3种化合物对萝卜CBPs溶菌酶活性的影响赖晓芳

赖晓芳，沈善瑞，王炜军，等．3种化合物对萝卜CBPs 溶菌酶活性的影响［J ］．江苏农业科学，2013，41（1）：151－153．3种化合物对萝卜CBPs 溶菌酶活性的影响赖晓芳1，沈善瑞1，王炜军2，徐凤彩2（1．淮海工学院海洋学院，江苏连云港222005；2．华南农业大学生命科学学院，广东广州510642）摘要：溶菌酶是植物防御体系中的一部分，在植物防卫反应中有重要作用。

分析了化合物对萝卜CBPs 溶菌酶活性的影响，以期为研究其作用机制和在萝卜中的生理功能提供资料。

本研究采用亲和层析法及CM －纤维素离子交换柱层析从萝卜中分离纯化得2个具溶菌酶活性的CBPs ，并分析了GlcNAc 等3种化合物对萝卜CBPs 溶菌酶活性的影响。

结果表明：GlcNAc 和组氨酸在低浓度时对萝卜CBPs 溶菌酶活性具有激活作用，在高浓度时具有抑制作用；组胺则显示为抑制作用。

上述3种化合物均是萝卜CBPs 溶菌酶活性的竞争性抑制剂。

关键词：萝卜；溶菌酶活性；GlcNAc中图分类号：S631．101文献标志码：A文章编号：1002－1302（2013）01－0151－03收稿日期：2012－05－28基金项目：江苏省海洋生物技术重点建设实验室开放基金（编号：2008HS019）；淮海工学院博士启动基金（编号：KQ11010）；淮海工学院自然科学基金（编号：KX11111）。

作者简介：赖晓芳（1975—），女，湖南桂东人，博士，讲师，从事生物化学与分子生物学研究。

E －mail ：lai．xiaofang@163．com 。

溶菌酶（lysozyme ，EC 3．2．1．17），又称为胞壁质酶（muramidase ），是一种催化水解构成细菌细胞壁的GlcNAc 和N －乙酰胞壁酸（NAM ）之间的β－1，4糖苷键的糖苷水解酶，也能水解构成几丁质的NAM 之间的β－1，4糖苷键，生成粘多糖、粘多肽、GlcNAc 等生物小分子［1］，广泛存在于蛋清、动植物的组织或分泌物及微生物和植物中［2］。

溶菌酶具有抗菌消炎、抗病毒、增强机体免疫力功能，再加上具有天然、易消化、易吸收、无毒性、无残留、无污染的特点，因而被广泛应用于饲料防腐剂、食品添加剂及医疗等领域［3］。

植物溶菌酶最早发现于1922年［4－5］，随后展开了普查［6－7］，发现以萝卜为代表的几种十字花科植物含量最高。

本课题组从萝卜中分离纯化了2个具有溶菌酶活性的CBPs ，并研究了GlcNAc 等3种化合物对其溶菌酶活性的影响，以期进一步了解它们的作用机制及生理功能，为其应用提供基础资料。

1材料与方法1．1材料与试剂萝卜（Raphanus sativus ），网室栽培。

溶壁微球菌（Micrococcus Lysodeikticus ），购自Sigma 公司；GlcNAc 、组胺、组氨酸，国产分析纯。

1．2方法1．2．1几丁质结合蛋白的亲和分离及纯化参照赖晓芳等的方法［8］，将萝卜匀浆，离心，取上清，脱氨再生几丁质，凝胶亲和层析，羧甲基纤维素层析柱（20mm ˑ300mm ，0．025mol /L pH 值5．4的乙酸－乙酸钠缓冲液，内含0．05 0．4mol /L KCl 离子强度线性梯度）离子交换层析。

—151—江苏农业科学2013年第41卷第1期1．2．2酶活性测定参照赖晓芳等的方法［8］，溶壁微球菌悬浮液用pH 值6．2的50mmol /L PBS 配成，取2．5mL 30ħ水浴的上述悬浮液，加入0．1mL 酶液，迅速搅匀，以1min 450nm 下吸光度下降0．001所需的酶量为1个酶活性单位（U ）。

1．2．3化合物对CBPs 稳定性的影响溶壁微球菌悬浮液中加入不同终浓度的GlcNAc （0 200mmol /L ）、组胺（0 50mmol /L ）或组氨酸（0 200mmol /L ），测定溶菌酶活性。

1．2．43种化合物抑制动力学在0．1 0．5mg /mL 溶壁微球菌悬浮液中分别加入GlcNAc （终浓度为0、60、100mmol /L ）、组胺（终浓度为0、35mmol /L ）或组氨酸（终浓度为0、150mmol /L ），测定溶菌酶活性。

以双倒数1/v 1/［S ］作图。

2结果与分析2．1GlcNAc 对溶菌酶活性的影响及抑制动力学GlcNAc 对CBPs 溶菌酶活性的影响如图1。

当GlcNAc 浓度低于35mmol /L 时，对2种溶菌酶都有轻微的激活作用，当GlcNAc 浓度高于35mmol /L 时，呈现抑制作用，溶菌酶CBP 1、CBP 2活性分别于GlcNAc 浓度为75、100mmol /L 时被抑制50%的活性。

如图2所示，GlcNAc 是CBPs 溶菌酶活性的竞争性抑制剂。

2．2组胺对溶菌酶活性的影响及抑制动力学组胺对CBPs 溶菌酶活性的影响如图3。

CBP 1对组胺较CBP 2敏感，组胺浓度为20mmol /L 时CBP 1剩余59%的活性；CBP 2在组胺浓度低于20mmol /L 时较稳定，在组胺浓度为35mmol /L 时CBP 2剩余55%的活性。

由图4可知，组胺是CBPs 溶菌酶活性的竞争性抑制剂。

2．3组氨酸对溶菌酶活性的影响及抑制动力学组氨酸对CBPs 溶菌酶活性的影响如图5。

在组氨酸浓度小于75mmol /L 时有激活作用，大于100mmol /L 时表现抑制作用，且CBP 1较CBP 2对组氨酸敏感。

如图6所示，组氨酸是CBPs 溶菌酶活性的竞争性抑制剂。

—251—江苏农业科学2013年第41卷第1期3讨论GlcNAc是HEWL的有效抑制剂，抑制50%的酶活性只需7mmol/L，而植物来源的溶菌酶对GlcNAc的敏感性较弱，如番木瓜溶菌酶在GlcNAc350mmol/L时抑制40%，无花果溶菌酶在GlcNAc400mmol/L时只抑制20%［9］，弥猴桃果实中的溶菌酶在GlcNAc400mmol/L时抑制35%［10］。

萝卜CBPs溶菌酶对GlcNAc较敏感，抑制50%酶活性需GlcNAc 75 100mmol/L的浓度。

HEWL由于其中有6个Trp，所以其荧光光谱主要来自Trp的吲哚基团，Trp又是HEWL的活性中心基团，与GlcNAc相互作用之后发生荧光蓝移，蓝移表明环境变得更加疏水性了，GlcNAc正好是疏水性的，故可能是GlcNAc疏水基团与吲哚环发生相互作用，这与Phillips X－射线衍射发现一致［11］。

萝卜CBPs的Trp也可能是溶菌酶活性中心基团，故其溶菌酶对GlcNAc较敏感，而无花果、木瓜、弥猴桃等的溶菌酶中Trp不参与活性中心，故其溶菌酶对GlcNAc不敏感。

组胺既是HEWL又是植物溶菌酶的强抑制剂，在其浓度为10mmol/L时，无花果溶菌酶活性被抑制了85%，木瓜溶菌酶活性被抑制了40%，HEWL活性只被抑制30%，而萝卜CBPs活性被抑制25%需35mmol/L组胺。

Shinitzky等通过荧光猝灭技术和热力学研究方法证明了在水溶液中含有吲哚环化合物和质子化的咪唑之间形成了一个电荷转移的复合体系［12］。

含有质子化咪唑环的化合物能猝灭吲哚环的荧光作用，并增加其水溶性，并且已证明含有吲哚环的Trp是HEWL 的活性中心氨基酸残基。

因此，Shinitzky等认为被质子化咪唑环抑制HEWL活性是由于与酶的Trp形成了电荷转移体系，从而阻止了底物的结合反应。

而萝卜CBPs中Trp可能是酶的活性中心氨基酸残基，故认为可能也是其中的Trp与咪唑形成了电荷转移体系。

但其他的植物溶菌酶如无花果［9］、芜菁［13］、大牛角瓜［14］、叙利亚马利筋［15］、弥猴桃［10］溶菌酶中Trp并不参与活性中心，故Glazer［9］提出了可能是组胺及其他咪唑衍生物与活性中心的2个羧基形成氢键桥，从而阻碍了对底物糖苷键的催化水解。

从HEWL的结构模型来看，这种反应是可能的，但还需要X－射线衍射证明“溶菌酶－组胺复合物”的存在。

参考文献：［1］Leheninger A L，Nelson D L，Cox M M．Principles of Biochemistry ［M］．2nd Edition．New York：Worth Publishers，1933：180，312．［2］惠秋沙．溶菌酶的研究进展及优势分析［J］．中国健康月刊，2011，30（5）：326－327．［3］丁亦男，聂洪峰．溶菌酶的应用进展［J］．长春师范学院学报：自然科学版，2009，28（6）：46－47．［4］Fleming A，Allison VD．A bacteriolytic substance（“Lysozyme”）found in secretions and tissues［J］．Brit J Exptl Pathol，1922，5：252．［5］Fleming A．On a remarkable bacteriolytic element found in tissues and secretions［J］．Proc Roy Soc（London）Ser B，1922，93：306．［6］Audy P，Quere D L，Leclerc D，et al．Electrophoretic forms of lyso-zyme activity in various plant species［J］．Phytochemistry，1990，29（4）：1143－1159．［7］袁四清．华南植物溶菌酶含量普查和萝卜溶菌酶研究［D］．广州：华南农业大学，1991．［8］赖晓芳，蔡发国，王炜军，等．萝卜块根中两个具溶菌酶活性的几丁质结合蛋白的纯化及其特性［J］．植物生理与分子生物学学报，2006，32（4）：445－450．［9］Glazer A N，Barel A O，Howard J B，et al．Isolation and characterza-tion of fig lysozyme［J］．J Biol Chem，1969，244（13）：3583－3589．［10］Lynn K R．A lysozyme from the fruit of Actinidia chinensis［J］．Phy-tochemistry，1989，28（9）：2267－2268．［11］Shinitzky M，Grisaro V，Chipman D M，et al．Influence of inhibitory sugars on the fluorescence of lysozyme［J］．Arch Biochem Biophys，1966，115：232－233．［12］Shinitzky M，Katchalski E，Grisaro V，et al．Inhibition of lysozyme by imidazole and indole derivatives［J］．Arch Biochem Biophys，1966，116：332－343．［13］Bernier I，van Leemputten E．The turnip lysozyme［J］．FEBS Lett，1971，14：100．［14］Shukla O P．Lysozyme from the latex of Calotropis procera［J］．Biol Mem，1985，11（2）：182－191．［15］Lynn K R．Lysozymes from latex of Asclepias syriaca［J］．Phyto Chem，1989，28（5）：1345－1348．—351—赖晓芳等：3种化合物对萝卜CBPs溶菌酶活性的影响。