现代生化技术考试资料

《第一章生命大分子物质的制备》习题1、作为现代生化制备的主要对象的蛋白质、核酸等生物大分子有何特点？（1）成分复杂：生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。

有的生物大分子在分离过程中还在不断的代谢，所以生物大分子的分离纯化方法差别极大，想找到一种适合各种生物大分子分离制备的标准方法是不可能的。

（2）含量甚微：许多生物大分子在生物材料中的含量极微，只有万分之一、几十万分之一，甚至几百万分之一。

分离纯化的步骤繁多，流程又长，有的目的产物要经过十几步、几十步的操作才能达到所需纯度的要求。

（3）易变性易被破坏：许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。

过酸、过碱、高温、剧烈的搅拌、强辐射及本身的自溶等都会使生物大分子变性而失活，所以分离纯化时一定要选用最适宜的环境和条件。

（4）具经验性：生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断，因而实验结果常有很大的经验成份，实验的重复性较差，个人的实验技术水平和经验对实验结果会有较大的影响。

（5）均一性的相对性：生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，通常只采用一种方法是不够的，必须同时采用2～3种不同的纯度鉴定法才能确定。

2、生物物质制备方案的设计基本原则是什么？生物物质的制备一般包括初始阶段、中间阶段和精制阶段。

在制备方法的选择上，初始阶段宜选择粗放、分辨率低、快速、有利于缩小样品体积和减少后工序的方法，主要考虑样品量和处理速度两个指标；中间阶段选择的方法应在考虑样品处理量的基础上适当提高分辨率。

精制阶段宜选择精确、分辨率高、需样品少的方法。

在安排各种分离纯化方法的使用程序时应注意：（1）不适宜连续使用同一种分离纯化方法，应该交叉使用，因为每一步分离后，性质相似的物质聚在一块；（2）使用顺序还要考虑到有利于减少工序、提高效率。

3、综合评价生物物质制备步骤方法的好坏应从哪些方面进行？每一个制备步骤方法的好坏，除了从分辨本领和重现性二方面考虑外，还注意方法本身的回收率和纯化倍数，特别是制备某些含量很少的物质时，回收率的高低十分重要。

因此综合评价试验方案的优劣应从分辨本领、重现性、回收率和纯化倍数等方面进行。

一个好的制备方法应该使纯化倍数和收得率都同时有较大提高。

但在实际过程中，随纯化倍数的提高，收得率是逐渐降低的。

因此应该根据材料的来源难易（难——收得率优先考虑，易——纯化倍数优先考虑）和制备物的目的等方面来综合评定方法的优劣。

5、提取生物活性物质时，活性保护性措施有哪些？提取一些具有生理活性的物质时，除了考虑被提取物溶解度外，还应考虑被提取物活性的保护。

对于一些生物大分子如蛋白质、酶和核酸来说，主要措施有如下几点：（1）采用缓冲系统；（2）加入保护剂；（3）抑制水解酶的破坏；（4）其它一些特殊要求的保护措施。

6、蛋白质、DNA和RNA的常用提取方法有哪些？（1）蛋白质和酶的提取方法：水溶液提取、、有机溶剂提取（2）DNA的提取方法：浓盐法、、阴离子去污剂法、苯酚抽提法、水抽提法（3）RNA的提取方法：苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。

7、提取组织中的胰岛素时，为什么采用68％乙醇溶液（用草酸调溶液的pH为2.5～3.0）为溶剂进行提取。

胰岛素可溶于稀酸、稀碱和稀醇溶液，但在组织中与其共存的糜蛋白酶对胰岛素有极高的水解活性，采用68％乙醇溶液（用草酸调溶液的pH为2.5～3.0）进行提取，可以从下面三个方面抑制了糜蛋白酶的水解活性：①68％的乙醇可以使糜蛋白酶暂时失活；②草酸可以除去激活糜蛋白酶的Ca++；③选用pH2.5～3.0，是糜蛋白酶不宜作用的pH值。

《第二章常用生物化学检验技术》习题1、蛋白质的化学物理检测方法主要有哪些？紫外吸收法、凯氏定氮法、双缩脲法、福林酚试剂法、考马斯亮蓝法2、糖类的化学检测方法主要有哪些？兰－爱农（Lane-Eynon）法、斐林试剂快速法（GB法）、碘量法、铜试剂法3、核酸的化学检测方法主要有哪些？定磷法、二苯胺法和地衣酚法4、凯氏定氮法的基本原理是什么？其主要操作步骤包括哪些？原理：样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。

然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。

根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。

主要操作步骤：消化、蒸馏、滴定5、放射自显影技术的基本原理是什么？其原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。

然后经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒，即可得知标本中标记物的准确位置和数量。

6. 生物检测内容主要有哪些？安全性检测包括哪些内容？生物检测内容主要包括生物效价测定和安全性试验。

安全性检测主要包括毒性试验、局部刺激性试验、溶血实验、热原试验、过敏试验和变异原试验。

7. 核磁共振在生物学研究中主要有哪些方面的应用？(1)分析研究：如确定生物分子成分及浓度，特别是可不破坏组织细胞而测知其中组分；确定异构体比例；确定分子解离状态；确定金属离子或配基是否处于结合状态；以及测定细胞膜内外的pH差异。

(2)热力学研究：如测定酶与底物、配基、抑制剂的结合常数；测定可解离基团的pK值，特别是能测定生物大分子中分处不同微环境的同类残基的同类基团的不同pK值，这是其他方法所不及的；还可测定相变温度，ΔG等其他热力学参数。

(3) 动力学研究：监测反应进程，测定各组分随时间的变化；通过变温实验和线形分析，测平衡过程的动力学常数，包括某些生化反应的反应速率，研究分子间（如酶与抑制剂，DNA与药物）相互作用的动力学过程。

(4)分子运动研究：弛豫参数可用来研究生物高分子的动力学，以及生物膜的流动性。

(5)分子构象及构象变化研究：目前用二维核磁共振技术加上计算机模拟已能独立确定小的蛋白质分子及核苷酸片段在溶液中的三维空间结构。

改变物理化学因素或加入可与生物分子相互作用的其他物质，将会使核磁图谱发生变化，从而可用来研究这种构象变化。

(6)活体研究：用P，C，H磁共振方法测定活细胞，活组织以致整体的代谢物浓度及变化，测定细胞内pH 值，观察药物或不同生理状况对代谢的影响。

研究对象有微生物、植物、各种动物以及人体器官等。

《第三章标记》习题1、何为标记？常用的标记物有哪些？标记是指以共价键方式将放射性元素或非放射性物质结合到某些生命物质上的过程。

常用的标记物主要包括放射性物质和非放射性物质，放射性标记元素如3H、14C、32P、35S、125I等；非放射性物质如地高辛、生物素、酶、荧光素等。

2、双链DNA探针标记的方法有哪些？①随机引物引导法②切口平移法3、列举一种核酸标记的新方法，并说明其特点。

扫若仑标记：扫若仑（psoralen）是一种天然的三环化合物，其带有胺活性基团衍生物可用来标记多种核酸（如DNA、RNA、PCR产物和寡核苷酸等）。

用其制成的探针灵敏度高（可达fg级别）。

扫若仑标记为非酶促反应，是用波长320~400nm的紫外光照射，引起光循环反应，使带胺基的扫若仑以三环平面形式插入核酸分子，并以共价键结合形成探针，DNA和RNA时，共价键结合的位置分别在dT和U处；探针中扫若仑衍生物的含量与核酸中胸苷（dT ）或尿苷（U）的含量成正比关系。

分子灯塔探针：一种新的非核素化合物标记，用于检测特别序列核酸的核酸探针。

标记化合物类似灯塔，由25个核苷酸组成，灯中间环形的15个核苷酸与靶DNA是互补序列，灯竿一端的5个核苷酸与另一端的5个核苷酸是互补，在5’ 和3’端分别耦合一种荧光素（发光剂）和非荧光素（熄灭剂）。

分子灯塔探针的熄灭剂可吸收发光剂发射的能量。

在室温条件下，分子灯塔的构型可确保发光剂和熄灭剂紧密互补结合，致使荧光基团处于熄灭状态，无荧光产生；一旦当灯塔探针的15个核苷酸与靶DNA或RNA序列杂交时，其发光剂和熄灭剂便相互分离，产生荧光。

4、说明蛋白质金标记方法的原理、种类和用途。

原理：借助金粒的电子密度特征，用其与抗体偶联后，可成功地置显微镜下观察胶体金颗粒。

分类：根据金粒子大小，一般分为5 nm、l0 nm和20 nm三种。

用途：5nm粒子容易渗透到细胞膜，使细胞间染色，适用于电子显微镜准确定位抗原。

l0nm粒子较大，可使细胞表面染色，适用于光学显微镜观察。

20nm粒子可用于免疫印迹和某些细胞和组织化学免疫染色。

《第四章DNA序列测定》习题1、DNA测序的方法有哪些？经典的方法主要有Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert DNA化学降解法；较新的方法有：杂交测序法、质谱法、单分子测序法、原子探针显微镜测序法、流式细胞仪测序法、PCR法和DNA 芯片法。

2、Sanger双脱氧链终止法测定DNA序列的原理是什么？DNA的合成总是从5′端向3′端进行的。

DNA的合成需要模板以及相应的引物链。

DNA的合成过程中，在合成的DNA链的3′末端，依据碱基配对的原则，通过生成新的3′，5′－磷酸二酯键，使DNA链合成终止，产生短的DNA链。

具体测序工作中，平行进行四组反应，每组反应均使用相同的模板，相同的引物以及四种脱氧核苷酸；并在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，使其随机地接入DNA链中，因为缺少一个形成磷酸二酯键所必需的3'-OH而使DNA链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。

这四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测DNA的核苷酸序列。

3、Sanger双脱氧链终止法测定DNA序列需要哪些构件元素？质粒载体系统、引物、DNA模板、DNA聚合酶、放射性标记dNTP、dNTP类似物（如ddNTP）5、化学降解法测定DNA序列的原理是什么？化学裂解法的原理是用化学试剂在A、G、C、T处特定地裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE和放射自显影后，可以直接读出DNA的顺序。

常用的化学试剂及其断裂的碱基位置主要有：（1）硫酸二甲酯使鸟嘌呤G甲基化，再加哌啶在加热的条件下使G脱落；（2）硫酸二甲酯使鸟嘌呤G甲基化，加甲酸使AG完全分开，再加哌啶使A脱落；（3）用肼和哌啶使T和C断裂；（4）用2mol/L氯化钠加肼，只断裂C。

6、化学降解法测定DNA序列的基本步骤是什么？（1）将DNA的末端之一进行标记(通常为放射性同位素32P；（2）在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰；（3）在修饰碱基位置化学法断开DNA链；（4）采用聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开，根据放射自显影显示区带，读出DNA的核苷酸序列。