患病鲫肾组织中病毒解旋酶基因的检测

学号：071040132本科毕业论文患病鲫肾组织中病毒解旋酶基因的检测院（系）：生物科学与技术学院专业：生物工程姓名：李涛班级：0710401指导教师：周毅峰副教授中国·恩施二〇一四年五月Student ID：071040132BACHELOR'S THESIS OF HUBEIUNIVERSITY FOR NATIONALTIES Detection the herpesviral helicase gene from the diseased gibel carp Carassius carassiusName：Tao LiGrade：0710401Profession：Biological engineeringTutor：Coprof. Yi-Feng ZhouEnshi • ChinaMay, 2014学术声明1、始终以“求真、务实、创新”的科学研究态度从事各项研究工作。

2、在本论文中，除了已经标注的所有引用文献以为，其他所有均为自己试验真实结果。

3、在本论文中除了已经标注了的引用文献外，没有包含任何人或者机构的科研成果。

4、对本论文作出帮助和贡献的同志，在文章中做了声明并感谢。

5、本声明的法律后果由本人承担。

作者签名：年月日导师审核声明本人郑重声明：该学生所写学士学位毕业论文，是在本人的指导下完成。

其中文字、图、表及其它相关内容均经本人审核，同意作为该生的学位论文提交。

导师签名：年月日患病鲫肾组织中病毒解旋酶基因的检测李涛(湖北民族学院生物科学与技术学院，恩施，445000)摘要：为查明部分养殖场鲫患出血病的病原，结合体表症状、病变组织及鱼疱疹病毒基因序列，进行了形态解剖、PCR及RT-PCR检测以及病毒回接感染，初步分析了引起鲫出血病的病原。

结果表明：三十尾患病鲫体表，尤其是腹部出现点状出血点，解剖后观察到肝脏、肾脏、脾都有充血型肿胀，肠肿胀变粗。

PCR扩增患病鲫基因组DNA和RT-PCR扩增患病鲫肾转录组均出现一条约360bp特异性片段，和预测362bp片段大小基本相符，证实了该患病鲫肾中含疱疹病毒解旋酶基因，回接感染三天左右鱼腹部开始出现点状出血点，四天左右鱼开始死亡。

因此，推测疱疹病毒与鲫出血病有关原因之一，其它因素是否与鲫出血病有关有待进一步实验证实。

关键词：鲫；鱼疱疹病毒；PCR；RT-PCR；出血病Detection the herpesviral helicase gene form the diseased gibelcarp Carassius carassiusTao Li(School of biologic science and technology,Hubei universityfor nationalities, Enshi, 445000)Abstract：In order to indentify the causative pathogen of the disease with severe hemorrhages has emerged in some farms of central China. The gross pathological signs were observed and observation of the external surface of tens of diseased gibel carp showed severe dotted hemorrhages on the body surface, especially on the abdomen. Anatomy inspection showed that liver, kindey, spleen and intestine all presented symptoms of swelling. The target gene was amplified with the designed primer by the PCR method. The PCR product was analyzed by agarose gel electrophoresis and a specialized fragment was observed with 360bp, which matched the size of the target gene about 362bp, indicating that the gene of helicase of herpesvirus existed in the kidney of diseased fish. Tieback infected fish belly began to appear about three days spotting points, about four days the fish began to die.The present study showed that the DNA and RNA of helicsase of fish herpesvirus from diseased fish have been detected, and this result indicated that fish herpesvirus was related to the disease of hemorrhages for diseased gibel carp. However, further studies are needed to demonstrate this result.Key words：Gibel carp;Hemorrhagic disease;Fish herpes virus;PCR; RT-PCR目录1 引言 (2)1.1 研究背景 (2)1.2 鱼病毒病检测方法 (2)1.2.1 细胞培养检测 (2)1.2.2 分子生物学检测 (2)1.3 疱疹病毒 (3)1. 3.1 疱疹病毒的形态和种类 (3)1.3.2 鱼和水产动物疱疹病毒 (3)1.3.3 鱼感染疱疹病毒 (4)1.4 鲫出血病 (4)1.4.1 病毒性出血病和细菌性出血病的区别 (4)1.4.2 出血病的防治 (4)1.5 本研究的目的与意义 (5)2 材料与方法 (6)2.1 材料 (6)2.2 试剂与设备 (6)2.2.1 试剂 (6)2.2.2 主要设备 (6)2.3 方法 (6)2.3.1 DNA的提取 (6)2.3.2 PCR扩增 (7)2.3.3 PCR引物的设计 (7)2.3.4 RNA提取 (7)2.3.5 RNA逆转录 (8)2.3.6 RT-PCR扩增 (9)2.3.7 琼脂糖凝胶电泳检测 (9)2.3.8 病毒的回接感染 (10)2.4 结果分析 (10)2.4.1 体表观察及解剖观察 (10)2.4.2 回接感染 (11)2.4.3 分子生物学检测 (11)参考文献 (12)致谢 (14)1 引言1.1 研究背景鲫(Carassius carassius)在我国乃至世界上都是人们非常重要的食用的鱼类之一，不仅其肉质细嫩，肉味甜美，而且还含有丰富的营养，因为其生长环境，所以鲫含有钙等大量的矿物质，鲫不但营养价值很高，而且药用价值也很高，具有和中补虚、温胃、补中气等功效。

但遗憾的是在鲫的养殖过程中，时常会有病害发生。

微生物病原引起鱼类患病的主要有四大类[1]：一是病毒（如虹彩病毒[2]、弹状病毒[3]、呼肠孤病毒[4]及疱疹病毒等）；二是细菌；三是真菌；四是寄生虫。

在这些微生物病原中，病毒的个体微小，能够侵入宿主的细胞内，有些病毒有很长的潜伏期，这样就使得由于病毒患病的病症十分复杂，一旦发病传染率很高，导致大量鱼体死亡，在水产养殖上造成了严重的威胁，易造成巨大的经济损失。

因而病毒病的早期检测就显得非常重要。

1.2 鱼病毒病检测方法1.2.1 细胞培养检测细胞培养技术的发明，为病毒学的研究开打下了坚实的基础，也为病毒病的检测提供了一种经典的方法，体外培养技术不仅对于病毒学的研究有很重要的意义，对于整个生命科学的研究都有很重要的意义，不仅是进行水生病毒病原分离鉴定的前体条件，还可以用于遗传分析、病毒滴度测定以及药物筛选。

张奇亚等[5]经过多年研究，建立了20多种鱼类的腮、鳍、性腺、肾脏等细胞系。

张奇亚等[6]通过建立呈上皮细胞形态的草鱼椎骨间质细胞系GCVB，表明GCVB细胞对蛙虹彩病毒中国分离株RGV9506及蛙虹彩病毒美国分离株FV3敏感，可引起不同程度的病变。

1.2.2 分子生物学检测分子生物学技术主要应用聚合酶链反应(PCR)和逆转录PCR，是一项DNA在体外合成的放大技术。

在急性发病和痊愈时期的鱼组织中，用PCR法检测病毒DNA 是一种最有效的方法。

刘世超[8]采用Nested-PCR检测方法对我过江苏、南京、浙江等城市的食用鲫和鲤进行了锦鲤疱疹病毒流行病的分子生物学检测，在南京等8个城市或者地区检测出锦鲤疱疹病毒基因的存在。

张振国[9]等通过建立KHV双重PCR检测的方法，快速诊断出患病锦鲤体中包含的锦鲤疱疹病毒(KHV)，建立了一个简单、方便、快捷、灵敏、准确的方法。

孟建峰[10]等利用PCR技术选择三个主要靶基因(胸苷激酶基(TK)、聚合酶基因(Sph)和(ORF7 基因)快速检测出锦鲤疱疹病毒。

黄世旺[11]等采用RT-PCR技术，通过从GeneBank中下载能水痘－带状疱疹病毒和肠道病毒基因序列，在其保守区设计引物建立RT-PCR体系，进行扩增，够快速检测出水痘－带状疱疹病毒(Varicella－Zoster virus)和肠道病毒(Enteroviruses)，此方法操作简单、效率很高、灵敏度高、省时。

1.3 疱疹病毒1. 3.1 疱疹病毒的形态和种类疱疹病毒(herpesviral)毒粒的直径为100~120 nm[12]，一般为球形，外面有糖蛋白组合而成的囊膜。

疱疹病毒性在病毒中属于一群中等大小的dsDNA病毒，在宿主细胞内增殖速度非常快，而且还可以引起宿主细胞的病变，其生长的周期还很长，这样就可以导致宿主细胞形成巨细胞，感染淋巴细胞，从而引起淋巴增生等致病特性。

疱疹病毒科被分为3个亚科：(1)α疱疹病毒亚科，其中包括单纯疱疹病毒属、水疱疹病毒属、喉气管炎病毒属、马立克病毒属和沟鲶病毒属。

(2)β疱疹病毒亚科，其中包括巨细胞病毒属、老鼠细胞巨型病毒属和玫瑰疱疹病毒属。

(3)γ疱疹病毒亚科，其中包括淋巴潜隐病毒属和猴病毒属。

现已从不同鱼中检测到多种疱疹病毒或者类似疱疹病毒[12]。