微小RNA-379-5p对肝癌细胞迁移和侵袭的影响解析

时上室平铺Ｍａｔｒｉｇｅｌ胶），下室加入５００ Ｉｘｌ含２０％胎 牛血清的ＤＭＥＭ培养基，在培养箱中培养２４ ｈ后弃 去培养基，用棉签擦去小室内表面的细胞，对下室面 细胞进行甲醛固定、结晶紫染色。显微镜下观察，随
ＣＯ，的培养箱中培养，常规消化传代。 ２．稳定表达ｍｉＲ－３７９－５ｐ细胞株的构建：根据 ｍｉＲＮＡ数据库中获取的人ｍｉＲ一３７９－５ｐ序Βιβλιοθήκη Baidu，设计并 合成ｍｉＲ．３７９－５ｐ前体引物及阴性对照引物。ｍｉＲ一
ａｎｄ ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｉｎ ｍｉＲ一３７９・５ｐ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜ ０．０５）．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｇｒｏｕｐｓ（Ｐ＞
０．０５）．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅ
ｍＲＮＡ ａｎｄ
ｐｒｏｔｅｉｎ
ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ
ＭＭＰ－２
ａｎｄ
ＭＭＰ－９
ｉｎ
ｍｉＲ－３７９－５ｐ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ
材料与方法 一、材料 人肝癌细胞株ＨｅｐＧ２购自中国科学院上海生 命科学研究院细胞库。ＤＭＥＭ培养基和０．２５％胰 酶购自美国Ｇｉｂｃｏ公司；胎牛血清购自美国Ｈｙｃｌｏｎｅ 公司；Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室（８仙ｍ孔径）购自美国Ｃｏｍｉｎｇ 公司；Ｍａｔｒｉｇｅｌ胶购自美国ＢＤ公司；噻唑蓝（Ｍ ｒ兀１） 购自美国Ｓｉｇｍａ公司；Ｔｒｉｚｏｌ试剂购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
氢酶（ＧＡＰＤＨ）抗体购自美国Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ公司产品；
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ
２０００购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。
二、方法 １．细胞培养：人肝癌细胞株ＨｅｐＧ２生长于含有 １０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养基中，置于３７
ｏＣ、５％
基将ＨｅｐＧ２细胞制成单细胞悬液，将１００ ｔｘｌ细胞 （１×１０５／孑Ｌ）接种于Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室上室（侵袭实验
３’，下游引物：５’ ３－肌动蛋白（Ｂ—
３
７，
ａｃｔｉｎ）—匕游弓ｌ物：５’ＧＧＡＧＡＡＴＧＧＣＣＣＡＧＴＣＣＴＣ 下游引物：５
７
公司；逆转录试剂盒购自日本Ｔｏｙｏｂｏ公司；ＧｏＴａｑ＠
ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ
ＧＧＧＣＡＣＧＡＡＧＧＣＴＣＡＴＣＡＴ ３ ７。ＰＣＲ Ｓ，９５ ｏＣ １５ ｓ，６０ ｏＣ ６０
方法利用携带ｍｉＲ－３７９．５ｐ的慢病毒感染肝癌细胞株ＨｅｐＧ２为ｍｉＲ一３７９－５ｐ组，携带阴性对照序列 的慢病毒感染ＨｅｐＧ２细胞为阴性对照组，未做处理的ＨｅｐＧ２细胞为空白对照组。噻唑蓝（Ｍ７ｒｒ）与 Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ实验分别检测细胞的增殖、迁移和侵袭能力；实时荧光定量聚合酶链反应（ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ）和 免疫印迹方法分别检测基质金属蛋白酶（ＭＭＰ）－２和ＭＭＰ－９ ｍＲＮＡ和蛋白的表达。结果ｒｅａｌ．ｔｉｍｅ ＰＣＲ法检测各组ｍｉＲ－３７９—５ｐ的表达水平，结果显示ｍｉＲ一３７９－５ｐ组ｍｉＲ－３７９－５ｐ相对表达量（１９９．６７± １．３５）明显高于阴性对照组（０．９８－ｔ－０．１６）和空白对照组（１．０±０．１１），差异有统计学意义（尸＜ ０．００１）。ｍｉＲ一３７９－５ｐ组细胞迁移及侵袭能力显著低于阴性对照组及空白对照组（Ｐ＜０．０５）；但３组 间细胞增殖能力的差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。ｎｆｉＲ一３７９．５ｐ组ＭＭＰ一２和ＭＭＰ－９的ｍＲＮＡ和蛋白 表达水平明显低于阴性对照组及空白对照组（Ｐ＜０．０５）。结论ｍｉＲ－３７９－５ｐ可抑制肝细胞癌细胞迁 移和侵袭，可能是通过抑制ＭＭＰ一２和ＭＭＰ一９表达实现的。
Ｓ
Ｍｉｘ试剂盒购自美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司；基
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司；甘油醛－３－磷酸脱
反应条件：９５℃预变性３０
质金属蛋白酶（ＭＭＰ）－２抗体和ＭＭＰ－９抗体购自美
国Ｃｅｌｌ
Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ
共４０个循环。分别以ｕ６和１３－ａｃｔｉｎ为内参，通过
２“血。相对定量法计算相对表达量。 ４．Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ迁移和侵袭实验：用无血清培养
７，
下游弓Ｉ物：
５’
ＡＡＣＧＣＴＴＣＡＣＧＡＡＴＩＴＧＣＧＴ
３’；ＭＭＰ一２上游弓ｌ物：
３ ７，下游引物：５’
５’ＧＡＣＡＡＣＧＣＣＣＣＣＡＴＡＣＣＡＧ
ＣＡＣＴＣＧＣＣＣＣＧＴＧＴＧｒｒｒＡＧＴ ３ ７；ＭＭＰ－９上游引物： ５ ７ＡＣＧＣＡＧＡＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣＣＡＧＴ ＧＧＡＣＣＡＣＡＡＣＴＣＧＣＡＴＣＧＴＣ ３’；
ＰＣＲ）：利用Ｔｒｉｚｏｌ法抽提细胞中的总ＲＮＡ，按照逆 转录试剂盒及实时定量ＰＣＲ试剂盒说明分别进行
逆转录反应及ｒｅａｌ．ｔｉｍｅ ＰＣＲ。ｍｉＲＮＡ．３７９．５ｐ上游 弓ｌ物：５’ＧＣＧＣＴＧＧＴＡＧＡＣＴＡＴＧＧＡＡ ３’，下游弓Ｉ物：
５’ＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴ ＣＴＣＧＣ‘ＩＴＣＧＧＣＡＧＣＡＣＡ ３ ３ ７；Ｕ６上游引物：５’
３’；下游弓Ｉ物（Ｒ）： ３’。利用ＰＣＲ方
５’ＴＧＧＴＡＧＡＣＴＡＴＧＧＡＡＣＧＴＡＧＧ
ｍｉＲ一３７９－５ｐ ｃａｎ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｏｆ ＨＣＣ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ，ｗｈｉｃｈ ｍａｙ ｂｅ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ＭＭＰ－２ ａｎｄ ＭＭＰ－９ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ．
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】
ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ
已被证实其在肿瘤的发生发展中起重要作用¨。２ ｏ。 ｍｉＲＮＡ一３７９（ｍｉＲ一３７９）是ｍｉＲＮＡ家族的重要一员， 已发现其参与乳腺癌、前列腺癌的进展旧圳。我们也 发现ｍｉＲ－３７９－５ｐ在肝细胞癌组织及细胞株中的表
达明显下调（待发表），但目前有关ｍｉＲ．３７９对肝细 胞癌的调控作用及其相关机制尚不清楚。本研究利 用慢病毒表达载体成功构建了稳定过表达ｍｉＲ一３７９． ５ｐ的人肝细胞癌模型，观察ｍｉＲ－３７９－５ｐ对肝癌细胞 增殖、迁移和侵袭的影响并探讨其可能的作用机制。
ｏｆ Ｓｕｒｇｅｒｙ，ｔｈｅ
Ｆｉｒｓｔ
Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ
ｏｆ Ｃｕａｎｇｚｈｏｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
Ｔｏ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０１２０，Ｃｈｉｎａ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：Ｃｈｅｎ
ｆｉｎ，ｓｏｎｇ，Ｅｍａｉｆ：ｈｙｃｈｅ咖＠１２６．ＣＯｒｎ
ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ
ＷａＳ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ
ｇｒｏｕｐ．Ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ａｎｄ
３一［４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２一ｙ１］－２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｈｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ
ａｓｓｅｓｓｅｄ ｂｙ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ａｓｓａｙｓ．Ｔｈｅ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ
３７９－５ｐ前体的引物序列为上游引物（Ｆ）：５
ＴＧＧＴＡＧＡＣＴＡＴＧＧＡＡｃＧＴＡＧＧ
７
机选取５个视野（×１００）拍照、计数。结果表示为 空白对照组的百分率（％）。
５．ＭＴＴ法检测细胞增殖能力：取对数生长期细 胞接种于９６孑Ｌ板，分别培养２４、４８、７２ ｈ，培养结束 前４ ｈ每孔加入２０斗１ ＭＴＦ溶液，孵育４ ｈ后弃去上 清，加入二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）１５０ ｔｘｌ，振荡１０ ｍｉｎ，酶 标仪检测４９０ ｎｍ处吸光度（Ａ）值。 ６．Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹检测ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９蛋白的表
（ＭＴＴ）ａｓｓａｙｓ．Ｃｅｌｌ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｍａｔｒｉｘ
ｉｎｖａｓｉｏｎ ｗｅｒｅ
ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－２（ＭＭＰ一２）ａｎｄ ＭＭＰ一９ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ
Ｇｕｍｌｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ（￥２０１２０４０００６８０３）；Ｋｅｙ Ｐｒｏｊｅｃｔ ｏｆ Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｍｕｎｉｃｉｐａｌ
Ｐｌａｎｎｉｎｇ（２０１１Ｊ４１０００５３）
微小ＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ，）是一类内源性
纯化上清液并测定病毒滴度。然后，将病毒感染 ＨｅｐＧ２细胞，应用荧光观察和嘌呤霉素（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】
ｍｉｃｒｏＲＮｈ－３７９－５ｐ（ｍｉＲ－３７９．５ｐ）ｏｎ
Ｈｕｍａｎ ＨＣＣ ｃｅｌｌ
ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＨＣＣ）ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｌｉｎｅ ＨｅｐＧ２ ｗａｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ
筛选，获得稳定表达ｍｉＲ．３７９．５ｐ或阴性对照的 ＨｅｐＧ２细胞。细胞分组：未处理的ＨｅｐＧ２细胞为空 白对照组；阴性对照慢病毒感染的ＨｅｐＧ２细胞为阴 性对照组；ｍｉＲ一３７９—５ｐ慢病毒感染的ＨｅｐＧ２细胞为 ｍｉＲ一３７９－５ｐ组。 ３．实时荧光定量聚合酶链反应（ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ
的非编码小ＲＮＡ，广泛存在于病毒、植物及动物中，
ｌｅｎｔｉｖｉｍｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｍｉＲ一３７９－５ｐ（ｍｉＲ一３７９—５ｐ ｇｒｏｕｐ）ｏｒ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ）．Ｔｈｅ ｕｎｔｒｅａｔｅｄ ＨｅｐＧ２ ｅｅｌｓ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（ｎｅｇａｔｉｖｅ
Ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ｈｅｐａｔｏｅｅｌｌｕｌａｒ；
ｍｉｃｒｏＲＮＡ一３７９－５ｐ；
Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ；
Ｉｎｖａｓｉｏｎ；
Ｍａｔｒｉｘ
Ｆｕｎｄ ｐｒｏｇｒａｍ：Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ（８ １２０１９３０）：Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｕｎｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｏｃｔｏｒａｌ Ｐｒｏｇｒａｍ ｏｆ Ｈｉｇｈｅｒ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ（２０１２４４２３１２０００６）：Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ
【关键词】癌，肝细胞；ｍｉＲ－３７９－５ｐ；迁移；侵袭；基质金属蛋白酶
基金项目：国家自然科学基金（８１２０１９３０）；高等学校博士学科点专项科研基金项目（新教师类） （２０１２４４２３１２０００６）；广东省自然科学基金（￥２０１２０４０００６８０３）；广州市科信局重点资助项目
（２０１１Ｊ４１０００５３）
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０３７６－２４９１．２０１６．１８．０１３ 作者单位：５１０１２０广州，广州医科大学附属第一医院外科（陈劲松、黄炯强、董世濠）；中山大学附属第一医院外 科实验室（黄晓卉） 通信作者：陈劲松，Ｅｍａｉｌ：ｈｙｅｈｅｎｊｓ＠１２６．ｔｏｍ
万方数据
主堡医堂盘查！Ｑ！！生ｉ旦！！旦箜！！鲞箜！！塑盟！！！丛型』ｇ！ｉ塑：塑型！！：！！！！：！！！：堑：堕！：！！
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ－３７９－５ｐ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ
ｏｎ
ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｅＨｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ
Ｃｈｅｎ Ｊｉｎｓｏｎｇ，Ｈｕａｎｇ Ｊｉｏｎｇｑｉａｎｇ，Ｄｏｎｇ Ｓｈｉｈａｏ，Ｈｕａｎｇ Ｘｉａｏｈｕｉ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ＨｏｓｐｉｔａＺ
・１４５０・
空堡匿堂苤查！！！！生ｉ旦！！旦筮堑鲞箜！！塑盟趔丛鲤』鱼！ｉ坚：丛型！！：！！！！：！！！：堑：盟！：！！
．基础研究
微小ＲＮＡ一３７９—５ｐ对肝癌细胞迁移 和侵袭的影响
陈劲松黄炯强董世濠黄晓卉 【摘要】
目的探讨微小ＲＮＡ一３７９－５ｐ（ｍｉＲ－３７９－５ｐ）对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响。