5章 沉淀反应(免疫学)

三、速率抑制免疫比浊法
(rate inhibition immunoturbidimetry)

是一种竞争性结合试验，主要用于测定半抗原和 药物等小分子物质。

试验时先将一定量的已知半抗原-载体（大分子） 与限量的特异性抗体发生反应，生成的免疫复合 物可形成一定的速率散射峰值。
待测抗原与抗体竞争结合，速率散射峰值降低， 降低程度与标本中的待测半抗原成正比。

二、 环状沉淀试验

(一 )基本原理 将抗原溶液叠加在细小玻璃管中抗体溶液上 面，抗原与抗体在两液交界面处特异性结合， 形成白色沉淀环
絮状沉淀试验： 方法简单，不需特殊设备 但敏感度较低，已其他方法被取代。 。
第二节 凝胶内沉淀试验 (gel phase precipitation)

凝胶内沉淀试验 可溶性抗原与相应抗体分别放入凝胶内进 行扩散，二者在比例合适的位置形成肉眼可 见的沉淀线或沉淀环，又称凝胶扩散(gel diffusion)。
指可溶性抗原与相应抗体在含电解质的液 体介质中反应，形成肉眼可见的沉淀物。

液相内沉淀分为 絮状沉淀试验 环状沉淀试验 免疫浊度分析
一、絮状沉淀试验
（一） 基本原理
可溶性抗原与相应抗体在有电解质存在的条件
下，形成可见的絮状沉淀物。
方法：玻片法和试管法。
Leabharlann Baidu
方法简单 不需特殊设备 灵敏低 已被其它方法取代

（三）反应条件
提供： 合适pH 合适离子强度:
（四）增浊剂的作用

加入PEG、Tween-20等，可以促进IC的形 成，增加反应浊度。
增浊剂作用原理： 是消除蛋白质分子周围的电子云和水化层，促 进抗原、抗体分子靠近，结合形成大分子复合。 浓度：3-4%，过高易引起非特异蛋白沉淀。 “伪浊度”
已被免疫浊度分析取代。
三、定向自由扩散

是将区带电泳与免疫扩散相结合的免疫化学 分析技术。
（一） 免疫电泳
（immunoelectrophoresis，IEP）

免疫电泳 是将区带电泳与双向免疫扩散相结合的一 种免疫化学分析技术。
1. 基本原理

电泳 Ag在凝胶上进行电泳，被分离成不同区带。 反应 在停止电泳后，在与电泳方向平行挖一条
方法稳定、简便的方法，不需特别仪器设 备，重复性好，但灵敏度稍差(1.25mg/L)。
（四）临床应用
1．血清学诊断:出现沉淀线，表明存在相应的Ag或Ab.
2.
免疫化学分析:浓度、分子量、纯度、反应性 沉淀线靠近抗原孔，提示抗体含量高；反之则反
出现多条沉淀线，则说明抗原和抗体皆不是单 一成分。可用于鉴定抗原或抗体的纯度。

（二）技术要点
制板：将抗体和热融化琼脂混合，倾注成平板。 打孔： 加样：待测抗原和抗原标准品， 反应：置37℃，24～48h后观察孔周围沉淀环。
(三) 数据处理 1．Mancini曲线 适用于大分子抗原，如 IgM测定，扩散时间>48h. 沉淀环直径的平方（d2） 与抗原浓度（C）呈线性 关系。

当可溶性抗原与相应的抗体特异结合，可以形成不 溶性的CIC，使反应液出现浊度。用仪器检测浊度，
推算出复合物的量。

免疫浊度测定按测量方式分为 透射免疫比浊法 （turbidimetric immunoassay或turbidimetry）
散射免疫比浊法 （nephelometric immunoassay或nephelometry）

利用激光照射在液相中的CIC微粒上时部分光线发 生散射的原理，通过测量散射光的强度来得知待测 抗原的量。


沿水平轴照射的一定波长的光通过溶液时，被免 疫复合物粒子颗粒折射，发生偏转，产生散射光。 散射光强度与粒子的浓度和体积成正比。

散射比浊法的灵敏度和特异性比透射比浊 法高。
Nephelometry

四、免疫胶乳浊度测定法 (immunolatex turbidimetry)

免疫胶乳浊度测定法 与透射免疫比浊法基本相似， 为一种带载体的免疫比浊法，提高了免疫 浊度测定的灵敏度。
(一) 基本原理



将抗体吸附到胶乳颗粒上，当遇到相应抗原时， 胶乳颗粒发生凝集。 单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过。 当两个以上胶乳颗粒凝聚时，则使透过光减少， 吸光度（A值）与胶乳凝聚程度成正比，并与待测 抗原量直接相关。
形槽，加入相应抗血清，使抗原和抗体呈双向扩 散，在二者比例合适处形成肉眼可见的弧形沉淀 线。 根据沉淀线的数量、位置和形状，可分析、鉴 定样品中所含抗原成分及其性质。

2. 技术要点
制板与打孔： 加样：加入待检抗原标本或正常血清对照。

电泳：抗原一端接阴极，电泳1.5～2h。 反应：挖一小槽，向槽内加入抗体，使抗原抗 体双向扩散。 观察结果：放置24h后，观察沉淀线的数目、 形状和位置。
3.方法评价
操作简便。 灵敏度较高，比双扩高约10倍。 分辨率低于双扩。

4. 临床应用

常用于抗原或抗体的定性分析、效价测定和纯度鉴 定等
(二) 火箭免疫电泳

火箭免疫电泳 是将单向免疫扩散和电泳相结合，在电场中
加速定向扩散的单向免疫扩散技术，由于其沉淀形
似火箭，故称为火箭电泳。
1. 基本原理
1. 基本原理
在pH8.6的琼脂凝胶中， 大部分蛋白质抗原在碱性溶液中带负电荷，且 分子较小，电泳时，泳向正极。 抗体带弱负电荷，但分子量大，电泳力小于电渗 力，泳向负极。 抗原和抗体相遇，比例合适时形成肉眼可见 的沉淀线。
2.技术要点

制板，在琼脂板上成对打孔，加抗原和抗体。 电泳后观察结果。
（一）基本原理 将抗原和抗体溶液分别放在凝胶不同 的对应孔中，让两者均在凝胶中自由扩 散，当抗原与抗体相遇，浓度比例适当 处形成可见的白色沉淀线。
（二）技术要点
琼脂倾注制板。
待琼脂凝固后，在琼脂胶板上打孔。
在相对的孔中分别加入抗原或抗体。
置室温或37℃18～24h观察沉淀线 。
（三）方法评价

电泳与反应 抗原在电场作用下，在含有适量抗体 的凝胶中向正极泳动，逐渐形成梯度浓度，在抗原 抗体比例适当时形成沉淀，随着抗原量的减少，沉 淀带越来越窄，形成火箭峰样沉淀带，峰形高低与 抗原量呈正相关。

结果分析 用已知量标准抗原作对照，绘制标准曲 线，根据检测样品沉淀峰的高度可算出待测抗原的 含量。
五、免疫浊度分析的影响因素

抗体必须适量过剩，以保证IC复合物的生成量与浊 度的改变一致。
（一）抗体试剂的质量 1.抗体质量：特异性强,效价高,亲和力强。 2.抗体类型： R型：亲和力强,不易解离,抗体过剩时易形 成大而稳定的IC。 H型：亲和力弱,易解离。
（二）抗原抗体比例
抗体必须适量过剩，以保证IC复合物的生成 量与浊度的改变一致。 抗体过量，IC的形成随着抗原量的增加而递 增。 抗原过量，形成的IC分子小，易发生解离

凝胶内沉淀试验分为 自由扩散：
单向琼脂扩散试验 双向琼脂扩散试验
定向扩散： 火箭电泳 对流免疫电泳
定向-自由扩散： 免疫电泳 免疫固定电泳
一、单向琼脂扩散试验
single immunodiffsion

（一）基本原理 待测抗原从局部含有相应定量抗体的凝胶 内自由向周围扩散，抗原抗体特异性结合， 在二者比例合适的部位，形成白色沉淀环， 沉淀环大小与抗原的浓度成正相关。
2. 技术要点

制板与打孔： 电泳：样品孔侧置负极电泳。



结果：电泳完毕，观察琼脂板上沉淀峰，测量(从孔 中心到峰尖的高度)。 计算: 以峰高为纵坐标，抗原浓度为横坐标(对数 坐标)，绘制标准曲线，求出待检样品抗原浓度。
3.方法评价
操作简便 灵敏度较高（mg/L）

4. 临床应用
1. 抗原蛋白定量，如IgA、IgG、IgM和sIgA检测。 2. C3、C4及其裂解产物检测。 3. AFP等检测
在琼脂内扩散的速度受分子量的影响。 如分子量大时，沉淀线弯向分子量大的一边。 如二者分子量相等，则形成直线。
用于抗原性质的分析 分析两种受检抗原的性质是 完全相同、 部分相同或 完全不同。
3．用于抗体效价的滴定 固定抗原的浓度，稀释抗体，经过自 由扩散，形成沉淀线，出现沉淀线的最高 抗体稀释度为该抗体的效价。
3.方法评价
简便、快速 灵敏度高于免疫电泳

4. 临床应用

可用于鉴定具有近似迁移率的多种蛋白 如各种M蛋白、补体的裂解产物、免疫球蛋白的 轻链型别； 脑脊液、尿液或其他体液中微量蛋白的检测与 鉴定。
第三节

免疫浊度分析技术
（immunoturbidimetry）
免疫浊度测定
是将液相内的沉淀试验与现代光学仪器和自动分 析技术相结合的一项分析技术。
2．Fahey曲线 适用于小分子抗原， 扩散时间较短(24h).
抗原浓度的对数（log c） 与沉淀环直径（d）呈 线性关系。

(四) 临床应用
用于IgG、IgA、IgM、C3、C4等定量测定。 简单、特异，但敏感性低，已被其它方法取代
二、双向琼脂扩散试验 （double immunodiffusion）

3.方法评价

主要优点: 特异、分辨率高
4. 临床应用 主要用于： 纯化抗原或抗体的成分分析。

异常体液中蛋白质分析，如无丙种球蛋白血 症、白血病等病人的血清蛋白成分的分析。
(二) 免疫固定电泳
（immunofixation electrophoresis）

区带电泳与免疫沉淀反应相结合的免疫分析 技术。
利用激光照射在液相中CIC微粒上时，部分光线 发生散射的原理，通过测量散射光的强度来得知待 测抗原的量，称为散射比浊法（nephelometry）。

1977年，Sternberg 建立了速率散射比浊法（rate nephelometry）， 使微量抗原的定量测定得以快速灵敏地进行。
(一) 基本原理
二、定向免疫扩散

在电场作用下，抗原抗体在介质中发生定向 移动的沉淀反应。

定向、加速扩散
分类
火箭免疫电泳 (rocket immunoelectrophoresis)
对流免疫电泳 (counter immunoelectrophoresis)
(一)对流免疫电泳

对流免疫电泳 是双向免疫扩散与电泳相结合，在电场中加速定 向扩散的双向免疫扩散技术。
（五）标本因素
高血脂易引起非特异反应 内源性免疫复合物影响测定结果 高混浊标本不能用于检测
(二) 技术类型

散射比浊法分为 终点散射比浊法（end-point nephelomtry） 速率散射比浊法（rate nephelometry）
1.终点散射比浊法

当抗原-抗体相遇后，反应达到平衡通常需10～30min。

免疫浊度测定应在复合物聚合产生絮状沉淀之前进行， 否则光散射值降低，影响测定结果。 因此，终点散射比浊是在免疫反应进行到一定时间 时测量其浊度。
一、透射免疫比浊法
（transmission turbidimetry）
(一) 基本原理

抗原抗体结合后形成的CIC引起液体介质出 现浊度改变，光线的透过量减少，被吸收 光线量与CIC形成量呈正相关，依所测吸光 度值推算待测抗原的量 。
二、散射免疫比浊法
（nephelometry）

1967年， Ritchie等
2.速率散射比浊法

速率是指单位时间内抗原与抗体反应的速度。 抗原与抗体结合形成IC的速度，在每个单位时间内 是不相同的，在抗体过量的情况下，随着反应时间 的延长，免疫复合物的总量逐渐增加，通常在25s时 出现一个反应最快的速率峰，峰值与抗原量呈正相 关。


速率散射比浊法：
是测定单位时间内免疫复合物形成的最快时间 段的散射信号值。
（一）原理
似免疫电泳，不同之处是电泳后直接将抗 体作用于被分离的各组分蛋白质，抗Ag-Ab发 生反应，使Ag在电泳位置上被免疫固定。
2. 技术要点

电泳 先将抗原作区带电泳，分离成不同区带
沉淀反应


电泳后，将Ab加于蛋白质区带表面，
Ag与Ab发生沉淀反应，形成的CIC嵌于固相支持物中。
洗去游离的Ag或Ab，显示出被结合固定的某种蛋白质。
第5章 沉淀反应 Precipitation
沉淀反应： 是指可溶性抗原和抗体特异性结合，在 适当条件下形成沉淀物的现象，包括液相沉 淀试验和凝胶沉淀试验。
主要内容： 液相沉淀反应 凝胶中沉淀反应 免疫浊度分析
第一节
液相沉淀试验
液相沉淀反应
(fluid phase precipitation)