成纤维细胞体外培养、冻存及复苏的实验研究

MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识总结

2008-06-19 00:00 来源：丁香园点击次数：1517 关键词：MEF小鼠胚胎成纤维细胞

知识总结

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小鼠胚胎成纤维细胞的富集

1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。

2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。将子宫角移到10cm的皿里。用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。

3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。

4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。

5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml胰蛋白酶/ED TA继续剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大约20分钟。此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。

6、执行1－4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。

7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。将皿放回培养箱再孵育10分钟。

8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。

9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。每个培养瓶中装大约3个胚胎。

10、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。

11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。

12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。

鸡胚成纤维细胞(CEF)的制作及细胞培养

鸡胚成纤维细胞（CEF）的制作

及细胞培养

（一）CEF的制备

1. 实验试剂

1×DMEM（不含丙酮酸钠）、小牛血清、高压过的PBS、胰酶、双抗。

2. 实验设备和材料

酒精灯、酒精喷壶、酒精棉、打火机、计时器、一次性手套废液缸、镊子、细胞瓶、50 mL试管架、50 mL离心管、1000ul 移液枪及枪头、100 uL移液枪及枪头、塑料吸管、一次性培养皿、SPF鸡胚（9-11日龄均可）

将3把小镊子、1把剪刀、1个50 mL离心管、1个玻璃培养皿放入一个大号饭盒内；取一中号锥形瓶，瓶口由内到外分别盖上6层纱布、锡箔纸、报纸包好，高压30 min备用。

3. 实验步骤

（1）将所用材料放入超净工作台（小牛血清及胰酶除外），紫外照射

30 min。

（2）用镊子取出高压过的平皿、镊子，倒入PBS液；

（3）酒精消毒气室处蛋壳，去除蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，取

出鸡胚，置于培养皿中用镊子去除头、四肢和内脏，并将胚体置于另一

个培养皿中冲洗干净；

（4）将胚体置于高压过的50 mL离心管内，略水平放置，用剪刀充分剪碎，越碎越好；

（5）加入胰酶（5 mL/个），37℃水浴锅内消化5-8 min，待胚体呈绒毛状即可，吸除消化液；

（6）加入30 mL含10%血清的DMEM，充分吹打，静置片刻，过滤至锥形瓶内；

（7）重复第六步；

（8）分装至培养瓶或将细胞按1.2×106 cells/well传到6孔板中，每孔 2 mL。

（二）细胞冻存

（1）倒去细胞上清液，加入PBS洗去残留的培养基，洗两次。

（2）加入0.25%的胰酶，消化10-20 s后倒去。

鸽胚胎成纤维细胞系的构建及生物学特性研究

鸽的肉和骨制成的。成纤维细胞是结缔组织中较常见的细胞，其主要特征是
１．３．２胚成纤维细胞的传代培养待培养的细胞汇合到
８５％左右时，即可传代。弃去培养基，用３７ ℃含双抗的ＰＢＳ清
洗细胞２－３次后，加入Ｏ．２５％胰蛋白酶消化。当细胞胞质回
鸽子在日常生活中较为常见，其广泛分布在世界各地，
小块均匀的平铺于培养瓶底，倒置贴壁４ — ６ｈ后加入含１０％
属于脊椎亚门、鸟纲、鸽形目、鸠鸽亚目、鸠鸽科、鸠鸽亚科、
胎牛血清培养基，置３８ ℃，５％ＣＯ培养箱培养。
鸽属，全世界有５０多个古老的鸽子品种。肉鸽不仅肉质细
即可冻存。用胰酶消化细胞并收集细胞悬液，ｌＯ００ｒｐｍ，离心８ａｒｉｎ，去上清，收集细胞。加适量冻存再用吸管轻轻吹打使细
胞重悬。分装入无菌冻存管中，每管１ — １．２ｍＬ细胞悬液，加入
生长旺盛，细胞核较大，在显微镜下容易观察，且呈现典型的
７０％冰箱过夜，次日放人液氮中保存。
１．３．４鸽胚成纤维细胞的复苏
液氮中冻存７ｄ后，取出冷

大鼠皮肤成纤维细胞分离培养方法的研究

作者：冯颖

来源：《吉林农业》2014年第12期

摘要：目的：对大鼠皮肤成纤维细胞进行分离培养并观察形态。方法：组织块培养法分离大鼠成纤维细胞并进行传代培养并通过细胞形态学观察和HE染色对其细胞进行鉴定。结果体外培养的成纤维细胞呈梭形或多角形，24小时贴壁，通过HE染色，细胞核被染成蓝紫色，胞浆被染成粉红色。结论：该方法成功培养了大鼠背部皮肤的成纤维细胞，所获得的大鼠背部皮肤成纤维细胞可在体外稳定培养，为一些组织来源较少的成纤维细胞培养提供一种有效且可行的实验方法。

关键词：大鼠；成纤维细胞；体外培养

中图分类号： R329.2 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/ki.jlny.2014.23.0019

成纤维细胞是真皮组织的主要组成成分，在构建人工皮肤和组织创伤修复中发挥着重要作用，对成纤维细胞的培养研究已经为细胞水平上研究伤口愈合的机制提供了有力工具[1]。本文旨在探索组织块培养法进行大鼠成纤维细胞分离和体外培养。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器及试剂

新出生SD大鼠、超净工作台、超低温冰箱、CO2培养箱、眼科剪、培养瓶、离心管、尼龙纱网、乙醇、PBS溶液、新生牛血清、DMEM培养液、中性蛋白酶、胰蛋白酶、血球计数板。

1.2 实验方法

1.2.1 成纤维细胞的分离与培养取新出生的SD大鼠，断颈处死，在75%乙醇中浸泡3～5分钟。在无菌条件下，剪取大乳鼠背部皮肤。去除皮下组织，PBS溶液反复漂洗后，将组织块剪切成约1立方毫米的小块，0.25%中性蛋白酶在4℃处理12～16小时，去除表皮，将剩余的真皮组织以0.3～0.5毫米间距接种于培养瓶内壁，加入少量DMEM培养液，置入5% CO2，37℃的CO2培养箱中培养24小时，待组织块吸附牢固后，次日补加培养液至正常体积，三天后换液。当成纤维细胞汇合成片，占培养瓶底面的80%左右时，加入PBS溶液洗涤2次，加入少量0.25%胰蛋白酶覆盖瓶底，消化3～5分钟，当细胞间隙变大，胞质回缩时，加入含有小牛血清的培养基终止消化，由上至下，由左至右吹打瓶壁，细胞脱落后，以1200转/分钟离心5分钟，弃上清加入10%小牛血清的DMEM培养基重悬，台盼蓝染色进行细胞计数，按照8×104密度接种培养。当细胞培养至第5代，第10代分别进行常规冻存，以便需要时复苏。

南阳牛成纤维细胞的体外培养及生物学特性研究

河南农业科学，０２４（）１５１８２１，１４：３ —３
ＪｕｎｌｏｎｎＡｇｉｕｔｒｌｃｅｃｓｏｒａｆＨｅａｒｌｕａｉｎｅｃＳ
南阳牛成纤维细胞的体外培养及生物学特性研究
楚秋霞安森亚施巧婷辛晓玲王二耀魏成斌徐照学，，，，，，
ｌｒｙｂｙｇｏｗｔｕｖ．ｌａｔｖｔｉｆｒｎｅｂｅｗｅｎｃｌｆｅｚｎｇａｄｃｌｒｖｖｎｓｎｏｉｉｉｈｃｒｅＣｅｌｃｉｉｙｄｆｅｅｃｔｅｅｌｒｅｉｎｅｌｅｉｉｇｉｔｓｇｎｆ— ｃｎ．ｌｋａｙｔｐｅｉｏｒｌａｔＣｅｌｒｏｙｓｎｍａｗｈｅｕｂｕｌｕｅｆｓｘｐｓａｅ．ＦｌｗｃｔｍｅｒｃｔｓｒｓｌｓｎｓｃｔｒｄｏｒｉａｓｇｓｏｙｏｔｉｅｔｅｕｔｓｗｅｈｔＧＯ— Ｇ１ｐｓｎｄＦ８ｇｅｒｔｏｅｌｉｒａｅｈｏｄｔａｈａｅｏｆＦ４ａｎｅａｉｎｃｌｎｃｅｓｄｂｙ１７ｔａｅ，ｎｄＦ８ｇｎｒｔｏｅｌｄｅｒａｅ１ｈｅＳｐｈｓＦ４ａｅｅａｉｎｃｌｃｅｓｔｏ４ｔ０．ｍｐｒｄｔｏ２Ｃｏａｅｏ

成纤维细胞的生物学特性及其成骨作用的研究进展

骨缺损(尤其是大型骨缺损)的治疗，由局部伤情复杂和缺乏理想的修复材料，一直是困扰临床医生和基础医学工作者的一大难题，而寻找一种尽可能达到或接近自体骨移植效果的理想的骨替代材料更是无数学者热切探索、孜孜以求的目标。近年来日趋活跃的骨组织工程(bone tissue engineering)技术为这一课题的研究带来了新的亮点和希望。目前动物实验已能从骨膜、骨髓等定向性骨祖细胞(determined osteogenic precursor cells, DOPC)密集处分离培养出成骨细胞，经体外扩增并与载体结合，回植体内骨缺损处取得骨缺损修复的成功。与此同时，基于对患者易接受性、可操作性和更简单易行性等方面的考虑，研究者又开始把目光投向诱导性骨祖细胞(inducible osteogenic precursor cells, IOPC)。其中，在体内分布广泛、数量巨大、部位表浅、取材方便、培养传代易行、分裂增殖迅速的成纤维细胞首先成为了研究的焦点。由于目前许多相关研究尚处于实验阶段，为此，本文着重就成纤维细胞的生物学特性及其成骨作用等作一综述。

1 成纤维细胞的来源及其生物学特性

成纤维细胞(fibroblast)是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。在结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维细胞(fibrocyte)的形式存在，二者在一定条件下可以互相转变。

不同类型的结缔组织含成纤维细胞的数量不同。通常，疏松结缔组织中成纤维细胞的数量比同样体积的致密结缔组织中所含成纤维细胞的数量要少，故分离培养成纤维细胞多以真皮等致密结缔组织为取材部位［2，3］。

大鼠原代心肌成纤维细胞冻存与解冻

桂林赛奥生物技术有限公司

鼠原代心肌成纤维细胞（Primary cardiac fibroblasts）是一种源于新生S-D大鼠心脏组织的亚克隆原代成纤维细胞，保有成纤维细胞原有的多种生物学性质，包括弹性蛋白和AT1受体的表达以及少量肌球蛋白的表达，可增殖传代数次。成品使用冻存管储存于-190℃液氮罐中。一般，每个冻存管所含细胞数 >5 x 105 。

1、使用前应分步解冻，操作步骤如下：

z预先将解冻培养基置于37℃ 水浴中加热；

z将细胞冻存管从液氮罐中取出并迅速（数分钟内）将其置入37℃水浴中；

z把解冻培养液加到培养瓶或培养皿内；

z缓慢地（不得少于1分钟）把细胞接种到培养瓶或培养皿；

z将已经接种细胞的培养瓶或培养皿置于二氧化碳培养箱内，不要过度振摇。

当细胞贴壁时（通常需要数小时），更换新鲜生长培养基并继续培养。在细胞长满之前作次（传）代培养。

2、次代培养

z将培养瓶或培养皿中的培养液吸弃；

z用2 ml 的0.25% (w/v) Trypsin-0.53 mM EDTA溶液简单清洗细胞层；

z加3 ml的Trypsin-EDTA溶液，置37℃二氧化碳培养箱中, 在倒置显微镜下观察细胞层脱落；

z加入7.0 ml完全生长培养基，用吸液管轻轻抽吸细胞使细胞分散；

z按照1:4～6的比例将细胞再次接种于新的培养瓶或培养皿中，置37℃二氧化碳培养箱中培养；

z每2～3天更换一次新鲜培养基。

3、解冻培养液：17ml去离子水+3ml胎牛血清（FBS）混合而成

4、生长培养基：Dulbecco’s改良任格氏培养基（DMEM），含10% FBS以及1000U/L 青霉素、1mg/L链霉素。

细胞的冻存与复苏

一.实验原理

体外培养的细胞随着传代次数的增加，在体外环境中生存时间的增长，其各种生物特性都将逐渐发生变化，且细胞的传代培养过程中，培养器具、培养液等都需大量的耗费，因此及时进行细胞冻存十分必要。

细胞冻存通常指将细胞冷冻储存在-196℃的液氮中，理论上可以储存无限长的时间。如果不加保护剂直接对细胞进行冷冻，会导致细胞内外的水份迅速形成冰晶，并对细胞的结构造成损害。目前冻存细胞时多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，缓慢冷冻时可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成而造成的细胞损伤，且不会对细胞造成毒性。

细胞的复苏是指将冻存的细胞从液氮中取出融解，使其活力恢复的过程。细胞复苏应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

二.试剂器材

1.完全培养基

2.PBS

3.DMSO

4.0.25%胰酶(贴壁细胞需要)

5.0.4%台盼蓝溶液(取台盼蓝0.4g，溶于100ml生理盐水或PBS中，经

0.22μm滤膜过滤除菌，分装于1.5ml无菌离心管中，室温保存备用)

6.冻存培养液(取完全培养基9.0ml，逐滴加入DMSO 1.0ml)

7.细胞培养瓶

8.15ml离心管

9.冻存管

10. 水浴锅

其他器材：移液器、移液器吸头(10μl、100μl、1ml)、温度计、镊子、血

球计数板、计数器、废液缸、离心管架、涡旋振荡器等。

三.操作步骤

细胞冻存

冷冻前24-48hr更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期；

南阳牛成纤维细胞的体外培养及生物学特性研究

楚秋霞;安森亚;施巧婷;辛晓玲;王二耀;魏成斌;徐照学

【期刊名称】《河南农业科学》

【年(卷),期】2012(041)004

【摘要】建立了南阳牛成纤维细胞系,旨在为制备转基因克隆牛提供核供体细胞.以南阳牛耳缘组织作为试验材料,通过组织块法培养分离南阳牛成纤维细胞,并进行生物学特性分析.结果表明,含有15％ FBS的DMEM/F12培养基较适合原代牛成纤维细胞的体外培养.分析了细胞冻存前和复苏后的活率,分别为95.9％和90.2％,差异不显著；生长曲线表明细胞生长正常.南阳牛成纤维细胞传至第6代时,细胞核型正常.流式细胞仪检测结果显示,G0-G1期的F4和F8代细胞占细胞总数的64.35％和64.53％,F11代细胞占细胞总数的81.90％.在S期,F4代细胞占细胞总数的30.69％,F11代细胞占细胞总数的16.37％.结果表明,所培养的南阳牛成纤维细胞可作为体细胞核移植的供体细胞进行转基因克隆牛方面的研究.

【总页数】4页(P135-138)

【作者】楚秋霞;安森亚;施巧婷;辛晓玲;王二耀;魏成斌;徐照学

【作者单位】河南省农业科学院畜牧兽医研究所,河南郑州450002;郑州牧业工程高等专科学校,河南郑州450002;河南省农业科学院畜牧兽医研究所,河南郑州450002;河南省农业科学院畜牧兽医研究所,河南郑州450002;河南省农业科学院畜牧兽医研究所,河南郑州450002;河南省农业科学院畜牧兽医研究所,河南郑州450002;河南省农业科学院畜牧兽医研究所,河南郑州450002

小鼠胚胎成纤维细胞原代培养实验具体步骤及方法

小鼠胚胎成纤维细胞原代培养实验具体方法及步骤

将小鼠的胚胎成纤维细胞（MEF）从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置MEF生长培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。

一、实验材料准备

1. 动物

孕期14至16天的孕鼠(小鼠)。

2. 试剂

无Ca2+和Mg2+的PBS(D-PBS)、0.05%胰酶、0.53 mmol/L EDTA溶液、MEF生长培养基(高糖DMEM加10%FBS)。

3. 器械

眼科直剪3把、眼科直镊3把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套、200目尼龙滤网、50 ml 和15 ml离心管和手术刀片。以上物品均需要高压灭菌消毒处理。

二、具体操作

1. 处死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪

开，用另外一组剪刀、镊子剪开腹部肌层，露出子宫，最后用第三组剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。

2. 用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30 ml D-PBS的50 ml离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉D-PBS，再重复此步骤一次，注意要留少许D-PBS，然后将胚胎转移到另一装有D-PBS的平皿中，并用手术刀片将其细细切碎。

3. 用200 ul的移液枪反复、快速地吹打平皿中的液体，转移至15 ml离心管中，于4℃1500 rpm离心5分钟，倒掉上清，以10 ml胰酶重悬沉淀，放在37℃水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。

4. 将上层细胞悬液倒入一个装有10 ml MEF生长培养基的50 ml离心管中，用200目的尼龙网过滤后，以1 500 rpm离心5分钟收集细胞，再用30 ml MEF生长培养基洗涤两次。

广西巴马小型猪成纤维细胞体外培养体系的建立

—
Ｓｎｒｚ和小鼠抗人角蛋白单克隆抗体（国，ａｔＣｕ）ａ美
Ｓｎｒｚ等。ａｔＣ）ａｕ１１３主要仪器和耗材．．二氧化碳培养箱（ｏｍＦｒａ
可看到肺成纤维细胞游出，２—３ｄ可以看到睾丸成纤维细胞游出，４ｄ可以看到脾部成纤维细胞生３—
ｃｕｄｐｏｉｅｄｆｒｎｙｅｔｒａｓｆｒｔｅｍｉｍｍａｉｕａｉｎ，ｈｎ・ｎｐｌｔｏｆｕｌａｒｎｆｒａｄｔｎｇｎｃｒｌｔｄｍａｉｕａｏｒｖｄｉｅｔｔｐｓｏｍａｅｌｈｃｌｅｆｉｏｎｐｌｔｏａｄｍａｉｕａｎｏｃｅｒｔａｓｎｒｓｅｉｅａｅｎｐｌ— ｉｎｅａ
ＦＳ混匀，１０ｒｍｎ离心４ｍｎ弃去上清液，Ｂ）１０ｉ／ｉ，加入少许新鲜ＤＭ。用剪去１ｍＬ枪头尖端的移液ＭＥ
枪混匀，取适量组织块于细胞培养皿内，轻震吸轻
荡，并用移液枪将组织块分布均匀，放人３７或３９ ℃、饱和湿度、５％ＣＯ培养箱过夜，２天补加１第２ｍＭＭ（ＬＤＥ尽量不要震荡培养皿）培养２ｄ即，
ＤＢ，入１ＰＳ转５ｍＬ塑料离心管，于旋涡震荡器上震荡，然后１０ｍｎ离心４ｍｎ如此反复离心３— １０ｒｉ／ｉ，５次，直至上清液变清晰。最后加入２～３ｍＬＤＭＭＥ（９％含双抗的ＤＭ储液＋１％ＮＡ＋１８ＭＥＥＡＯ％

人脐带华通氏胶间充质干细胞的分离_培养_鉴定及冻存_复苏

间充质干细胞(mesenchymol stem cells，MSCs)是来源于发育早期中胚层和外胚层的多能干细胞，具有显著的自我更新和多向分化能力。目前 MSCs 的主要来源为成人骨髓及脐血，但成人骨髓源 MSCs 数量及增殖分化潜能随年龄的增大而下降 [1]，病毒感染率较高，且供者 MSCs 的采集因需行骨髓穿刺术而受限。脐血 MSCs 的分离会损失脐血中造血干细胞。近年研究显示，人脐带中也存在大量 MSCs；脐带
[摘要] 目的：探讨从人脐带华通氏胶(Wharton’s jelly，WJ)中分离、培养、鉴定间充质干细胞(mesenchymal stem
cells，MSCs)及其冻存、复苏的方法。方法：采用植块法分离、培养间充质干细胞，流式细胞仪检测 P3 代细胞免疫表型，鉴
见明显钙结节;成脂诱导 14 d，有明显的脂滴出现，油红 O 染色阳性。冻存再复苏细胞活力达 80%，细胞免疫表型及成
骨、成脂诱导显示与冻存前细胞呈相同的特性。结论：组织块培养法可从人脐带华通氏胶中分离、培养出纯度较高间充
质干细胞，冻存、复苏不改变其特性。
[关键词] 人脐带间充质干细胞；华通氏胶；细胞培养；诱导分化；冻存
2结果
2.1 脐带华通氏胶 MSCs 的分离与培养成功从脐带分离出 WJ，植块培养，用倒置显微镜观察。 1~2 d 见组织块部分贴壁，6 d 左右组织块周围有细胞爬出 (图 4)，10 d 左右细胞已有成片聚集，聚集处呈火山喷发状。细胞多为双突起的长梭形、短棒状或扁平形的成纤维样细胞，核仁明显。 14~18 d 时，细胞融合达 70%~80%，此时消化、传代，去除组织块，传代后细胞生长能力明显增强，至 P2 代以后，隔天细胞即需传代。细胞密度较低时成扁平单层细胞，细胞密度较高时趋于融合，细胞变细长，类似成纤维细胞，呈平行或旋涡状生长(图 5)。

成纤维细胞培养

人皮肤成纤维细胞库的构建

试剂: 胶原酶(Sigma)，优质胎牛血清(Gibco)，胰蛋白酶(Sigma)，中性蛋白酶(Sigma)，DMEM培养基(Sigma)，二甲基亚砜(Merck)。

配液 :成纤维细胞培养基配制:DMEM10g，NaHCO3 3．7g，HEPES 2．4g，优质胎牛血清100ml，青霉素100 000U，链霉素100 000U，超纯水加至1 000ml，用1N NaOH 调pH值至7-2～7．4，0．22pan孑L滤膜过滤除菌，9Om】／瓶分装，一2O℃贮存备用。D—Hanks 平衡盐液：NaC1 8．0g，KC1 0．4g，Na2HPO4·12H：0 134．4mg，KH~PO4 0．06g，NaHCO3 0．35g，酚红O．O2g，青霉素100000U，链霉素100000U，超纯水加至1 o0Ornl，用1N NaOH调pH值至7．2-7A，0．22tun孔滤膜过滤除菌，90ml／瓶分装，一2O℃贮存备用。

方法:乙醇棉球将标本用力擦拭3遍；标本移至培养皿中，用D—Hanks平衡盐液反复用力彻底冲洗标本5遍，直至标本发白，轻度发胀；在培养皿中修剪皮下筋膜组织及多余的皮下脂肪，将标本剪成0．3cmx2．0em大小的皮条，置于培养皿中，加0．25％胰蛋白酶浸没组织，4℃冰箱中消化14~16h，以用眼科镊能轻轻揭下表皮为度；消化后的标本置于超净工作台上。吸出胰蛋白酶，用DMEM漂洗2遍，中止胰蛋白酶消化作用；用眼科镊轻轻揭下表皮，置于另一培养皿中(用于培养角质形成细胞)，真皮置于培养皿中，用眼科剪将真皮成分剪成糊状(组织大小约为0．1cmx0．1cmx0．1cm)，加入0．2％胶原酶浸没组织，37℃孵箱中消化1~4h，以将组织基本上消化散开，看不到组织块为度；加D-Hanks平衡盐液1 500#min离心5min，5遍，以洗去胶原酶，沉淀即为成纤维细胞，弃上清，加DMEM制成细胞混悬液，接种至50ml培养瓶中，置37℃、5％CO：、湿度95％的CO 孵箱中培养131。24h后更换培养基，以后更换培养液1次／3d，大约7~9d左右长满后传代。

小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养

一、实验材料

1.主要仪器设备

(1)倒置显微镜（Olympus，Japan）

(2)CO2培养箱（BB16HF，上海力申科学仪器有限公司）

(3)100ml的玻璃培养瓶（江苏海门市大路塑料实验仪器厂）

(4)6孔培养板（COSTAR，每孔直径为3.5cm）

(5)Eppendroff管

(6)1ml,2ml,5ml的玻璃滴管各30支；10ml尖底离心管和直径为8cm的平皿

(7)离心机

(8)5ml冻存管

(9)两套小鼠用解剖器械（包括眼科剪和眼科镊）

2.主要试剂配制

(1)MEF(mouse embryo fibroblast，小鼠胚胎成纤维细胞)培养液

——低糖DMEM母液

1)用一个1000ml的大烧杯加入1000ml无菌无内毒素的超纯水（购自福州新北生化工业有限公

司）；

2)将一小袋低糖DMEM(GIBCO/BRL,Cat.No.31600-034)全部加入上述水中，同时轻轻搅拌，并冲

洗包装袋的内面以洗下所有的粉未。

3)每升培养基中添加3.7gNaHCO3。

4)搅拌直至完全溶解。

5)用1NHCl或1NNaOH调培养基的pH至比最终的工作液的PH低0.2-0.3，调好PH后，将容器

密封（在该实验中用1NHCl调PH至7.3）。

6)立即用0.22um的滤器过滤除菌，装入高压过的盐水瓶中, 4℃保存(1个月内用完)。

——MEF培养液

取100ml上述配好的低糖DMEM液体，加入10000IU青霉素钠（6.25mg）和10mg链霉素，溶解后再次调节PH至7.3，经0.22um的滤器过滤至高压过的血清瓶中，再添加10ml分装好的新生牛血清（Newborn Calf Serum, GIBCO/BRL,需56℃，30min灭活过），4℃保存至使用。

体外培养、冻存及复苏对大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

８％时，１２传代。０按：
［基金项目］广东省科技计划项目（０６３９１０）２０Ｂ５００３。
维普资讯 http://www.cqvip.com
山东医药２０第４第６期０８年８卷
体外培养、存及复苏对大鼠骨髓间充质冻干细胞生物学特性的影响
付霞霏，何援利
（南方医科大学珠江医院，东广州５０８）广１２０
２０～０７年，０５２０我们应用密度梯度离心法结合贴壁胞悬液，口后作好标记。按如下程序进行降温冷封法分离大鼠ＭＣ，Ｓｓ观察冻存对ＭＣ增殖能力及其冻：ｏ０５ｈ÷ ０ｏ１５ｈ ÷一０℃ １＿液氮Ｓｓ４Ｃ．＿２．－８Ｃ２ｈ ÷ 生物学特性的影响，一步实验研究奠定基础。为进（１６ｏ）一９中保存。Ｃ
１材料与方法
将冻存的细胞在６月后取出，文献步骤个按６～周龄近交系无特定病８进行复苏，台盼蓝染色后，计数活细胞及死细胞数目，根据细胞存活率（％）＝活细胞／活细胞数＋（死细胞数）１０计算细胞存活率。用培养基调整 × ０％，
化，而失去其多分化的潜能，为保证整个实验顺利完

成纤维细胞培养

人皮肤成纤维细胞库的构建

试剂：胶原酶(Sigma),优质胎牛血清(GibCo),胰蛋白酶(Sigma),中性蛋白酶(Sigma),DMEM培养基(Sigma),二甲基亚碉(MerCk)O

配液:成纤维细胞培养基配制:DMEM1.Og,NaHC033.7g,HEPES2.4g,优质胎牛血清IOOn1.1,青霉素IOoOoOU,链霉素IOoOOOU,超纯水加至IoOOm1,用INNaOH调PH值至7-2〜7.4,0.22Pan孑1.滤膜过滤除菌，90m]/瓶分装，一20℃贮存备用。D-Hanks平衡盐液：

NaC1.8.0g,KC1.0.4g,Na2HPO4∙12H：0134.4mg,KH~P040.06g,NaHC030.35g,酚红0.02g,青霉素IO(X)OOU,链霉素IooooOU,超纯水加至

1OOorn1,用INNaoH调PH值至7.2-7A,0.22tun孔滤膜过滤除菌，90m1./瓶分装，一20C贮存备用。

方法:乙醇棉球将标本用力擦拭3遍；标本移至培养皿中，用D-Hanks平衡盐液反复用力彻底冲洗标本5遍，直至标本发白，轻度发胀；在培养皿中修剪皮下筋膜组织及多余的皮下脂肪，将标本剪成0∙3cmx2.Oem大小的皮条，置于培养皿中，加0.25%胰蛋白酶浸没组织，4°C冰箱中消化14~16h,以用眼科镣能轻轻揭下表皮为度；消化后的标本置于超净工作台上。吸出胰蛋白酶，用DMEM漂洗2遍，中止胰蛋白酶消化作用；用眼科镜轻轻揭下表皮，置于另一培养皿中(用于培养角质形成细胞)，真皮置于培养皿中，用眼科剪将真皮成分剪成糊状(组织大小约为0.1CmXo.1CmX0.1cm),加入0.2%胶原酶浸没组织，37。C孵箱中消化1.~4h,以将组织基本上消化散开，看不到组织块为度；力IW-HankS平衡盐液1500#Inin离心5min,5遍，以洗去胶原酶，沉淀即为成纤维细胞，弃上清，力口DMEM制成细胞混悬液，接种至50In1.培养瓶中，置37°C、5%C0：、湿度95%的CO孵箱中培养131。24h后更换培养基，以后更换培养液1次/3d,大约7~9d左右长满后传代。