实验九 免疫沉淀反应实验
实验九 沉淀反应
实验九 沉淀反应目的要求1．了解沉淀反应在预防医学和兽医学中的意义。
2．初步掌握炭疽沉淀原的制备和环状沉淀反应，琼脂扩散反应的操作方法。
原理 将可溶性抗原与相应的抗体混合，在适量电解质存在下，经过一定时间，即可形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。
参与沉淀反应的抗原称为沉淀原，抗体称为沉淀素。
沉淀反应通常都是利用已知抗体检查未知抗原，以诊断传染病。
但也用于以已知的抗原测定未知的抗体，以测定免疫血清的效价和诊断疫病。
操作步骤一、环状沉淀反应（以炭疽为例）将含有抗原的透明浸出液重叠于含有抗体的免疫血清上，在两液交界处发生环状的白色沉淀物，即称为环状沉淀反应。
炭疽环状沉淀反应又称为阿斯可里（Ascoli ）氏反应。
具体操作方法如图实9-1所示。
（一）沉淀原的制备1．热浸法 取被检材料（如各种实质脏器、血液、渗出液等）1～3g ，在乳钵内研碎，然后加5～10倍生理盐水混合，用移液管吸至试管内，置于水浴锅中煮沸15～30分钟，用中性石棉过滤，获得的透明滤液，可再过滤—次。
2．冷浸法 用以检查怀疑为炭疽病畜的皮革和兽毛等材料，操作前，先将其高压灭菌30分钟，以保证检查者的安全。
然后取被检材料1g ，浸于5～10倍的0.5％石炭酸生理盐水中，在室温下或普通冰箱浸泡14～20小时，用中性石棉过滤，透明的滤液即为沉淀原。
（二）方法与判定用毛细吸管吸取少量炭疽沉淀素血清，沿管壁徐徐注入沉淀反应管内，通常达管的1/3高处，再用另一支毛细吸管吸取制备的沉淀原，沿管壁缓慢注入，使之重叠于炭疽沉淀素血清上面，达到试管的2/3高处（注意！不要发生气泡或摇动）。
直立静置，在1～5分钟内，两液面交界处若出现清晰、整齐的环状白轮，则为阳性。
为了验证反应的正确性，检验时可做如下三种对照试验；1．炭疽沉淀素血清加标准炭疽沉淀原，应为阳性；2．标准炭疽沉淀原加健康马血清，应为阴性；3．生理盐水加炭疽沉淀素血清，应为阴性。
二、琼脂扩散沉淀反应（以炭疽为例）抗原、抗体在含有电解质的琼脂凝胶基质中可以向四周自由扩散，如果二者是相应的具有特异性，则在—定部位相遇，并发生反应，出现肉眼可见的白色沉淀线。
研究蛋白质相互作用的九种方法，写标书用得上
研究蛋白质相互作用的九种方法，写标书用得上寒风凛冽，又到了一年一度写标书的季节，你开始准备了么？在分子机制的研究中，蛋白和蛋白之间的互作研究可以说是非常经典了，研究蛋白互作的方法有很多，今天我们来介绍九种。
1、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）CoIP其实就是两个蛋白相互的IP（免疫沉淀反应）实验，在已知蛋白B和C之间有相互作用的前提下，这种前提一般需要有一个酵母双杂实验或者Pulldown实验来作为支持。
IP就是用来验证蛋白C和蛋白B之间相互作用的。
如果在Agarose珠上的Protean A/G所结合的抗体，可以结合并拉下蛋白B，那用Western Blot即可检测出蛋白C的表达，反之亦然，通过这种相互间免疫共沉淀的实验，就可以明确地验证出，B与C之间的相互作用了。
比如这份标书：PYK2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化E-cadherin？（百度检索题目可查到全文）2、Pull-down实验这个实验跟免疫共沉淀实验很像，不同的是免疫共沉淀是在细胞里进行的，在众多的蛋白里，拉住A蛋白的同时,把B蛋白也给拉出来了，这还不能证明是直接的结合，很有可能是A 拉住了C，而C拉住了B，这样拉住A蛋白的同时也能把B蛋白也给拉出来。
要证明直接的结合就是Pull-down实验。
提纯所要研究的两个蛋白（一般是在BL21等菌种表达提纯），这两个蛋白带上不同的标签（提纯蛋白一般带GST或者HIIS标签），然后将他们放在同一个体系里，使用GST-beads或者NI-beads,把其中一个蛋白拉下来，用WB检测另一个蛋白的存在。
比如这份标书：恶性肿瘤的发生、发展的细胞表观遗传学机制。
（同样可以百度检索到全文）3、免疫荧光（Immunofluorescence，IF）——共定位将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。
由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。
抗体沉淀反应实验报告
抗体沉淀反应实验报告实验目的本实验旨在通过抗体沉淀反应的方法，从混合溶液中分离出目标蛋白，以验证抗体对特定抗原的选择性结合能力和分离纯化的能力。
实验原理抗体沉淀反应是利用抗体与抗原的特异性结合原理，通过与特定抗原结合的抗体将抗原从混合溶液中沉淀下来，从而实现目标蛋白的分离纯化。
实验步骤如下：1. 将混合溶液与目标抗体充分混合，形成抗原-抗体复合物。
2. 添加沉淀剂（如硫酸铵）使复合物沉淀形成沉淀物。
3. 离心沉淀物，将上清液与下沉淀分离。
4. 用适量的缓冲液将沉淀洗涤，去除非特异性结合物质。
5. 最后重悬沉淀物，并进行后续的分析和检测。
实验材料和设备- 抗原溶液- 目标抗体- 混合溶液- 12孔离心管- 离心机- 分光光度计- 蛋白测定试剂盒实验步骤1. 准备混合溶液：将抗原溶液与混合溶液按一定比例混合均匀。
2. 添加目标抗体：将目标抗体逐滴加入混合溶液中，充分混合反应。
3. 沉淀产物的制备：添加适量硫酸铵至混合溶液中，使复合物沉淀生成。
4. 离心分离：将混合溶液转移到12孔离心管中，离心机设定合适的速度和时间，离心使沉淀物沉淀到离心管底部。
5. 沉淀物洗涤：将上清液倒出，加入适量的缓冲液轻轻洗涤沉淀物，去除非特异性结合物质。
6. 沉淀物重悬：将洗涤好的沉淀物加入适量的缓冲液中，轻轻振荡使其重悬形成目标蛋白溶液。
实验结果与分析本实验利用抗体沉淀反应成功分离得到目标蛋白。
利用分光光度计对沉淀物进行测定，得到其吸光度值为0.8。
通过蛋白测定试剂盒对目标蛋白的浓度进行测定，浓度为2 mg/ml。
结论本实验采用抗体沉淀反应成功分离纯化了目标蛋白，并通过吸光度测定和蛋白浓度测定验证了抗体沉淀反应的有效性。
抗体沉淀反应是一种简单可靠的蛋白质分离方法，具有很高的特异性和选择性，可以应用于生物医学研究和生物工程领域。
实验总结本次实验通过抗体沉淀反应方法成功分离了目标蛋白，验证了该方法的有效性。
实验过程中，应严格控制实验条件，充分混合抗体和抗原，并正确选择沉淀剂和洗涤缓冲液，以确保分离的目标蛋白质的纯度和活性。
免疫共沉淀原理及实验方法
免疫共沉淀原理及实验方法免疫共沉淀是一种通过使用抗体分子来使特定蛋白质复合物沉淀下来的方法。
在这个过程中，抗体与蛋白质复合物结合，形成抗原-抗体共沉淀复合物。
这种方法可以用于研究蛋白质间的相互作用、检测特定蛋白质的存在以及分离蛋白质复合物等。
1.细胞裂解：将目标细胞或组织加入裂解缓冲液中，破坏细胞膜，使蛋白质释放到溶液中。
2.抗体结合：将特异性抗体加入裂解液中，与目标蛋白质结合。
3.免疫沉淀：将抗原-抗体复合物与免疫沉淀剂（如蛋白A/G琼脂糖或蛋白A/G磁珠）结合，形成免疫复合物。
4.洗涤：通过多次洗涤步骤去除非特异性结合物质，以提高免疫复合物的纯度。
5.去除抗原-抗体结合：使用酸性溶液或高盐浓度缓冲液等方式解离免疫复合物，分离出目标蛋白质。
6. 分析：通过Western blot、免疫印迹、质谱等手段对分离出的蛋白质进行分析。
免疫共沉淀的原理是利用抗体与特定目标蛋白质的结合来将其沉淀下来。
抗体通常是由动物制备得到的，可以选择单克隆抗体或多克隆抗体。
在实验中，抗体可以特异性地结合到目标蛋白质的表位上，形成稳定的免疫复合物。
随后，通过与免疫沉淀剂结合，可以使免疫复合物沉淀下来。
免疫共沉淀这种实验方法在生物医学研究中具有广泛的应用，例如检测蛋白质间的相互作用、鉴定细胞中的蛋白质复合物、研究信号转导通路等。
通过免疫共沉淀可以揭示蛋白质的功能和相互作用网络，深入理解生物学过程中蛋白质的功能和调控机制。
然而，免疫共沉淀实验也存在一些局限性。
首先，抗体需具有高度的特异性和亲合力，以保证免疫复合物的选择性。
其次，免疫共沉淀依赖于抗体与目标蛋白质的免疫反应，在一些情况下可能出现低表达的蛋白质无法被充分沉淀的问题。
此外，非特异性结合和高背景信号也会影响实验结果的准确性。
综上所述，免疫共沉淀是一种基于抗体-抗原相互作用原理的实验方法，可用于研究蛋白质间的相互作用和分离特定蛋白质复合物等。
这种方法广泛应用于生物医学研究领域，对于揭示蛋白质功能和调控机制具有重要意义。
免疫沉淀反应实验报告
免疫沉淀反应实验报告免疫沉淀反应实验报告免疫沉淀反应是一种常用的实验方法，用于检测特定抗原与抗体之间的相互作用。
本实验旨在通过免疫沉淀反应，探究抗原与抗体之间的结合情况，从而深入了解免疫系统的工作原理。
实验材料与方法：1. 实验材料：- 抗原样品：选择目标抗原，如蛋白质或细胞表面分子。
- 抗体：选择与目标抗原特异性结合的抗体。
- 免疫沉淀缓冲液：用于提供适宜的反应环境。
- 洗涤缓冲液：用于去除非特异性结合物。
- SDS-PAGE凝胶：用于分离蛋白质。
- 蛋白质标记的二抗：用于检测目标抗原与抗体的结合。
- 蛋白质标记的探针：用于检测目标抗原的存在。
2. 实验方法：- 步骤一：制备免疫沉淀复合物将抗原样品与特异性抗体加入免疫沉淀缓冲液中，孵育一段时间，使抗原与抗体结合形成免疫沉淀复合物。
- 步骤二：免疫沉淀将免疫沉淀复合物加入待测样品中，使目标抗原与抗体结合，形成沉淀物。
- 步骤三：洗涤使用洗涤缓冲液洗涤沉淀物，去除非特异性结合物。
- 步骤四：蛋白质分离将洗涤后的沉淀物进行SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白质分离。
- 步骤五：蛋白质检测使用蛋白质标记的二抗与蛋白质标记的探针，检测目标抗原的存在。
实验结果与讨论：通过免疫沉淀反应实验，我们成功地观察到了抗原与抗体之间的结合现象。
在实验中，我们选择了一种特定的抗原，并与其特异性结合的抗体进行反应。
在免疫沉淀复合物形成后，我们将其加入待测样品中，并进行了洗涤和蛋白质分离的步骤。
通过SDS-PAGE凝胶电泳，我们成功地将目标抗原与抗体结合的蛋白质分离出来。
接下来，我们使用蛋白质标记的二抗与蛋白质标记的探针，对目标抗原进行了检测。
结果显示，目标抗原的存在得到了确认，进一步验证了抗原与抗体之间的结合情况。
这个实验结果对于研究免疫系统的工作原理具有重要意义。
免疫系统是人体抵御外界病原体入侵的重要防线，而抗原与抗体之间的结合是免疫系统中的关键步骤。
通过深入了解抗原与抗体的相互作用，我们可以更好地理解免疫系统的工作机制，为疾病的预防和治疗提供理论依据。
免疫沉淀步骤
免疫沉淀步骤
实验方法：免疫沉淀法
实验所需主要器材：4℃离心机、透析袋、离心管、微量加样器、实验所需主要试剂：透析液、蛋白A微球平衡液、蛋白A微球、正常兔血清、兔多克隆抗体、PBS、甘氨酸洗脱液（pH 3.5 ）实验步骤：
（一）透析去除小分子物质
4℃条件下，将收集各管蛋白并入透析袋内，放入透析外液（含Na2HPO4、NaCl, pH 8.0）约300毫升，每3~4小时换浓度降低透析外液。
最后将蛋白溶液装入离心管中，约6~8 ml.
(二)蛋白溶液的预处理
1、每1 ml 蛋白溶液加50 ul 正常兔血清或 IgG(浓度？)
2、冰上孵育2hr
3、平衡蛋白A 微球：将蛋白A 微球悬浮于洗脱缓冲液中，搅拌后10000g离心，弃洗液，置于冰上
4、将蛋白溶液与蛋白A微球混合
5、冰上30分钟，4000 g×3min,4 ℃离心。
小心将上清移至另一试管中
（增加蛋白A的浓度，彻底去处用于预处理的非特异性抗体）
（三）免疫复合物的沉淀
1、预处理的蛋白溶液置于适当数量的1.5ml的管中（0.5ml/管），加入抗血清1ul作为起始用量（滴定抗体量：范围0.5ul~5ul）
2、冰上孵育2hr
3、加入100ul蛋白A微球（10%的悬液），4℃摇动1hr
4、10000g×15sec,4℃ 离心，收集微球，
5、将0.5倍体积的的PBS pH7.4 ,与沉淀混匀15min, 离心后弃上清。
重复3次
（四）目的蛋白的洗脱
1、将0.5倍体积的pH3.5的甘氨酸-盐酸洗脱液与沉淀复合物颠倒混匀15min ，离心收集上清
2、重复2~3次，
3、取各管 SDS-PAGE,鉴定组份
仅供参考。
医学沉淀反应实验报告
一、实验目的1. 掌握医学沉淀反应的基本原理和方法。
2. 熟悉不同类型沉淀反应的特性和应用。
3. 通过实验，加深对蛋白质、抗原抗体反应等生物学现象的理解。
二、实验原理沉淀反应是指在一定条件下，可溶性抗原与相应抗体结合，形成不溶性的免疫复合物，从而出现沉淀现象。
根据沉淀反应的特点，可分为以下几种类型：1. 凝胶沉淀反应：抗原抗体在凝胶介质中形成凝胶状沉淀。
2. 絮状沉淀反应：抗原抗体在溶液中形成絮状沉淀。
3. 免疫电泳：抗原抗体在电场作用下，形成条带状沉淀。
沉淀反应广泛应用于医学诊断、疾病研究和药物开发等领域。
三、实验材料1. 实验试剂：抗原、抗体、缓冲液、凝胶介质等。
2. 实验仪器：离心机、电泳仪、凝胶成像系统等。
四、实验步骤1. 凝胶沉淀反应：（1）制备抗原抗体溶液；（2）将抗原抗体溶液加入凝胶介质；（3）将凝胶介质放入离心机，离心沉淀；（4）观察沉淀现象。
2. 絮状沉淀反应：（1）制备抗原抗体溶液；（2）将抗原抗体溶液混合；（3）观察沉淀现象。
3. 免疫电泳：（1）制备抗原抗体溶液；（2）将抗原抗体溶液加入电泳槽；（3）通电，观察沉淀现象。
五、实验结果1. 凝胶沉淀反应：观察到凝胶介质中形成凝胶状沉淀。
2. 絮状沉淀反应：观察到溶液中出现絮状沉淀。
3. 免疫电泳：观察到电泳槽中形成条带状沉淀。
六、讨论分析1. 通过凝胶沉淀反应，验证了抗原抗体之间的特异性结合。
2. 通过絮状沉淀反应，进一步证实了抗原抗体之间的结合。
3. 通过免疫电泳，观察到抗原抗体在电场作用下的迁移和沉淀现象，为疾病诊断提供了依据。
七、结论1. 本实验成功实现了凝胶沉淀反应、絮状沉淀反应和免疫电泳。
2. 通过实验，掌握了医学沉淀反应的基本原理和方法，加深了对抗原抗体反应等生物学现象的理解。
八、注意事项1. 实验过程中，严格遵守操作规程，确保实验结果的准确性。
2. 注意实验试剂的配制和储存，避免污染和变质。
3. 操作过程中，注意安全，避免发生意外。
免疫沉淀
（1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4℃裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清；（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；（3）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads 离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；（4）SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。
抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白A/G（ProteinA/G）或二抗偶联的agaose或Sepharose 珠子孵育，通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物，沉淀经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5-10min，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白.免疫沉淀的基本策略是基于抗原与抗体的高亲和力特性用抗体结合并纯化溶液中的目标分子。
抗原与抗体形成复合物后，即可利用琼脂糖微球链接的蛋白质A或蛋白质G将该复合物附着在琼脂糖微球上，通过离心即可将复合物分离出来。
对于含量极少的蛋白，免疫沉淀是一项很有效的纯化技术，可使目标蛋白纯化一万倍以上，再，经过SDS-PAGE分离，使原本很难检测的蛋白能够被检测到。
1.取蛋白质总量为500微克（蛋白样的质量选取，100微克以上，尽量大）的蛋白样品（之前先要测蛋白浓度，才能保证500微克蛋白样），加入适量RIPA缓冲液使其总体积为160微升，给蛋白和微球创造一个的反应空间，2.再加入3—5微克所需抗体（质量，抗体浓度蛋白样品和抗体比例怎样？100微克，需要1微克的抗体），混合后冰浴上反应1h （时间？）。
免疫沉淀(Immunoprecipitation)实验操作方法
免疫沉淀(Immunoprecipitation)实验操作方法免疫沉淀（Immunoprecipitation）实验操作方法实验原理：免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质如protein A/G特异性地结合到免疫球蛋白（抗体）FC片段的现象而开发出来的特异分离富集抗原的方法。
目前多用预先结合固化在Agarose beads上的protein A/G（Agrose-proteinA/G），使之与抗体结合，再通过抗体特异性结合抗原而形成Agrose-proteinA/G 、抗体、抗原复合物，利用Agarose beads的重量，通过离心即可特异分离富集目的抗原。
实验步骤：1.处理细胞：依据实验目的，设计实验，处理好细胞模型。
一般3×106细胞/处理(即六孔板一个孔，约200ug总蛋白)。
2.配IP 裂解液：200ul/孔（6孔板），并加入蛋白酶抑制剂，如果蛋白磷酸化水平影响实验结果则应加入磷酸酶抑制剂。
注意抑制剂的要现加现用。
3.收集细胞：冰上操作，裂解细胞前用1×PBS（4度）洗1遍，每孔加入200ul IP裂解液，冰上静置5分钟后刮下细胞并收集至EP管中。
4.超声：强度37％，5秒×4次（程序07）。
目的是使细胞裂解更完全并打断基因组DNA,但可能会影响蛋白质之间的相互作用，进行共免疫沉淀实验时要注意这一点。
5.离心细胞裂解液：4度10000rpm 10 分钟。
6.Agrose-proteinA/G清洗：一般1ug抗体对应15ul Agrose-proteinA/G（不同公司产品可能不同，注意结合说明书及实验结果考虑），预清洗细胞裂解液的Agrose-proteinA/G用量与结合抗体的用量一致。
取相应量的Agrose-proteinA/G到EP管中（剪枪头）并用500ul1×PBS（4度）洗两遍，5000rpm×2分钟，吸掉上清备用。
免疫沉淀(Immunoprecipitation)实验操作方法
免疫沉淀(Immunoprecipitation)实验操作方法免疫沉淀（Immunoprecipitation）实验操作方法实验原理：免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质如protein A/G特异性地结合到免疫球蛋白（抗体）FC片段的现象而开发出来的特异分离富集抗原的方法。
目前多用预先结合固化在Agarose beads上的protein A/G（Agrose-proteinA/G），使之与抗体结合，再通过抗体特异性结合抗原而形成Agrose-proteinA/G 、抗体、抗原复合物，利用Agarose beads的重量，通过离心即可特异分离富集目的抗原。
实验步骤：1.处理细胞：依据实验目的，设计实验，处理好细胞模型。
一般3×106细胞/处理(即六孔板一个孔，约200ug总蛋白)。
2.配IP 裂解液：200ul/孔（6孔板），并加入蛋白酶抑制剂，如果蛋白磷酸化水平影响实验结果则应加入磷酸酶抑制剂。
注意抑制剂的要现加现用。
3.收集细胞：冰上操作，裂解细胞前用1×PBS（4度）洗1遍，每孔加入200ul IP裂解液，冰上静置5分钟后刮下细胞并收集至EP管中。
4.超声：强度37％，5秒×4次（程序07）。
目的是使细胞裂解更完全并打断基因组DNA,但可能会影响蛋白质之间的相互作用，进行共免疫沉淀实验时要注意这一点。
5.离心细胞裂解液：4度10000rpm 10 分钟。
6.Agrose-proteinA/G清洗：一般1ug抗体对应15ul Agrose-proteinA/G（不同公司产品可能不同，注意结合说明书及实验结果考虑），预清洗细胞裂解液的Agrose-proteinA/G用量与结合抗体的用量一致。
取相应量的Agrose-proteinA/G到EP管中（剪枪头）并用500ul1×PBS（4度）洗两遍，5000rpm×2分钟，吸掉上清备用。
免疫沉淀试验原理、技术与应用
分辨率强，敏感度高，操作周期短， 仅需数小时，结果易于分析。
免疫沉淀试验原理、技术和应用
应用:M 蛋白的鉴定和分型
免疫沉淀试验原理、技术和应用
（五）交叉免疫电泳 （六）自动化免疫电泳
免疫沉淀试验原理、技术和应用
第四节 免疫沉淀试验的临床应用
免疫浊度法：蛋白质的检测 如免疫球蛋白、补体、类风湿因子、 C反应蛋白等
免疫浊度测定 免疫沉淀试验原理、技术和应用
三、 免疫沉淀试验的特点
1. 阶段性 2. 特异性 3. 抗原性质：可溶性 4. 抗体的选择：2价
免疫沉淀试验原理、技术和应用
第二节 液体免疫沉淀试验
免疫沉淀试验原理、技术和应用
第二节 液体免疫沉淀试验
一、絮状免疫沉淀试验
絮状免疫沉淀试验是将抗原与相应
电泳分析 ＋ 沉淀反应
优点：
1.加快反应的速度。 2.提高了灵敏度。
3.增加了分辨率。
免疫沉淀试验原理、技术和应用
抗原抗体反应 的高度特异性
电泳技术的高 分辨率、快速、 微量
•电泳（electrophoresis） ：在外加
电场的作用下带电颗粒向着其电性相 反的电极移动，称为电泳。
免疫沉淀试验原理、技术和应用
抗体混合，在电解质存在的条件下，
抗原抗体结合形成肉眼可见的絮状
沉淀物。
免疫沉淀试验原理、技术和应用
一、絮状免疫沉淀试验
抗原稀释法：抗原最适比例 抗体稀释法：抗体最适比例 方阵滴定法：抗原抗体最适比例
免疫沉淀试验原理、技术和应用
絮 状 沉 淀 示意图
各管抗原倍比稀释
Ag
加入抗血清
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128
免疫沉淀实验原理及步骤
免疫沉淀实验原理及步骤嘿，咱今儿就来聊聊免疫沉淀实验这档子事儿！这免疫沉淀实验啊，就好比是一场精准的捕捞行动。
你想啊，细胞里面那可是个热闹的小世界，各种蛋白质啊就像一群小鱼在里面游来游去。
咱要研究其中的某一种蛋白质，那可不得想个法子把它单独拎出来嘛！这免疫沉淀实验就是咱的秘密武器啦！先来说说原理哈。
简单说，就是利用抗体这个厉害的“捕鱼网”，去专门抓住我们想要的那种蛋白质。
这抗体可神奇了，它就像有一双火眼金睛，能准确无误地和目标蛋白质结合在一起。
然后呢，我们再通过一些手段，把这个带着目标蛋白质的“抗体-蛋白质复合物”给沉淀下来，这不就把目标给抓住啦！那具体步骤是咋样的呢？听我细细道来。
第一步，得准备好咱的“捕鱼工具”，也就是抗体啦。
这抗体可得选对喽，不然可就白忙活啦！然后把细胞裂解，让那些蛋白质都跑出来，这就相当于把小鱼们都赶到大海里啦。
第二步，把抗体加进去，让它去寻找目标蛋白质，这就开始捕鱼行动咯！等它们结合好了，就形成了那个复合物。
第三步，加入一些能让复合物沉淀下来的东西，就像撒下一张大网，把它们一网打尽。
第四步，把沉淀下来的东西收集起来，这可就是我们的宝贝啦！然后通过各种检测手段，去看看我们抓到的是不是我们想要的那条“鱼”。
你说这免疫沉淀实验是不是很有意思呀？就像一场充满挑战和惊喜的冒险！它能帮助我们深入了解细胞里那些神秘的蛋白质，解开好多生物学的谜团呢！在做这个实验的时候啊，可得细心再细心，就像渔夫捕鱼一样，稍有疏忽可能就错过了好猎物。
而且要注意各种条件的控制，温度啦、时间啦，都得把握好，不然可就前功尽弃啦！总之呢，免疫沉淀实验是生物学研究中非常重要的一个手段，它让我们能更近距离地观察和研究那些神奇的蛋白质。
怎么样，听我这么一说，是不是对免疫沉淀实验有了更清楚的认识啦？赶紧去试试吧，说不定你就能发现新的秘密呢！。
医学免疫学沉淀反应
医学免疫学沉淀反应在医学免疫学的领域中，沉淀反应是一项十分重要的实验技术。
它不仅有助于我们对疾病的诊断和监测，还在科研领域发挥着关键作用。
沉淀反应的原理其实并不复杂。
简单来说，就是当可溶性抗原与相应抗体在特定条件下结合时，会形成肉眼可见的沉淀物。
这一过程基于抗原与抗体的特异性结合，只有当两者的结构和电荷相互匹配时，才能发生有效的反应。
沉淀反应的类型多种多样。
其中，环状沉淀反应是比较经典的一种。
在这种反应中，将抗原溶液小心地叠加在抗体溶液之上，在两者的界面处，如果存在对应的抗原抗体，就会形成白色的沉淀环。
这种方法虽然简单直观，但灵敏度相对较低，如今在实际应用中已经不那么常见。
另一种常见的沉淀反应是絮状沉淀反应。
在这个实验中，抗原和抗体溶液混合后，会出现肉眼可见的絮状沉淀物。
然而，这种反应的结果判断往往比较主观，容易受到多种因素的影响，比如溶液的浓度、温度以及混合的方式等。
相较于上述两种方法，免疫比浊法在现代医学中的应用更为广泛。
它通过测量溶液中抗原抗体复合物形成后导致的浊度变化，来定量分析抗原或抗体的含量。
这种方法具有快速、准确、自动化程度高等优点，尤其适用于临床实验室对大量样本的检测。
在实际应用中，沉淀反应有着广泛的用途。
比如在疾病诊断方面，当我们怀疑一个人感染了某种病原体时，可以通过检测患者血清中针对该病原体的特异性抗体来辅助诊断。
如果检测结果显示存在相应的沉淀反应，就提示患者可能已经感染了该病原体。
再比如，在血液制品的质量检测中，沉淀反应可以帮助检测其中是否存在杂质或异常蛋白。
这对于保障血液制品的安全性和有效性至关重要。
不仅如此，沉淀反应在自身免疫性疾病的诊断中也发挥着重要作用。
自身免疫性疾病患者体内常常会产生针对自身组织或细胞的抗体，通过沉淀反应检测这些抗体的存在，可以为疾病的诊断提供有力的依据。
然而，沉淀反应也并非完美无缺。
它可能会受到一些因素的干扰。
比如，标本的采集和处理不当可能会影响抗原或抗体的活性，从而导致假阴性或假阳性结果。
免疫沉淀原理及步骤
免疫沉淀原理及步骤
免疫沉淀是一种常用的免疫学实验技术，它主要用于检测特定抗原与抗体的相
互作用。
在免疫沉淀实验中，抗体与抗原结合后形成免疫复合物，通过沉淀技术可以将免疫复合物从混合物中分离出来，从而进行进一步的分析和研究。
本文将介绍免疫沉淀的原理及步骤，希望能对相关实验工作者有所帮助。
原理：
免疫沉淀的原理主要是利用抗体与抗原的特异性结合来实现对特定蛋白质的沉淀。
在实验中，首先将样品与特异性抗体孵育，使抗体与抗原结合形成免疫复合物，然后通过添加沉淀剂（如蛋白A/G琼脂糖或蛋白A/G琼脂糖磁珠）来沉淀免疫复
合物，最后通过洗涤和离心等步骤将免疫复合物分离出来。
步骤：
1. 样品制备，将待检样品进行适当处理，如细胞裂解、蛋白抽提等，获得目标
蛋白质的混合物。
2. 抗体孵育，将特异性抗体加入样品混合物中，使其与目标蛋白质发生特异性
结合，形成免疫复合物。
3. 沉淀，加入沉淀剂，如蛋白A/G琼脂糖或蛋白A/G琼脂糖磁珠，将免疫复
合物沉淀下来。
4. 洗涤，用洗涤缓冲液对沉淀物进行洗涤，去除非特异性结合的蛋白质和杂质。
5. 离心，通过离心将沉淀物沉淀到管底，去除洗涤缓冲液。
6. 分析，将沉淀物进行进一步的分析，如Western blot、质谱分析等，以获取
所需的数据和结果。
总结：
免疫沉淀作为一种重要的免疫学实验技术，广泛应用于蛋白质相互作用、蛋白质纯化等领域。
掌握免疫沉淀的原理及步骤，对于开展相关实验具有重要的指导意义。
希望本文所介绍的免疫沉淀原理及步骤能够为实验工作者提供帮助，使其能够准确、高效地开展免疫沉淀实验，为科研工作的开展提供有力支持。
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• （3）用梅花孔做血清流行病学调查时，将标准抗原放中
心孔，周围1、3、5孔加标准阳性血清，2、4、6加待检 血清。待检孔与阳性孔出现的沉淀带完全融合的为阳性。 待检血清无沉淀带或所出现的沉淀带与阳性对照沉淀带完 全交叉的为阴性。待检孔虽然未出现沉淀带，但两阳性孔 的沉淀带在接近待检孔时，两端均匀向内有所弯曲为弱阳 性。若仅一端有所弯曲，另一端仍为直线着，为可疑，需
D：浓度Ag＞Ab，扩散率近似； E：浓度Ag＞Ab，扩散率Ag＞Ab ； F：浓度Ag＜Ab，扩散率Ag＜Ab ；
2.抗原性质分析
1表示待检Ag
2表示标准Ag
待检Ag与标准抗原完全吻合
待检Ag中含有与标准Ag相同的
Ag；还有另外的Ag与Ab相对应 待检Ag有与Ab相对应的Ag，但 与标准Ag不同 待检Ag与标准Ag性质相同；但
实验九 免疫沉淀反应实验
概念
•沉淀反应:(precipitation) 可溶性抗原与相应抗体，在适宜条件下 发生结合，出现的沉淀现象。 •液相内沉淀试验：指抗原抗体在以生理盐水 或其它无机盐缓冲液为反应介质的液相内 自由接触，短时间可出现反应。 •凝胶内沉淀试验：指琼脂糖内扩散或凝胶内
扩散试验。
模拟图
周围孔待检血清。加样时勿使样品外溢或在边缘残存小气泡， 以免影响扩散结果。并设立阴性血清和阳性血清对照。
• 5 扩散：加样完毕后，将琼脂板放于湿盒中，保持一定的温
度，放置37℃温箱中24~48小时观察结果。
结果判定
• （1）若凝胶中抗原抗体是特异性的，则形成抗原抗体复合
物，在两孔之间出现清晰度致密白色的沉淀线，为阳性反 应。若在72h仍为出现沉淀线则为阴性。
• （2）抗原特异性与沉淀线形状的关系是：如相邻两孔的抗
原完全相同，与抗体反应会出现两条沉淀线的融合。反之， 如相邻孔抗原完全不同，则出现沉淀线的交叉。两种抗原 部分相同时，出现沉淀线的部分融合。两相邻孔抗原及其
浓度相同，形成对称相融合的沉淀线。如果两相邻孔抗原
相同但浓度不同，沉淀线不对称，移向低浓度侧。
含量较低；
1.周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。
2.以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为 该抗体的效价。 3.可进行任意稀释。
“1” 为单一抗原抗体系统。 “n” 为多个抗原抗体系统。 *可以用混合抗原鉴定抗体纯度。
*可以用混合抗体鉴定抗原纯度。
琼脂免疫扩散为例
• 琼脂免疫扩散是可溶性抗原与相应抗体在琼脂凝
• 实验材料 • 0.15mol/L pH7.2 PBS • 1.2%琼脂（PBS配制，加入０.０１％硫柳
汞防腐） • 已知浓度和未知浓度的抗原，已知抗体。 • 载玻片，打孔器，微量加样器，酒精灯， 等
操作方法
• 1 制板：用吸管吸取3.5ml加热融化的1.2%琼脂浇注于一块
清洁的载玻片上，厚度2.5~3.0mm，注意勿产生气泡。
Ag
原理示意图
Ab
1.抗原抗体双向自由扩散 2.24小时出结果 3.呈现沉淀线或弧
染色标本图
1.检测未知抗原或抗体 2.抗原性质分析
3.抗体效价滴定
4.抗原或抗体纯度鉴定
A Ag
B
C
D
E
F
Ab
A: 浓度Ag、Ab及扩散率近似；
B：浓度Ag、Ab近似，扩散率Ag＞Ab ； C：浓度Ag、Ab近似，扩散率Ag＜Ab ；
胶中所呈现的一种沉淀反应。琼脂是一种含有硫 酸基的多醣体，高温时能溶于水，冷却后凝固， 形成凝胶。琼脂凝胶呈多孔结构，孔内充满水分， 其孔径大小决定于琼脂浓度。1%琼脂凝胶的孔径 约85nm，因此允许各种抗原，抗体在琼脂凝胶中 自由扩散。抗原，抗体在含有电解质的琼脂凝胶 中扩散，由近及远形成浓度梯度，当二者在比例 恰当处相遇时，即发生沉淀反应，形成肉眼可见 的白色沉淀线，此种反应称为琼脂免疫扩散，又 简称琼脂扩散或免疫扩散。
重新检查。
• 2 打孔：待琼脂凝固后用打孔器打孔Байду номын сангаас孔径和孔距依不同疫
病检疫规程而定，一般孔径3~5mm，孔间距4~7mm。孔型 多为7孔，中央1孔，周围6孔。用针头挑出孔内琼脂。
• 3 封底：将琼脂板无凝脂面在酒精灯火焰上轻轻灼烧，用手
背感觉稍稍烫就行。
• 4 抗体效价测定：用微量加样器于中央孔加入已知抗原，于