缩而成的棒状结构。
Primer R
收样须知：
① 需客户提供预测靶位点信息及参考文献或者资料； ② 需提供CHIP级抗体； ③ 若客户提供细胞，需明确告知客户，分多次（至少3次体积、间歇 时间、总时间、剪切效果片段大小200-1000bp最佳）。
染色质免疫共沉淀
染色质免疫共沉淀（CHIP）实验原理染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。
它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。
而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。
染色质免疫沉淀实验原理示意图ChIP的一般流程：甲醛处理细胞→收集细胞，超声破碎→加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合→加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀→对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合→洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物→解交联，纯化富集的DNA-片断→PCR分析。
第一天：（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎1、取一平皿长满的细胞（10 cm平皿），加入终浓度为1%的甲醛溶液（在9 ml培养液中加入243 μl 37%甲醛）。
2、37℃培养10 min。
3、终止交联加甘氨酸至终浓度为0.125 M。
450 μl 2.5 M甘氨酸溶液于平皿中。
混匀后，在室温下放置5 min即可。
4、吸尽培养基，用预冷的PBS溶液清洗细胞2次。
5、收集细胞于15ml离心管中（如果细胞贴壁，可以使用细胞刮刀，PBS溶液体积依次为5ml，3ml和3ml）。
预冷后2000 rpm 5 min收集细胞。
《染色质免疫沉淀》课件
染色质免疫沉淀的操作相对复杂，需要合适 的抗体选择和前期的校验步骤，而且成本较 高。
结论
染色质免疫沉淀是一种重要的分子生物学实验技术，通过研究蛋白质与DNA 的相互作用，有助于我们深入了解基因表达调控和疾病相关基因的发现。
它可以帮助我们理解基因表达调控、染色质 结构和功能等重要生物学过程。
工作原理
1 抗体-抗原相互作用原理
染色质免疫沉淀利用抗体特异性地结合目标蛋白质，从而将其与DNA结合的蛋白质-DNA 复合物进行沉淀分离。2 抗体选 Nhomakorabea和特异性检测
选择合适的抗体非常重要，以确保免疫沉淀的特异性和准确性。
实验步骤
1
细胞取材和交联
首先，需要获取待研究的细胞样本，并使用交联剂将细胞DNA与蛋白质交联在一起。
2
细胞裂解和染色质片段化
接下来，将细胞裂解，使染色质得以释放，并通过酶切等方法将染色质分成小片段。
3
蛋白质-DNA复合物的免疫沉淀
然后，使用特定的抗体将目标蛋白质与DNA复合物免疫沉淀下来。
4
DNA析出和PCR扩增
《染色质免疫沉淀》PPT 课件
染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是一种重要的分子 生物学实验技术，用于研究基因表达调控和疾病相关基因的发现。
介绍
1 什么是染色质免疫沉淀？
染色质免疫沉淀是一种实验技术，用于研究 蛋白质与DNA之间的相互作用。
2 染色质免疫沉淀的作用是什么？
最后，通过去除蛋白质并进行DNA析出，可以获得与目标蛋白质相结合的DNA片段，并进行 进一步的PCR扩增等分析。
应用
1 用于研究基因表达调控、染色质结构和功能等
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
方法
比较
举例
Mantovani F, Tocco F, Girardini J, et al. The prolyl isomerase Pin1 orchestrates p53 acetylation and dissociation from the apoptosis inhibitor iASPP. Nat Struct Mol Biol. 2007 Oct;14(10):912-920.
概述
原理 扩展应用举例
方法
比较 ❖ chip
举例
概述
原理 ❖crosslinking immunoprecipitation
方法 (CLIP)
比较
举例
For microRNA–mRNA interaction
Chi SW, Zang JB, Mele A, Darnell RB. Argonaute HITS-CLIP decodes microRNAmRNA interaction maps. Nature. 2009 Jul 23;460(7254):479-486.
抗体量的选择
择 PCR反应条件的选择
对 Input对照
照 设
阳性对照：如组蛋白抗体
置 阴性对照：阴性引物
概述
原理 比较：
方法
比较 蛋白质-DNA相互作用常用方法
举例
凝胶电泳迁移率改变分析 （EMSA） DNaseⅠ足迹法（foot printing） 染色质免疫沉淀实验(CHIP)
体外 体内
概述
概述
原理 CHIP原理
方法
比较 在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物
举例
将其随机切断为一定长度范围内的染色质
小片段
通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地 富集目的蛋白结合的DNA片段
对目的片断的纯化与检测
概述 原理 方法 比较 举例
概述
原理 注意事项
方法
比较
举例
条 超声波破碎条件的选择
件 选
概述 原理 方法 比较 举例
Saleh A, Alvarez-Venegas R, Avramova Z. An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc. 2008;3(6):1018-1025.
概述
原理 功能基因组学基因表达调控
方法
比较
➢基因表达:反式因子和顺式作用元件之
举例
间相互作用。
➢真核生物的基因组DNA以染色质的形式 存在。
➢研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相 互作用是阐明真核基因表达机制的基 本途径。
概述
原理 染色质免疫沉淀实验(CHIP)
方法 比较
举例 ➢ 研究体内DNA－蛋白质相互作用的重要 工具。 它不仅可以灵敏地检测目标蛋 白与特异DNA 片段的结合情况，还可以 用来研究组蛋白与基因表达的关系。
Ago----argonaute蛋白
谢 谢！
原理
方法
EMSA
比较
CHIP
举例 由于许多转录调控蛋 能真实完整地反映结 白有相似或相同的DNA 合在DNA序列上的调控
结合位点，EMSA获取 蛋白，是目前确定与
的结果不一定能真实 特定蛋白结合的基因
地反映体内转录调控 组区域或确定与特定 蛋白和DNA结合的状况。基因组区域结合的蛋
白质的最好方法。
概述