齐墩果酸的微生物转化研究

齐墩果酸的微生物转化研究

1.立项依据

1.1项目的研究意义

齐墩果酸(oleanolic acid)简称OA，是一种五环三萜类天然化合物，首先由木樨科植物油橄榄（Olea europaea，习称齐墩果）的叶中分离出来。该化合物广泛分布于植物界。齐墩果酸在中草药中有的以游离形式存在，如青叶胆、女贞子、白花蛇舌草、柿蒂、连翘。但大多数以与糖结合成苷的形式存在，如人参、三七、紫苑、柴胡、八月札、木通、牛膝、木忽木[1]。

β-hederin

经已研究表明，齐墩果酸具有多种药理活性，如护肝，解肝毒作用[2]，降糖作用[3]，降血

脂作用[4]，抗肿瘤活性[5]，抗病毒活性[6]抗炎活性[7] ，但大多数活性较弱而没有实用价值;另一方面，齐墩果酸的水溶性很差，生物利用度低，这也大大限制了它在临床上的应用。但是它的许多皂苷的生物活性比苷元有明显提高，如二糖皂苷β-hederin抗肿瘤活性远远强于齐墩果酸，而β-hederin所含有的a-L-吡喃鼠李糖-(1-2)吡喃阿拉伯糖结构片段则被认为对该类皂普的抗肿瘤活性有重要贡献。由此可知齐墩果酸的衍生物的结构与其生物活性有一定的关系，即存在构效关系。日本的Honda [8–12]等人随机合成并筛选了60多种齐墩果酸的衍生物。他们发现：当导入甲氧基、羰基、羟基或氰基官能团时，齐墩果酸衍生物活性能显著提高。

查阅相关文献得知，齐墩果酸的结构改造研究已经有多报道，也有进行糖苷改造的报道，但是这些报道多是根据其现有的官能团进行结构改造，如C-3、C-4和C-28位的结构改造，或者是在前者改造的基础上再进行改造。齐墩果酸母体结构上的官能团较少，可以说，从一方面限制了糖苷化合物的合成种类，给糖苷的合成增加了难度。另外官能团的种类与数量的局限，也是造成其水溶性差的原因之一。

微生物转化就是微生物将一种物质(底物)转化成为另一种物质(产物)的过程，这一过程是由微生物产生的一种或几种特殊的胞外或胞内酶作为生物催化剂进行的一种或几种化学反应。通过微生物的转化可以使物质的化学结构发生改变，主要是经过细菌的脱氢反应、水解反应、酰基化反应，降解反应、脱水反应，放线菌的羟基化反应，酵母菌的水解反应、还原反应，霉菌的水解反应、还原反应、脱水反应。使化合物的结构发生了变化。通过这些结构的改变可以获得一些通过化学化学方法难以转化出的物质，而这些物质可以成为一些药物生成的中间体。与化学合成相比微生物转化反应条件温和、公害少、设备简单、反应速度快，反应步骤少，对立体结构合成上具有高度的专一选择性，回收率高、成本低等优点。微生物转化得到的物质，现已经应用到了多种药物的合成[13]。

本研究的意义在于通过选取一种具有羟基化转化能力的微生物通过微生物的转化改变齐墩果酸的化学结构。使其化学结构增加一个或者几个羟基，一方面可以改变其溶解性，另一方面为一些药物的合成提供中间体，同时通过结构的改变也能改变其本身的生物活性。对临床合理用药、扩大药源和研发新药都有积极的意义。

1.2研究进展现状及分析

1.2.1微生物转化研究进展

1864年巴斯德发现乙酸杆菌能将乙醇氧化为乙酸，1952年Peterson和Murray[14]应用黑根霉（Rhizopus nigricans）一步将孕酮11位羟基化，从而使孕酮合成皮质酮仅需3步，促使可的松问世，微生物转化才受到人们的普遍重视。至此发现微生物转化具有高度的立体结构选择性

[15]、转化条件温和、设备简单、生产安全、收率高、成本低等特点。1958年，黄鸣龙教授等

[16]用黑根霉使16a，17a-环氧孕甾-4 烯-3，20-二酮氧化引入C

a-羟基，从而开创了自薯蓣皂

11

素合成可的松的7步法新路线。这是我国第一个用于甾体药物生产的微生物合成。朱关平[17]采用无毒黄曲霉菌株T-419（GCMCCO158），将在喜树中含量较高的喜树碱转化为10-羟基喜树碱转化率达50%以上，采用该法生产10-羟基喜树碱扩大了药源。马晶等[18]用刺囊毛霉AS313450，将甘草中的的甘草次酸转化为7β-羟基甘草次酸，主产物得率为875mg/g甘草次

酸。刺囊毛霉AS313450能够专一性地对甘草次酸进行羟基化反应，这为研究甘草次酸药物开发及体内代谢研究提供一定的理论依据。茅燕勇等[19]用刺囊毛霉AS313450对甾体化合物烯睾丙内酯进行微生物转化得到C11a-羟基烯睾丙内酯，转化率为53%。占纪勋等[20]用用两株真菌(刺囊毛霉AS31345 0、刺孢小克银汉霉AS 31340 0) 和一株细菌(普通变形菌AS 11120 8) 对红豆杉愈伤组织中紫杉烷类成分sinenxan A进行生物转化，得到三个转化产物分别为10-去乙酰2--sinenxan A1，6a-羟基-10-去乙酰sinenxan A2，9a-羟基-10-去乙酰sinenxan A3，表明Sinenxan A 易被微生物转化，10位乙酰基化学性质比活泼。

张传会等[21]用黑曲霉YM33182(Aspergillusniger)对黄山药进行生物转化，分离得到了原植物体中不存在的化合物薯蓣皂甙元-a-L 鼠李糖(1→4) –β-D葡萄糖甙(prosapogenin B)。程东庆等[22]用用红曲霉菌(M.purureus went)对姜黄素进行微生物转化，得到的产物为6个姜黄素衍生物单体，它们对低密度脂蛋白氧化修饰的抑制作用，为进一步筛选新型高效的姜黄素类抗动脉硬化新药奠定基础。NING L L等[23]从31株微生物中筛选出短刺小克银汉霉Cunninghamella blakesleana AS3.970对雷公藤内酯进行微生物转化，得到7个产物，其中4个为新化合物，且都具有对人肿瘤细胞株的细胞毒效应。占纪勋等[24]用华根霉和雅致小克银汉霉转化青蒿素，得到去氧青蒿素、3a -羟基去氧青蒿素和9β-羟基青蒿素，其中9β-羟基青蒿素为新化合物；占纪勋等还利用其它的微生物对青蒿素进行生物转化研究，得到4个产物，分别为10β-羟基青蒿素、去氧青蒿素、9β-羟基青蒿素及3β-羟基青蒿素，其中1和4均为新化合物。并用体外培养的人恶性疟原虫FCC1/HN株，测定青蒿素及这几个产物的抗疟效应，结果4个转化产物的抗疟活性比青蒿素均有不同程度的降低，其中10β-羟基青蒿素活性较好[25]。朱宏莉等[26]以对羟基苯甲醛为底物，采用静息细胞转化法并结合TLC和HPLC分析，从几十株霉菌和细菌中筛选出了一株能够转化合成天麻素的华根霉(Rhizopus chinensis S taito AS3.1165)。利用微生物对天麻素前体—对羟基苯甲醛进行选择性的还原和糖基化，从而高效率的获得天麻素，此方法的建立为天麻素的合成开辟了一条新的途径，具有较大的经济和社会价值。傅明亮等[27]为实现玄参中特征成分哈巴俄苷和肉桂酸的高效转化，利用微生物体外转化的方法，通过高效液相色谱方法对哈巴俄苷和肉桂酸进行检测，重点考察了各种微生物对玄参转化的效果，筛选出了能高效转化玄参中特征成分的菌株酿酒酵母和未知曲霉ZJU能较好地对玄参中特征成分进行转化，它们对哈巴俄苷的转化增值率分别达到了46.67%和45.25%。茅燕勇等[28]用赭曲霉NG0216 固定化细胞的催化转化的方法合成了坎利酮的11a-羟基化合物，转化率为85%，提高了转化产率。

1.2.2齐墩果酸结构改造研究进展

齐墩果酸是一种五环三萜类化合物，化学名为(3β)-3-Hydroxyolean-12-en-28-oic acid。为白色结晶性粉末，无臭，无味，不溶于水，可溶于乙醇、氯仿、丙酮。熔点310℃，[a] + 79.5，(氯仿中) [29]其基本碳骨架为多氢蒎的五环母核，环的构型为A/B环，B/C环，C/D环均为反式环，而D/E为顺式环。母核上有8个甲基，其中C-10，8，17均为β-型，C-14为a-型，C-4和C-20各有两个甲基，C-3羟基，C-28羧基。因为其结构复杂，难以进行全化学合成，植物提取成为其唯一来源。为了改变其生物活性弱，水溶性差等问题。许多人对其进行了结构改造方面的研究。2003年陈莉等[30]用丙酮作溶剂，三乙胺为除酸剂，溴代烷与OA反应可成功地制备3-