第6章 免疫沉淀试验
免疫沉淀
免疫沉淀经典的免疫沉淀是可溶性抗原与其抗体产生可见沉淀反应的血清学试验。
后来发展为抗原抗体结合后，用固相化的蛋白A或蛋白G小珠等来吸附分离抗原抗体复合体，达到检测微量抗原或抗体的目的。
（1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂）（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；（3）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；（4）SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
免疫沉淀的实验过程比较简单，一般分为3个阶段；①抗原溶液的制备；②裂解物非特异性本底的预处理；③免疫复合物的形成与纯化。
免疫沉淀的第一步是制备抗原溶液。
任何抗原溶液均可作为免疫沉淀的材料来源，但免疫沉淀一般采用细胞或组织制备的裂解物。
裂解物的制备可采用多种方法，其中首选用温和的去污剂如非离子去污剂来裂解细胞。
该方法能溶解细胞膜，破坏蛋白质之间许多微弱的相互作用，释放出大多数细胞内抗原。
更重要的是方法十分温和，不破坏大多数抗原的结构和酶的活力。
如果对抗原结构的完整或活力要求不严，或者抗原结合较为紧密，可以采用比较剧烈的条件来制备裂解物，如在强变性剂的溶液中进行煮沸，然后在免疫沉淀前经过稀释去除变性剂。
一旦细胞裂解液制备好，即可进行预处理。
免疫沉淀一般用于分析抗原的生化特性，因此要求抗原的纯度尽可能高。
抗原和抗体的相互作用与其各自的内在性质有关，故提高该技术信—噪比最容易的方法是降低本底。
如用不与待检抗原结合的非特异性抗体预处理，可以从抗原溶液中除去非特异性结合蛋白，即此法第一次是用非免疫抗体降低本底，第二次再用所研究的抗体，这样进行二次免疫沉淀是达到纯化免疫沉淀物最有效的方法。
免疫共沉淀试验原理及方法
免疫共沉淀试验原理及方法免疫共沉淀试验基于抗体-抗原相互作用的原理进行。
首先，通过对目标蛋白质进行免疫反应，用特异性的抗体与目标蛋白质形成抗原-抗体复合物。
然后，将抗体与目标蛋白质的复合物与磷酸化的蛋白质、蛋白质复合物或其他特定蛋白质结合，形成更大的复合物。
最后，通过沉淀这些复合物，从而使复合物分离于整个细胞提取物中。
1.固相免疫共沉淀：该方法使用固相支持材料，如蛋白A或蛋白G结合的琼脂糖磁珠或亲和树脂柱。
首先，将目标蛋白质与特异性抗体免疫反应，然后将抗体与蛋白A或蛋白G结合的支持材料结合。
接下来，将细胞提取物与抗体-蛋白质复合物和支持材料一起孵育。
随后，用磁力或离心将复合物分离，并通过洗涤去除非特异性结合的蛋白质。
最后，用洗涤液溶解复合物，并通过离心或磁力分离来收集目标蛋白质及其相互作用伴侣。
2.液相免疫共沉淀：该方法使用溶液中的特异性抗体与目标蛋白质进行免疫反应。
首先，将目标蛋白质与特异性抗体免疫反应，然后添加蛋白A或蛋白G结合的琼脂糖磁珠或亲和树脂，形成抗体-蛋白质复合物。
接下来，将细胞提取物加入到抗体-蛋白质复合物中，使复合物与目标蛋白质的相互作用伴侣结合。
随后，用磁力或离心将复合物分离，并通过洗涤去除非特异性结合的蛋白质。
最后，用洗涤液溶解复合物，并通过离心或磁力分离来收集目标蛋白质及其相互作用伴侣。
1.直接鉴定特定蛋白质的相互作用伴侣。
2.可以识别特定蛋白质的翻译后修饰形式，如磷酸化、乙酰化等。
3.可以从复杂的细胞提取物中寻找目标蛋白质的结合伴侣。
然而，免疫共沉淀试验也存在一些局限性，包括：1.需要具有较高特异性的抗体。
2.可能产生伪阳性结果，特别是在存在非特异性结合的情况下。
3.难以从细胞提取物中完全分离复合物。
总结：免疫共沉淀试验是一种常用的实验技术，可以用于寻找细胞中特定蛋白质的相互作用伴侣或靶向蛋白的修饰形式。
根据不同的实验需求，可以选择固相免疫共沉淀或液相免疫共沉淀方法进行。
技能训练6 沉淀试验
技能训练6 沉淀试验一、目的要求1、掌握环状沉淀反应的操作方法及结果判定2、掌握双向免疫扩散试验的操作方法及结果分析二、内容与方法（一）环状沉淀反应1、材料待测血迹干燥纸片抗人血清抗体、抗羊血清抗体和抗鸡血清抗体生理盐水环状沉淀管及管架、吸管等。
2、方法（1）、取环状沉淀管3支，分别加入抗人、抗羊和抗鸡血清抗体各0.1ml 于管底部，并注明，置于管架上。
（2）、另取3支试管，分别将3种血迹纸片加入，再各加生理盐水1ml，室温5-10分钟后将溶液摇匀。
（3）、吸取上清液分别加入上述含有抗人、抗羊、抗鸡血清抗体的环状沉淀管内，并使两者形成一清晰交界面。
置室温下1-5分钟观察结果。
3、结果分析根据是否与已知抗血清出现白色沉淀环，判定血迹类型。
4、注意事项（1）、因血清分子密度及比重均大于生理盐水，故当加入含有抗原的生理盐水时只需将沉淀管倾斜，加抗原的吸管勿接触抗血清，使含抗原的生理盐水沿管壁缓缓流下，再将沉淀管直立即可呈一清晰交界面。
（2）、在加抗原时，吸管的头部切勿触及抗血清，否则不仅使抗原抗体混合，不能呈清晰交界面，而且如再用此吸管加抗原于另一支含不同抗血清的沉淀管后，必然会出现交叉反应，无法判定结果。
（二）双向扩散试验1、材料1% 琼脂糖，玻片或培养皿，凝胶打孔器（直径3mm ），水浴箱，10ml吸管，5 μl 微量加样器，抗原，抗体。
2、方法1 ）取一张玻璃片，用水冲洗干净，再用少量75% 乙醇冲洗，晾干后置于水平台备用。
2 ）将1% 琼脂糖融化，56 ℃水浴中保温。
3 ）将1% 凝胶约3ml 铺于玻片上，待凝固后打孔，直径3mm ，间距10mm 。
（如图所示）4 ）中心孔加5 μl 抗体，周围孔内每孔加5 μl 抗原样品（抗原抗体均需预先做系列稀释以获得适宜的抗原抗体比例）。
5 ）将凝胶板置于湿盒，室温过夜（24h 以上）后观察结果。
3、结果分析1 ）阳性结果为在抗原孔与抗体孔之间出现沉淀线。
沉淀反应
第六章沉淀反应沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在特定条件下发生特异性结合时出现的沉淀现象。
第一节沉淀反应的特点沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素等可溶性物质。
沉淀反应分两个阶段，第一阶段为抗原抗体发生特异性结合，几秒到几十秒即可完成，出现可溶性小的复合物，肉眼不可见；第二阶段为形成可见的免疫复合物，约需几十分钟到数小时才能完成，如沉淀线、沉淀环。
第二节液体内沉淀试验一、絮状沉淀试验抗原抗体溶液在电解质的存在下结合，形成絮状沉淀物，这种絮状沉淀受抗原和抗体比例的直接影响，因此常用来作为测定抗原抗体反应最适比例的方法，常见类型有：（一）抗原稀释法抗原进行一系列稀释与恒定浓度抗血清反应。
（二）抗体稀释法抗体进行一系列稀释与恒定浓度抗原反应。
（三）方阵滴定法方阵滴定法即棋盘滴定法。
二、免疫浊度测定属于液体内沉淀反应，其特点是将现代光学测量仪器与自动化检测系统相结合应用于沉淀反应，可进行液体中微量抗原、抗体及小分子半抗原定量检测。
（一）免疫比浊测定的影响因素1.抗原抗体的比例是浊度形成的关键因素。
当抗原过量时，形成的IC分子小，而且会发生再解离，使浊度反而下降，光散射亦减少，这就是高剂量钩状效应。
当抗体过量时，IC的形成随着抗原递增而增加，至抗原、抗体最适比例处达最高峰，这就是经典的海德堡曲线理论。
在反应体系中保持抗体适当过量，如形成抗原过量则造成测定的准确性降低。
2.抗体的质量对免疫比浊测定法的抗体要求（1）特异性强：抗血清最核心的要求是单价特异性，即该抗体只针对某一种抗原，与其他无关抗原不发生交叉反应，特异性抗体和相应抗原结合后形成的浊度代表真实的试验结果。
（2）效价高：低效价（＜1:20）抗体会增加非特异性浊度（伪浊度）的产生。
（3）亲和力强：则抗体的活性高，不仅可以加快抗原抗体反应的速度，而且形成的IC较牢固，不易发生解离。
在速率比浊法中尤为重要。
（4）R型和H型抗体：根据抗血清来源的动物种类不同，分为R型抗体和H型抗体。
免疫沉淀反应实验报告
免疫沉淀反应实验报告免疫沉淀反应实验报告免疫沉淀反应是一种常用的实验方法，用于检测特定抗原与抗体之间的相互作用。
本实验旨在通过免疫沉淀反应，探究抗原与抗体之间的结合情况，从而深入了解免疫系统的工作原理。
实验材料与方法：1. 实验材料：- 抗原样品：选择目标抗原，如蛋白质或细胞表面分子。
- 抗体：选择与目标抗原特异性结合的抗体。
- 免疫沉淀缓冲液：用于提供适宜的反应环境。
- 洗涤缓冲液：用于去除非特异性结合物。
- SDS-PAGE凝胶：用于分离蛋白质。
- 蛋白质标记的二抗：用于检测目标抗原与抗体的结合。
- 蛋白质标记的探针：用于检测目标抗原的存在。
2. 实验方法：- 步骤一：制备免疫沉淀复合物将抗原样品与特异性抗体加入免疫沉淀缓冲液中，孵育一段时间，使抗原与抗体结合形成免疫沉淀复合物。
- 步骤二：免疫沉淀将免疫沉淀复合物加入待测样品中，使目标抗原与抗体结合，形成沉淀物。
- 步骤三：洗涤使用洗涤缓冲液洗涤沉淀物，去除非特异性结合物。
- 步骤四：蛋白质分离将洗涤后的沉淀物进行SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白质分离。
- 步骤五：蛋白质检测使用蛋白质标记的二抗与蛋白质标记的探针，检测目标抗原的存在。
实验结果与讨论：通过免疫沉淀反应实验，我们成功地观察到了抗原与抗体之间的结合现象。
在实验中，我们选择了一种特定的抗原，并与其特异性结合的抗体进行反应。
在免疫沉淀复合物形成后，我们将其加入待测样品中，并进行了洗涤和蛋白质分离的步骤。
通过SDS-PAGE凝胶电泳，我们成功地将目标抗原与抗体结合的蛋白质分离出来。
接下来，我们使用蛋白质标记的二抗与蛋白质标记的探针，对目标抗原进行了检测。
结果显示，目标抗原的存在得到了确认，进一步验证了抗原与抗体之间的结合情况。
这个实验结果对于研究免疫系统的工作原理具有重要意义。
免疫系统是人体抵御外界病原体入侵的重要防线，而抗原与抗体之间的结合是免疫系统中的关键步骤。
通过深入了解抗原与抗体的相互作用，我们可以更好地理解免疫系统的工作机制，为疾病的预防和治疗提供理论依据。
主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验 复习习题第六章沉淀反应(附答案解析)
主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验复习习题第六章沉淀反应（附答案解析）一、A1题型1、免疫比浊实验属于（）A、中和反应B、凝集反应C、沉淀反应D、补体结合反应E、溶血反应2、免疫固定电泳的英文缩写是（）A、ECLB、RIEC、RIAD、IFEE、IEP3、对流免疫电泳的原理是（）A、单向免疫扩散与电泳相结合的定向加速的免疫扩散技术B、双向免疫扩散与电泳相结合的定向加速的免疫扩散技术C、单向免疫扩散与两相反向的规律改变的电流相结合的免疫扩散技术D、双向免疫扩散与两相反向的规律改变的电流相结合的免疫扩散技术E、抗原抗体反应与电泳相结合的定向免疫扩散技术的统称4、能够定量测定待检标本的免疫学试验是（）A、间接凝集试验B、协同凝集试验C、单向扩散试验D、双向扩散试验E、对流免疫电泳5、免疫比浊法对抗体的要求不正确的是（）A、特异性强B、效价高C、亲和力强D、使用H型抗体E、使用R型抗体6、免疫比浊法的基本原则是（）A、反应体系中保持抗原过量B、反应体系中保持抗体过量C、反应体系中保持抗原抗体为最适比例D、抗体特异性强E、抗体亲和力强7、直接影响絮状沉淀实验的因素是（）A、抗原分子量B、抗体分子量C、抗原抗体比例D、反应体系的PHE、反应体系的例子强度8、免疫沉淀法目前应用最广、定量比较准确的主要是下列哪种方法（）A、免疫比浊法B、絮状沉淀试验C、单向扩散试验D、双向扩散试验E、棋盘滴定法9、关于双向扩散试验，下列说法错误的是（）A、可用于抗原抗体定性分析B、抗原或抗体相对分子量的分析C、可用于抗原纯度分析D、可用于抗原抗体半定性分析E、可用于抗体效价的滴定10、关于免疫电泳技术的基本原理，说法正确的是（）。
A、应将凝胶扩散置于交流电场中B、抗原及抗体在一定条件下离解成为带正电或负电的电子，在电场中向同相电荷的电极移动C、电子所带净电荷量越多、颗粒越小，泳动速度越慢D、电流会阻碍抗原、抗体的运行速度，延长两者结合的时间E、多种带电荷的物质电泳存在，抗原决定簇不同的成分可得以区分11、下列说法错误的是（）。
第06章 免疫沉淀试验
第三节
凝胶内沉淀试验
免疫电泳流程图
第三节
凝胶内沉淀试验
（三）免疫电泳
免疫电泳结果示意图
第三节
凝胶内沉淀试验
（四）免疫固定电泳 区带电泳+沉淀反应 原理： 先将血清蛋白质在琼脂糖凝胶介质上经区带电泳分 离，再将固定剂和各型免疫球蛋白及轻链抗血清加在凝 胶表面的泳道上，经孵育后，固定剂和抗血清在凝胶内 渗透并扩散，抗原抗体直接发生沉淀反应，洗脱游离的 抗体，形成的抗原抗体复合物则保留在凝胶中。经漂洗 和染色，参考泳道和抗原抗体沉淀区带被着色，根据电 泳移动距离分离单克隆组分，可对各类免疫球蛋白及其 轻链进行分型。 最大的优势：分辨率强，敏感度高，操作周期短， 结果易分析。
第三节
凝胶内沉淀试验
（一）对流免疫电泳 原理： 双向免疫扩散+电泳技术 比双向免疫扩散法灵敏度提高8倍～16倍 （负极） （正极）
抗原等电点低，带较 强的负电荷，分子量 小，在电场中向正极 移动
抗体等电点偏高，带负电荷 较少，且分子量较大，在电 渗作用下，抗体移向负极
抗原抗体浓度最适比处形成沉淀线
扩散，在浓度比例恰当处形成沉淀线，观察沉淀线的位置
、形状及对比关系，可对抗原或抗体进行定性分析。 根据试验形式可分为试管法和平板法。
第三节
凝胶内沉淀试验
二、双向免疫扩散试验（平板法）
平板法是鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法
之一。
基本步骤是：打孔→在各对应孔中加入抗原或抗 体→湿盒37℃18h～24h→观察沉淀线。
第三节
应用：
凝胶内沉淀试验
二、双向免疫扩散试验（平板法）
1.判断抗原或抗体的存在以及估计相对含量 2.分析抗原或抗体相对分子量
临床检验主管技师 临床免疫学和免疫检验 第六章 沉淀反应
第六章沉淀反应沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在特定条件下发生特异性结合时出现的沉淀现象。
第一节沉淀反应的特点沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素等可溶性物质。
沉淀反应分两个阶段，第一阶段为抗原抗体发生特异性结合，几秒到几十秒即可完成，出现可溶性小的复合物，肉眼不可见；第二阶段为形成可见的免疫复合物，约需几十分钟到数小时才能完成，如沉淀线、沉淀环。
第二节液体内沉淀试验一、絮状沉淀试验抗原抗体溶液在电解质的存在下结合，形成絮状沉淀物，这种絮状沉淀受抗原和抗体比例的直接影响，因此常用来作为测定抗原抗体反应最适比例的方法，常见类型有：（一）抗原稀释法抗原进行一系列稀释与恒定浓度抗血清反应。
（二）抗体稀释法抗体进行一系列稀释与恒定浓度抗原反应。
（三）方阵滴定法即棋盘滴定法。
二、免疫浊度测定属于液体内沉淀反应，其特点是将现代光学测量仪器与自动化检测系统相结合应用于沉淀反应，可进行液体中微量抗原、抗体及小分子半抗原定量检测。
（一）免疫比浊测定的影响因素1.抗原抗体的比例是浊度形成的关键因素。
当抗原过量时，形成的IC分子小，而且会发生再解离，使浊度反而下降，光散射亦减少，这就是高剂量钩状效应。
当抗体过量时，IC的形成随着抗原递增而增加，至抗原、抗体最适比例处达最高峰，这就是经典的海德堡曲线理论。
在反应体系中需保持抗体适当过量，如形成抗原过量则造成测定的准确性降低。
2.抗体的质量对免疫比浊测定法的抗体要求（1）特异性强（2）效价高：低效价（＜1:20）抗体会增加非特异性浊度（伪浊度）的产生。
（3）亲和力强：则抗体的活性高，可加快抗原抗体反应的速度，且形成的IC较牢固，不易发生解离。
（4）R型和H型抗体：R型抗体是指以家兔为代表的小型动物被注射抗原免疫后制备的抗血清。
这类抗血清的特点是亲和力较强，抗原抗体结合后不易发生解离。
H型抗体是指以马为代表的大型动物注射抗原后制备的抗血清，这类抗血清的亲和力弱，抗原抗体结合后极易解离。
临床免疫学与检验课件：沉淀反应
火箭免疫電泳
影響因素
1.瓊脂（無電滲或電滲很小的）影響火箭形狀不規 則。 2.電泳終點時間的確定。 3.標本數量多時應先通電後加樣,防止寬底峰形. 4.IgG定量時，可用甲醛與IgG上的氨基結合（甲 醯化），抵消了電滲作用。
火箭免疫電泳示意圖
+
-
火箭免疫電泳圖 ①②③④為標準抗原；⑤⑥為標本
三、免疫電泳
電泳時凝膠中抗體不移動，樣品孔中的 抗原向正極泳動，隨著抗原量的逐漸減 少，抗原泳動的基底區越來越窄，抗原 抗體分子複合物形成的沉澱線逐漸變窄， 形成一個形狀如火箭的不溶性複合物沉 澱峰，抗體濃度固定時，峰的高度與抗 原量呈正相關。
火箭免疫電泳
技術要點
1.2%巴比妥瓊脂糖約55℃，加入適量抗 血清，混勻後制板，打孔，孔內加待測樣 品，樣品孔放負極側， 6h後觀察瓊脂板 上沉澱峰，繪製標準曲線，求出待測樣品 濃度。
單向擴散試驗（平板法）
傾注平板 打孔 加樣 放置37℃ 24～48h觀察沉澱環
單向擴散試驗 （平板法）
沉澱環的直徑與待測標本含量兩種計算方法
Mancini曲線： 大分子抗原（IgM）
時間擴散＞48h， 常數K＝C∕d2 普通座標紙曲線
Fahey曲線： 小分子抗原（IgG,IgA）
擴散時間24h 常數K＝logC∕d 半對數座標紙曲線
單克隆抗體；多克隆抗體； 可出現假性降低與增高
• 雙環現象
不同擴散率抗原性相同的兩個 組分
單向擴散試驗 上排為5個不同濃度的參考品； 下排為患者血清，下排右2為異常病 理血清
二、雙向擴散試驗 （平板法）
鑒定抗原抗體的最基本、最常見的方法之一
原理：將抗原抗體 分別加在瓊脂糖 不同的對應孔中， 兩者在凝膠中自 由擴散，在比例 合適處形成白色 沉澱線。
临床免疫学和免疫检验第六章沉淀反应讲义
第六章沉淀反应沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在特定条件下发生特异性结合时出现的沉淀现象。
第一节沉淀反应的特点沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素等可溶性物质。
沉淀反应分两个阶段，第一阶段为抗原抗体发生特异性结合，几秒到几十秒即可完成，出现可溶性小的复合物，肉眼不可见; 第二阶段为形成可见的免疫复合物，约需几十分钟到数小时才能完成，如沉淀线、沉淀环。
第二节液体内沉淀试验一、絮状沉淀试验抗原抗体溶液在电解质的存在下结合，形成絮状沉淀物，这种絮状沉淀 因此常用来作为测定抗原抗体反应最适比例的方法，常见类型有:抗原进行一系列稀释与恒定浓度抗血清反应。
抗体进行一系列稀释与恒定浓度抗原反应。
方阵滴定法即棋盘滴定法。
二、免疫浊度测定属于液体内沉淀反应，其特点是将现代光学测量仪器与自动化检测系统相结合应用于沉淀反应，可进 行液体中微量抗原、抗体及小分子半抗原定量检测。
（一）免疫比浊测定的影响因素1. 抗原抗体的比例 是浊度形成的关键因素。
当抗原过量时，形成的IC 分子小，而且会发生再解离，使浊度反而下降，光散射亦减少，这就是高剂量钩状效应。
当抗体过量时，IC 的形成随着抗原递增而增加，至抗原、抗体最适比例处达最高峰，这就是 经典的海德堡曲线理论。
在反应体系中保持抗体适当过量，如形成抗原过量则造成测定的准确性降低。
2. 抗体的质量 对免疫比浊测定法的抗体要求（1） 特异性强 （2） 效价高（3） 亲和力强：则抗体的活性高，不仅可以加快抗原抗体反应的速度，而且形成的IC 较牢固，不易 发生解离。
在速率比浊法中尤为重要。
（4） R 型和H 型抗体：根据抗血清来源的动物种类不同，分为R 型抗体和H 型抗体。
R 型抗体是指以家兔为代表的小型动物 被注射抗原免疫后制备的抗血清。
这类抗血清的特点是 亲和力较强，抗原抗体结合后不易发生解离。
H 型抗体是指以 马为代表的大型动物 注射抗原后制备的抗血清, 这类抗血清的 亲和力弱，抗原抗体结合 后极易解离。
临床免疫学检验 课件 第6章 沉淀反应 2
1898年Kraus首次发现毒素-抗毒素的沉 淀现象；
1905年Bechgold 发现沉淀可以在明胶中 进行；
1965年Mancini发明单向免疫扩散技术；
上世纪70年代免疫浊度法出现。
上述技术的发明发展，使得沉淀反应向 快速、准确、微量、自动化方向发展， 在医学检验中的应用越来越广泛。
沉淀反应分两个阶段
把抗原液小心地加于 已含抗体液的细试管液
?方法评价： 敏感度较低、简便、 快速、实用、只能 定性不能定量、缺
面上，当对应的抗原与 乏多对分辨力。
抗体相遇，在界面处形 ?临床意义：
成清晰的乳白色沉淀环。 鉴定血迹、
诊断炭疽
操作步骤
环状沉淀示意图
环
状
沉
淀
示
意
图
?沉淀管内径 1.5～2mm Ag ?1～5min出现沉淀环为阳性 Ab ?30min不出现沉淀环为阴性
将抗原作系列稀释，与恒量浓度的抗血清等量混合反应后，产生的沉淀物 随抗原量的变化而不同。抗原抗体比例适当时，形成的沉淀物最多。
抗体稀释法：抗体最适比例
将抗体作系列稀释，与恒量浓度的抗血清等量混合反应后，产生的 沉淀物随抗体量的变化而不同。
方阵滴定法：抗原抗体最适比例
将以上两种方法结合，将抗原抗体同时稀释，找出最佳比例。
一、絮状沉淀试验 ( flocculation test)
? 原理
抗原溶液与相应抗体 溶液混合，在电解质存 在下，抗原与抗体结合 出现可见的絮状沉淀。
?操作步骤 ?方法评价：
敏感度较低、简便、 易受抗原抗体比例 影响--最适比 ?临床意义： 测定抗原抗体反应 的最适比。
絮状沉淀试验
抗原稀释法：抗原最适比例
临床检验技士-临床免疫学和免疫检验 讲义 06
第六章沉淀反应沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在特定条件下发生特异性结合时出现的沉淀现象。
第一节沉淀反应的特点沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素等可溶性物质。
沉淀反应分两个阶段，第一阶段为抗原抗体发生特异性结合，几秒到几十秒即可完成，出现可溶性小的复合物，肉眼不可见；第二阶段为形成可见的免疫复合物，约需几十分钟到数小时才能完成，如沉淀线、沉淀环。
第二节液体内沉淀试验一、絮状沉淀试验抗原抗体溶液在电解质的存在下结合，形成絮状沉淀物，这种絮状沉淀受抗原和抗体比例的直接影响，因此常用来作为测定抗原抗体反应最适比例的方法，常见类型有：（一）抗原稀释法抗原进行一系列稀释与恒定浓度抗血清反应。
（二）抗体稀释法抗体进行一系列稀释与恒定浓度抗原反应。
（三）方阵滴定法即棋盘滴定法。
二、免疫浊度测定属于液体内沉淀反应，其特点是将现代光学测量仪器与自动化检测系统相结合应用于沉淀反应，可进行液体中微量抗原、抗体及小分子半抗原定量检测。
（一）免疫比浊测定的影响因素1.抗原抗体的比例是浊度形成的关键因素。
当抗原过量时，形成的IC分子小，而且会发生再解离，使浊度反而下降，光散射亦减少，这就是高剂量钩状效应。
当抗体过量时，IC的形成随着抗原递增而增加，至抗原、抗体最适比例处达最高峰，这就是经典的海德堡曲线理论。
在反应体系中需保持抗体适当过量，如形成抗原过量则造成测定的准确性降低。
2.抗体的质量对免疫比浊测定法的抗体要求（1）特异性强（2）效价高：低效价（＜1:20）抗体会增加非特异性浊度（伪浊度）的产生。
（3）亲和力强：则抗体的活性高，可加快抗原抗体反应的速度，且形成的IC较牢固，不易发生解离。
（4）R型和H型抗体：R型抗体是指以家兔为代表的小型动物被注射抗原免疫后制备的抗血清。
这类抗血清的特点是亲和力较强，抗原抗体结合后不易发生解离。
H型抗体是指以马为代表的大型动物注射抗原后制备的抗血清，这类抗血清的亲和力弱，抗原抗体结合后极易解离。
医学免疫学沉淀反应
医学免疫学沉淀反应在医学免疫学的广阔领域中，沉淀反应是一项重要且应用广泛的实验技术。
它不仅在基础研究中发挥着关键作用，还在临床诊断和疾病监测等方面具有不可替代的价值。
沉淀反应的基本原理其实并不复杂。
简单来说，就是当可溶性抗原与相应抗体在特定条件下相遇时，二者会发生特异性结合，形成肉眼可见的沉淀物。
这个过程就像是钥匙和锁的精准匹配，只有特定的抗原和抗体才能相互结合，从而产生沉淀。
为了更直观地理解沉淀反应，我们可以想象这样一个场景：抗原就像是一个个带有特定标记的小球，而抗体则是专门为这些小球设计的“抓手”。
当“小球”和“抓手”在合适的环境中相遇，“抓手”就会紧紧抓住“小球”，并且多个“小球”与“抓手”的结合体逐渐聚集，最终形成能够被我们观察到的沉淀。
沉淀反应的类型多种多样，其中最常见的包括环状沉淀反应、絮状沉淀反应以及免疫比浊法等。
环状沉淀反应是一种比较经典的方法。
在这种反应中，将抗原溶液小心地叠加在抗体溶液之上，由于二者的比重不同，在界面处就会形成一个清晰的白色沉淀环。
这种方法虽然操作简单，但相对来说灵敏度较低，只能用于检测抗原抗体反应的大致情况。
絮状沉淀反应则是将抗原和抗体溶液在试管中混合，通过观察溶液中出现的絮状沉淀来判断反应的结果。
与环状沉淀反应相比，絮状沉淀反应的灵敏度有所提高，但仍然存在一定的局限性。
而免疫比浊法则是一种更为精确和定量的沉淀反应方法。
它利用抗原抗体结合后形成的复合物会导致溶液浊度发生变化的原理，通过测量浊度的变化来确定抗原或抗体的含量。
这种方法在临床检验中应用非常广泛，例如用于检测血清中的免疫球蛋白、补体等成分的含量。
在实际应用中，沉淀反应具有诸多重要意义。
在临床诊断方面，它可以帮助医生检测患者体内是否存在特定的病原体抗原或抗体，从而为疾病的诊断提供有力依据。
比如，通过检测乙肝表面抗原（HBsAg），可以判断患者是否感染了乙型肝炎病毒；检测类风湿因子，可以辅助诊断类风湿性关节炎等自身免疫性疾病。
医学免疫学沉淀反应
医学免疫学沉淀反应在医学免疫学的领域中，沉淀反应是一项十分重要的实验技术。
它不仅在基础研究中发挥着关键作用，还在临床诊断和疾病监测等方面具有广泛的应用。
沉淀反应的原理其实并不复杂。
简单来说，就是当可溶性抗原与相应抗体在特定条件下相遇时，会形成肉眼可见的沉淀物。
这个过程就像是一场精心编排的舞蹈，抗原和抗体相互识别、结合，最终形成稳定的复合物沉淀下来。
为了更好地理解沉淀反应，我们先来了解一下抗原和抗体的特性。
抗原是能够刺激机体免疫系统产生免疫应答，并能与免疫应答产物（抗体或致敏淋巴细胞）在体内外发生特异性结合的物质。
而抗体则是机体免疫系统在抗原刺激下产生的一类能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。
在沉淀反应中，抗原和抗体的比例、浓度以及反应的条件都会对结果产生影响。
如果抗原或抗体过量，可能会导致复合物形成减少，甚至不形成沉淀，这种现象被称为带现象。
因此，在进行沉淀反应实验时，需要精确控制各种条件，以获得准确可靠的结果。
常见的沉淀反应类型有很多，比如环状沉淀反应、絮状沉淀反应和免疫比浊法等。
环状沉淀反应是一种比较经典的方法。
将抗原溶液小心地叠加在抗体溶液的上面，在两者的交界处就会形成白色的沉淀环。
这种方法操作简单，但灵敏度相对较低，通常用于定性检测。
絮状沉淀反应则是将抗原和抗体溶液混合，在一定的条件下观察溶液中出现的絮状沉淀物。
通过对沉淀物的观察和分析，可以判断抗原和抗体的反应情况。
免疫比浊法是一种定量检测的方法。
它利用抗原和抗体结合后形成的复合物会使溶液的浊度发生变化，通过测定浊度的变化来计算抗原或抗体的含量。
这种方法具有快速、准确、自动化程度高等优点，在临床实验室中得到了广泛的应用。
沉淀反应在医学领域中的应用非常广泛。
在临床诊断方面，它可以用于检测各种疾病相关的抗原或抗体，如传染病的病原体抗原、自身免疫性疾病的自身抗体等。
例如，对于梅毒的诊断，就可以通过检测患者血清中的梅毒螺旋体抗体，利用沉淀反应来判断是否感染。
免疫沉淀（Immunoprecipitation）实验操作方法资料
免疫沉淀（Immunoprecipitation）实验操作⽅法资料免疫沉淀（Immunoprecipitation）实验操作⽅法实验原理：免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是利⽤抗原和抗体的特异性结合以及细菌蛋⽩质如protein A/G特异性地结合到免疫球蛋⽩（抗体）FC⽚段的现象⽽开发出来的特异分离富集抗原的⽅法。
⽬前多⽤预先结合固化在Agarose beads上的proteinA/G（Agrose-proteinA/G），使之与抗体结合，再通过抗体特异性结合抗原⽽形成Agrose-proteinA/G 、抗体、抗原复合物，利⽤Agarose beads的重量，通过离⼼即可特异分离富集⽬的抗原。
实验步骤：1.处理细胞：依据实验⽬的，设计实验，处理好细胞模型。
⼀般3×106细胞/处理(即六孔板⼀个孔，约200ug总蛋⽩)。
2.配IP 裂解液：200ul/孔（6孔板），并加⼊蛋⽩酶抑制剂，如果蛋⽩磷酸化⽔平影响实验结果则应加⼊磷酸酶抑制剂。
注意抑制剂的要现加现⽤。
3.收集细胞：冰上操作，裂解细胞前⽤1×PBS（4度）洗1遍，每孔加⼊200ul IP裂解液，冰上静置5分钟后刮下细胞并收集⾄EP管中。
4.超声：强度37％，5秒×4次（程序07）。
⽬的是使细胞裂解更完全并打断基因组DNA,但可能会影响蛋⽩质之间的相互作⽤，进⾏共免疫沉淀实验时要注意这⼀点。
5.离⼼细胞裂解液：4度10000rpm 10 分钟。
6.Agrose-proteinA/G清洗：⼀般1ug抗体对应15ul Agrose-proteinA/G（不同公司产品可能不同，注意结合说明书及实验结果考虑），预清洗细胞裂解液的Agrose-proteinA/G⽤量与结合抗体的⽤量⼀致。
取相应量的Agrose-proteinA/G到EP管中（剪枪头）并⽤500ul1×PBS（4度）洗两遍，5000rpm×2分钟，吸掉上清备⽤。
免疫沉淀步骤
免疫沉淀步骤
实验方法：免疫沉淀法
实验所需主要器材：4℃离心机、透析袋、离心管、微量加样器、实验所需主要试剂：透析液、蛋白A微球平衡液、蛋白A微球、正常兔血清、兔多克隆抗体、PBS、甘氨酸洗脱液（pH 3.5 ）实验步骤：
（一）透析去除小分子物质
4℃条件下，将收集各管蛋白并入透析袋内，放入透析外液（含Na2HPO4、NaCl, pH 8.0）约300毫升，每3~4小时换浓度降低透析外液。
最后将蛋白溶液装入离心管中，约6~8 ml.
(二)蛋白溶液的预处理
1、每1 ml 蛋白溶液加50 ul 正常兔血清或 IgG(浓度？)
2、冰上孵育2hr
3、平衡蛋白A 微球：将蛋白A 微球悬浮于洗脱缓冲液中，搅拌后10000g离心，弃洗液，置于冰上
4、将蛋白溶液与蛋白A微球混合
5、冰上30分钟，4000 g×3min,4 ℃离心。
小心将上清移至另一试管中
（增加蛋白A的浓度，彻底去处用于预处理的非特异性抗体）
（三）免疫复合物的沉淀
1、预处理的蛋白溶液置于适当数量的1.5ml的管中（0.5ml/管），加入抗血清1ul作为起始用量（滴定抗体量：范围0.5ul~5ul）
2、冰上孵育2hr
3、加入100ul蛋白A微球（10%的悬液），4℃摇动1hr
4、10000g×15sec,4℃ 离心，收集微球，
5、将0.5倍体积的的PBS pH7.4 ,与沉淀混匀15min, 离心后弃上清。
重复3次
（四）目的蛋白的洗脱
1、将0.5倍体积的pH3.5的甘氨酸-盐酸洗脱液与沉淀复合物颠倒混匀15min ，离心收集上清
2、重复2~3次，
3、取各管 SDS-PAGE,鉴定组份
仅供参考。
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（三）免疫电泳示意图
+
技术评价：
1.分辨率较高
2.仅定性
3.扩散时间长，影响因素多，结果较难分析
4.目前大量应用于纯化抗原和抗体成分的分 析及正常和异常体液蛋白的识别与鉴定。
（四）免疫固定电泳
原理
抗原抗体在凝胶中直接发 生沉淀反应，在适当位置 形成抗原抗体复合物，经 染色后，可对各类免疫球 蛋白及其轻链进行分型
1:32
1:2
1:64
1:128
各管抗体量不变
Ab
Ag
振摇
混匀、37℃孵育
沉淀量不同
轻摇
出现沉淀量最多的管为最适比例管。
最适比方阵测定法
抗原稀释度
抗体 稀释度 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 对照
1/5
+
+ +
+ + +
+ + +
+ +
+
±
—
1/10
+
+ +
2.打孔
3.加样 4.扩散
二、双向免疫扩散试验
1.判断抗原或抗体的存在 以及估计相对含量 2.分析抗原或抗体相 对分子量
二、双向免疫扩散试验
3.分析抗原的性质
二、双向免疫扩散试验
4.滴定抗体的效价
5.鉴定抗原或抗体 纯度
应用
1.AFP检测的最早方法 2.血清中含量较高的酶类、细 菌病毒感染后血清中产生的抗 体的检测
（一）对流免疫电泳
原理：双向扩散+电泳
实质上是定向加速度的免疫双扩散技
术 比双向扩散试验灵敏度提高8∼16 倍
（一）对流免疫电泳
通电
－
蛋白质抗原常带 较强的负电荷， 在电场中向正极 移动
抗体球蛋白带负 电荷较少，籍电 渗作用向负极泳
动
＋
（一）对流免疫电泳
结果分析：
无沉淀线出现则表明
无相应的抗原。
检测器A
θ
Iθ
检测器B 散射比浊试验
补充：免疫浊度测定影响因素
（1）抗原抗体的比例：反应体系保持抗体过量 （2）抗体的质量 ：特异性强，效价高，亲和力
强，并使用R型抗体
（3）抗原抗体反应液的环境：最适PH为6.5-8.5 （4）增浊剂
（1）抗原抗体的比例
海德堡曲线
在抗体过量的反应体系中,抗原量的递 增与比浊定量成正比,当抗原抗体比例合 适时反应达峰值,而当抗原过量时,形成的 免疫复合物分子小,浊度反而下降的一个 抛物曲线。
应用
最常用于M蛋白的鉴定与分型，也用于尿 中本周氏蛋白质的检测与κ 、λ分型，脑 脊液中寡克隆蛋白的检测与分型。
分辨率强，敏感度高，操作周期短， 仅需数小时，结果易于分析。
优点
应用:M 蛋白的鉴定和分型
（五）交叉免疫电泳 （六）自动化免疫电泳
第四节 免疫沉淀试验的临床应用
免疫浊度法：蛋白质的检测 如免疫球蛋白、补体、类风湿因子、 C反应蛋白等
+ +
+ +
+ + +
+ +
+
—
1/20
+
+ +
+ +来自+ ++ + +
+ +
+
—
1/40
1/80
—
—
±
—
+
—
+
—
+ +
+
+ + +
+
+ +
+
—
—
二、免疫浊度测定
原理：
当可溶性抗原与相应抗体特异结合， 二者比例合适时，在增浊剂中它们
快速形成一定大小的抗原抗体复合
物，使反应液体出现浊度。
优 点：
稳定性好、简便快速，易于自动化 敏感度高 精确度高 无放射性核素污染
原理 熟悉：沉淀反应的特点、免疫电泳技术、 沉淀反应的应用
第一节 免疫沉淀试验的基本原理
一、基本原理
免疫沉淀反应（immunoprecipitation reaction）指可溶性抗原与相应抗体在
适当条件下发生特异性结合而出现的沉
淀现象。
沉淀反应分两个阶段
第一阶段
抗原抗体特异性结 合，快速但不可见
性复合物沉淀峰，抗体浓
度固定时，峰的高度与抗
原量呈正相关。
（二）火箭免疫电泳
技术要点
1.2%巴比妥琼脂糖约55℃，加入适量抗 血清，混匀后制板，打孔，孔内加待测样 品，样品孔放负极侧， 6h后观察琼脂板上 沉淀峰，绘制标准曲线，求出待测样品浓 度。
（二）火箭免疫电泳示意图
+
-
火箭免疫电泳图 ①②③④为标准抗原；⑤⑥为标本
2、多孔的网状结构
3、Ag-Ab复合物网络在凝胶 中
一、单向免疫扩散试验
定量试验
原理：抗体与待测的抗
技术要点：
1.制板
原,在两者比例合适的
部位结合形成沉淀环。
2.打孔
3.加样
环的大小与抗原的浓
度成正相关。
4.扩散
5.绘制标准曲线
一、单向免疫扩散试验
倾注平板 打孔
加样
放置37℃ 24～48h观察沉淀 环
三、免疫电泳技术
三、免疫电泳技术
电泳分析 ＋ 沉淀反应
优点：
1.加快反应的速度。 2.提高了灵敏度。 3.增加了分辨率。 抗原抗体反应 的高度特异性 电泳技术的高 分辨率、快速、 微量
•电泳（electrophoresis） ：在外加 电场的作用下带电颗粒向着其电性相 反的电极移动，称为电泳。
结果判定：
1、定性：直接观察、染色
2、定量：根据峰高-浓度标准曲线计算
3、为提高灵敏度，可加入少量125I标记的标 准抗原共同电泳，则可在含抗体的琼脂中形 成不可见的火箭峰
（三）免疫电泳
原理：区带电泳＋双向扩散
1、将蛋白质抗原在凝胶中电泳分成肉眼 不可见的若干区带 2、沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽， 加入相应抗血清进行双向扩散
Mancini曲线
Fahey曲线
T1 为 16-24h ； T2 为 24-48h ； T3 为 48h t1 为 16-24h ； t2 为 24-48h ； t3 为 以上,可见T3为直线，T1为反抛物线 48h以上,可见t1为直线，t3为反抛 物线
待检蛋白质抗原须具备的条件
仅针对某待测抗原的单价特异性抗血清
区带电泳 ＋ 沉淀反应
（四）免疫固定电泳示意图
SP G A M κ λ SP G A M κ λ SP G A M κ λ
左图为IgG κ 型, 中图为IgG λ 型，右为正常
原理：
待检蛋白电泳
固定剂及各类抗血清加于凝胶表面的泳道
抗原与对应抗体反应 沉淀
漂洗 染色 某一抗原的存在?
（四）免 疫 固 定 电 泳
一、絮状免疫沉淀试验
絮状免疫沉淀试验是将抗原与相应 抗体混合，在电解质存在的条件下，
抗原抗体结合形成肉眼可见的絮状 沉淀物。
一、絮状免疫沉淀试验
抗原稀释法：抗原最适比例 抗体稀释法：抗体最适比例
方阵滴定法：抗原抗体最适比例
絮 状 沉 淀 示 意 图
Ag
各管抗原倍比稀释 加入抗血清
1:4 1:8 1:16
本章概要
思考题
名词: 沉淀反应 简答: 1.双向免疫扩散试验的应用 2.免疫电泳技术的类型
1.根据海德堡曲线理论，下列说法不正确 的是 A 抗原过量是产生钩状效应，沉淀物少 B 抗体过量时，沉淀物也少 C 抗原抗体比例适当时产生沉淀量最多 D 抗原过量导致测定失败 E 抗体过量导致测定失败
2.双向扩散试验中沉淀环弯向抗原一方是 A 抗原分子量大 B 抗体分子量大 C 抗原抗体分子大致相等 D 抗原扩散快 E 抗体扩散快 3.单向扩散实验中小分子抗原和较短时间 扩散（24h）的结果处理宜用 A Mancini曲线 B Fahey曲线 C 海德堡曲线 D 直线 E 抛物线
1 杂交瘤细胞含有 A.两亲本细胞各一半染色体 B.两亲本细胞全部染色体 C.两个染色体 E.亲代某些特性基因 2 关于单克隆抗体描述下面哪项是错误的 A.生物活性专一 B.纯度高 C.特异性高 D.融合特有基因信息
D.可识别多个表位 E.可用于诊断和治疗
第六章
免疫沉淀试验
教学目的
掌握：液相内沉淀试验、凝胶内沉淀试验
根据各蛋白所处的电泳位置,可分为: 白蛋白区、球蛋白区、1区、2区、区、区 + --
ALB 1 2 白蛋白 抗胰蛋白酶 触珠蛋白 转铁蛋白 IgG 前白蛋白 酸糖蛋白 铜蓝蛋白 C3aC3b CRP 1脂蛋白 抗糜蛋白酶 巨球蛋白
应 用
免疫电泳
1.纯化抗原和抗体成分的分析 2.正常及异常免疫球蛋白的识别与鉴定
分 类：
1.根据反应的时间和反应结合的动力学分为 速率比浊法 终点比浊法 2.根据检测仪器的位置及光信号性质分为 透射免疫比浊法 散射免疫比浊法 3.免疫胶乳比浊法
透射比浊试验和散射比浊试验光路
IC
透射比浊试验 I
I0
当复合物＜3×106dal， I≈Iθ ;θ ＜90°，散射光的 量代表IC的量。
电泳迁移率： 单位时间内移动的距离。M=cm2/VS
定义：同一电场条件下，各种带电粒子在 影响泳动的速度的因素:
本身净电荷量、颗粒大小、形状 电场强度 溶液pH值 溶液离子强度 电 渗