第十章 园艺植物遗传转化1

第二节 园艺植物遗传转化方法
2）PEG介导遗传转化方法的缺点： 由于建立植物原生质体再生体系比较困难，加 之PEG对原生质体活力的有害作用，因此转化率低，
一般为10-5~10-3。
第二节 园艺植物遗传转化方法
（二）电穿孔转化法
电穿孔转化法，又称电击法或“电注射法”。
Fromm等首次使用该法成功将氯霉素乙酰转移酶cat
第十章 园艺植物遗传转化
园艺植物遗传转化受体系统； 园艺植物遗传转化方法； 园艺植物转化植株的鉴定； 提高处外源基因在园艺植物体内表达水平的策略； 基因沉默技术与基因剔除技术；
外源基因在园艺植物中的遗传
植物遗传转化(plant genetic transformation)
定义: 是应用分子重组技术、细胞组织培养技术或种 质系统转化技术,有目的地将外源基因或DNA片段插入 到受体植物基因组中,并使其在后代植株中得以表达 的过程. 目的: 提高产量,品质和抗性
基因导入玉米原生质体。
电穿孔转化法可用于原生质体的瞬时和稳定
转化，也可用于带壁的植物细胞的遗传转化。
第二节 园艺植物遗传转化方法
1、转化原理
1）原理：利用高压电脉冲作用，在植物细胞膜或原生质体上
造成非对称穿孔，形成瞬间通道，这种通道孔径在8.4mm左右，
每个细胞膜上有上百个，因此能允许外源基因的进入； 2）电穿孔法分为两类：高压短时程法 低压长时程法 选择何种方法应依据细胞种类和实验条件而定。一般用低压 长时程法可以使其达到较快的修复，从而得到较多的瞬时表 达产物。不过，高压短时程法可以得到较高的DNA整合率。
第一节 园艺植物遗传转化受体系统
与其他受体系统相比生殖受体系统具有以下优点： 1）以具有全能性的生殖细胞直接为受体细胞，具有更强的接
受外源DNA的潜能
2）受体细胞是单倍体细胞，转化的细胞无显隐性的影响，能 是基因充分表达，有利于性状的选育。单倍体植株通过加倍 后即可成为纯和的二倍体纯系，大大缩短了复杂的选育纯化 的过程
(2)较高的遗传稳定性
园艺植物遗传转化是有目的地将外源基因导入植物并使其 整合、表达和遗传，从而达到修饰原有植物的遗传物质、改造 不良农艺性状的目的。这就要求植物受体系统在接受外源DNA 后应稳定遗传后代。无性系的变异与组织培养的方法、再生途 径及外植体的基型都有密切关系。
第一节 园艺植物遗传转化受体系统
第二节 园艺植物遗传转化方法
2、转化的基本步骤及其应用
PEG介导的遗传转化一般包含以下步骤：
a）外源目的基因的制备
b）原生质体制备
c）目的基因和原生质体的转化培养
d）转化体的鉴定和再生植物的培养 目前PEG介导的遗传转化法在花椰菜、胡萝卜、向日葵、卡特 兰、柑橘等园艺植物上均有成功的报道。
第二节 园艺植物遗传转化方法
第二节 园艺植物遗传转化方法
2、操作程序及其应用
电穿孔法一般操作程序：
1）制备含目的基因的质粒DNA
2）制备植物原生质体悬浮液或一定处理的植物组织
3）将质粒DNA和原生质体悬浮液混合后置于200~600V/cm的电
场中处理若干秒
4）原生质体培养和转化子筛选
5）再生植物鉴定与培养
第二节 园艺植物遗传转化方法
3）利用植物自身的授粉过程进行遗传转化，操作方便、简单。
局限性：生殖受体系统受季节限制，只能在短暂的开花期进 行。
第二节 园艺植物遗传转化方法
园艺植物的遗传转化方法大体上分为3类： 1）外源裸露基因的直接导入法：指通过物理或化学的方法 直接将外源目的基因导入植物基因组中，其中 物理方法包括：电穿孔转化法、基因枪转化法、激光微束空 孔转化法、体内注射法、超声波法等； 化学方法包括：PEG和脂质体介导转化法等； 2）载体介导的转化法：指通过将目的基因连接在植物载体 上，随着载体DNA的转移而将外源目的基因整合到植物基因 中的方法。该方法主要包括农杆菌介导和病毒介导的转化法；
第二节 园艺植物遗传转化方法
1、转化原理
（1）特性：PEG是一种水溶性的细胞融合剂和渗透剂，相对
分子质量为1500~6000，pH4.6~4.8，因聚合程度不同而异。
（2）转化原理：PEG不仅可以使细胞膜之间或使DNA与膜形成
分子桥，促成相互间的接触和粘连，而且可以改变细胞膜的
表面电荷，干扰细胞间的作用，从而改变细胞膜的通透性，
后通过细胞和组织培养技术，再生出新的植物类型的技术。
第二节 园艺植物遗传转化方法
2、基本步骤及其应用 基因枪遗传转化的基本步骤包括：
1）受体细胞或组织的准备和预处理
2）DNA微弹的制备 3）受体材料的轰击 4）轰击后外植体的培养和筛选 目前，基因枪法分别在桃、番木瓜、蔓越橘、玫瑰、杜鹃、剑 兰、大蒜、生菜、荔枝等园艺植物上成功实现了目的基因的转 化
(3)稳定的外植体来源
遗传转化的频率低，需要反复的实验，所以要建立一
个高产的组织培养再生系统并能用于遗传转化，需要大量
的、稳定的外植体作为材料。 转化的外植体一般采用无菌实生苗的子叶、胚轴、幼 叶等，或采用可进行快速繁殖的材料
第一节 园艺植物遗传转化受体系统
(4)对抗生素的敏感性
为了抑制农杆菌的过度生长而产生污染，选择、 筛选转化的细胞核植株，在遗传转化中常使用两类 抗生素： 1）选择性抗生素：在遗传转化中用于筛选转化体，如 卡那霉素、潮霉素 2）抑菌性抗生素：在受体材料与农杆菌共培养一定时 间后用于抑制农杆菌的生长 ，防止细菌过度生长而
第一节 园艺植物遗传转化受体系统
利用生殖细胞进行遗传转化，主要有两种途径：
1）利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养，诱
导出胚性细胞或愈伤组织细胞，进一步分化发育成单倍体植
株，从而建立单倍体的基因转化受体系统
2）直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管
导入法、花粉粒浸泡法、子房注射法等
3）靶受体类型广泛不受基因型的限制，能转化所有具有分省潜 力的植物的任何组织或细胞，包括原生质体、根、叶以及种子 的胚、子叶、分生组织、愈伤组织、花粉、子房等；
第二节 园艺植物遗传转化方法
4）可将外源基因导入线粒体、叶绿体等植物细胞的细胞器，重 复性好，获得外源基因能稳定表达的转基因株系，这是目前质 体转化研究中最常用和最有效的DNA导入方法。
产生污染。这类抗生素要求对植物细胞无毒害作用
或毒害作用较小，不影响植物细胞的正常生长，如 氨苄青霉素、羧苄青霉素、头孢霉素等
第一节 园艺植物遗传转化受体系统
(5)对农杆菌侵染的敏感性
1）农杆菌介导的 遗传转化体系需要受体材料是农杆菌的 天然寄主，否则难以实现遗传转化 2）农杆菌Ti或Ri质粒是植物遗传转化的有效载体系统，但 其宿主范围局限于部分双子叶植物，对大部分单子叶植 物和裸子植物不敏感，不同植物，同一植物的不同组织 细胞对农杆菌的敏感性也有很大差
1）电穿孔法的优点：操作简便、转化率较高，特别适合于瞬
时表达研究
2）电穿孔法的缺点：必须经过原生质体培养、易造成原生质
体损伤，使其再生率降低
3）若将电穿孔法与PEG转化法。脂质体法和激光微束法等技
术结合使用，电穿孔法的转化率可大大提高，最高可达1.2%。
第二节 园艺植物遗传转化方法
（三）基因枪转化法
基因枪转化法又称微弹轰击法，是植物遗传转化较常用
的方法之一，转化率较高，一般为10-3~10-2，但不同物种组
织转化率差异很大，最高的可达2.0%，最差的低于10-4。 1、转化原理 基因枪法是利用火药爆炸、高压气体和高压放电作为驱 动力，将包裹有生物活性DNA的金属小颗粒加速，高速轰击植
物组织或细胞，使外源基因实现穿壁并导入受体细胞中，然
第一节 园艺植物遗传转化受体系统
原生质体转化受体系统的局限性： a）原生质体培养周期长、难度大、再生频率低 b）许多园艺植物原生质体培养的技术尚未成熟
第一节 园艺植物遗传转化受体系统
（3）生殖细胞受体系统
定义：利用植物自身的生殖过程，以生殖细胞
如花粉粒、卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统 称为生殖细胞受体系统，也称为种质系统。
第二节 园艺植物遗传转化方法
3、优缺点 基因枪转化法具有下列优点： 1）无宿主限制，特别适宜那些由原生质体再生植株较为困难和 对农杆菌感染不敏感的单子叶植物，提高了单子叶植物的转化 效率；
2）操作简单，可控程度高，可以根据实验的需要调控微弹的速 度和摄入浓度，命中特定层次的细胞，提高遗传转化效率；
第一节 园艺植物遗传转化受体系统
（2）原生质体受体系统
原生质体转化受体系统的优点：
a）原生质体无细胞壁，能够直接高效的摄取外源DNA或遗传
物质
b）通过原生质体培养，细胞分裂可形成基因型一致的细胞克 隆，无嵌合性愈伤组织，由其再生的转基因植株无嵌合性 c）原生质体转化受体系统易于在相对均匀和稳定的同等控制 条件下进行准确的转化和嵌合 d）适用于各种转化系统
诱导原生质体摄取外源基因DNA。
第二节 园艺植物遗传转化方法
（3）干扰因素：PEG浓度、分子大小、二价阳离子、溶液
pH大小
在二价阳离子如磷酸钙的公共作用下，PEG能使外源
DNA沉积在原生质体膜表面，并促进细胞对沉积的DNA进行
主动吸收，从而加快实现外源DNA进入受体细胞； 高pH也可诱导外源DNA分子的吸收，因而PEG介导转化 时常将溶液pH调到8.0左右。
1、组织受体系统 2、原生质体受体系统 3、生殖细胞受体系统
第一节 园艺植物遗传转化受体系统
（1）组织受体系统
定义：利用园艺植物的叶片、幼茎、子叶、胚轴等外
植体培养获得再生植株的受体系统为组织受体系统。
组织受体系统是园艺植物遗传转化适用最多的受体系统，
目前已成功建立的组织受体系统有百合花器、地上茎、茎 尖、叶片、鳞片叶、珠芽，菊花叶片，葡萄叶片，下胚轴， 柑橘成年茎段，马铃薯试管薯切片，试管苗茎段，生菜叶 盘，辣椒下胚轴等。