2008人转化生长因子_1基因克隆_测序及真核表达载体的构建[1]
转化生长因子β1基因克隆及重组真核表达质粒的构建
．
d
c
lo
n e s e
p D N A 4 0 p la
id
v e c
to r
T h e in
d in to th e pG E M T r t in g DN A se que n c pr
e s s
v e c to r a n e s w e r e
，
d id e
ly
i n tif e d
v
．
tr
a n s
，
fe
r
to
s
tu
．
dy th e
一 一
e
ffe
c
t o f a e x o ge n o u
s
ge io
n
n e
o n
c e
lls is
a
c o m m o n
ly
u s e
d t e c h n iq u
re n
e
fo
r m o
le
c u
la
r
b io lo g y
，
D e p a r tm
．
d by P C R
T he
TGF
3 11
ge
a s
s u
b c lo
n e
po ly m d in to
M
a s te r
C h ie f
t
phy s ic ia n D e p a r tm e
n t o
f
，
a n a
，
z e
M A IN O UT CO M E M E A S UR E S
R E S UL T S
人胰岛素样生长因子_1基因的克隆及其表达_吴岚晓
人胰岛素样生长因子-1基因的克隆及其表达吴岚晓1,李明2,王萍2,陈白虹2(1.第一军医大学珠江医院血液科,广东广州510282;2.第一军医大学热带病研究室,广东广州510515)摘要:目的获得大量高纯度、具有生物学活性的人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1),构建hIGF-1原核表达载体,并进行表达与纯化。
方法以pUCIGF质粒为模板,PCR扩增了hIGF-1基因。
经适当酶切后,构建表达载体pRSE T-IGF,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,并经阴离子交换色谱、疏水色谱和凝胶过滤纯化。
结果带有重组质粒p RSE T-IGF的大肠杆菌经IPTG诱导后,以可溶性形式表达7.8kD大小的蛋白,其表达量占菌体总蛋白量的10%~20%,纯化后目的蛋白纯度达95%以上,Western印迹表明重组蛋白具有hIGF-1抗原活性。
结论构建了pRSE T-IGF重组质粒,并成功地在大肠杆菌中获得可溶性表达,为获得大量基因工程产品奠定了基础。
关键词:胰岛素样生长因子-1;基因克隆;原核表达中图分类号:Q78;R977.15文献标识码:A文章编号:1005-1678(2002)01-0001-03C loning and expression of human insulin-like growth factor-1gene in E.coliW U Lan-xiao1,LI Ming2,WANG Ping2,C HE N Ba-i hong2(1.Department o f Hematology,Zhujiang Hos pital,First Military Medical U niversity,Guangzhou510218, China;2.Department o f Tro pical Disease,First Military Medical University,Guangzhou510515,China)Abstract:Purpose The aim is to get sufficient quantity of pure biologically human Insulin-like growth facto-r1(hIGF-1),and hIGF-1e xpression vector was constructed and expressed in E.coli.Methods The hIGF-1DNA fragment was obtained from the pUCIGF plasmid by PCR amplification.After being digested by restriction enzyme,the DNA fragment was cloned into a prokaryotic expression vector pRSE T B and hIGF-1ex-pression vector pRSE T-IGF was constructed.After it was expressed in the host cells E.coli B L21(DE3),the recombinant protein was purified by anion chromatography,hydrophobic chromatography and gel filtration.Re-sults SDS-PAGE analysis suggested the bacteria c ontaining the recombinant plasmid produced a protein of7.8 kD as induced by IPTG.The recombinant hIGF-1was expressed in soluble form,consisting of10%~20%of the total bacterial proteins.After purification,the target protein could be purified up to95%.Western blot indicated that the protein could react with antibodies a gainst hI GF-1.Conclusion The results demonstrate that hIGF-1e xpression vector has been successfully constructed and could be expressed in soluble form in E.coli.Key words:I GF-1;gene cloning;prokaryotic expression胰岛素样生长因子-1(Insulin-like gro wth factor-1, I GF-1)是一种多功能内分泌调控细胞因子,因在结构上与胰岛素原具有高度的同源性而得名。
人谷氧还蛋白1基因克隆及真核表达载体的构建
Ｃｌ ｎ ｎ ｆｈ ｌ ｎ ｅ ｅ ｇｕ ａ ｅ ｘ ｎｌ ａ ｄ ｏ ｓｒ ｃ ｉｎ ｆｉｓ ｅ ｋ ｒ ｏ ｉ ｘ ｅ ｓｏ ｖ ｃ ｏ ｏ ｉ ｇ ｏ ｕ ｎａ ｇ ｎ ｌ ｔ ｒ ｄｏ ｉ ｎ ｃ ｎ ｔｕ ｔｏ ｏ ｔ ｕ ａ ｙ ｔ ｅ ｐｒ ｓ ｉｎ ｅ ｔ ｒ ｃ
ｉ ｕ ａ ｏｅ ｅｐｅｓ ｎ ｖｃ ｒｐＤ Ａ ． （ ）Ｇｘ ． ｅ ｏ ｓ ＴｔｌＲ Ａ Ｗ Ｓｅｔ ｃ ｄ ｆ ｍ Ｅ Ｖ ０ ｔ ｅｋｒ ｔ ｘｒ ｉ ｅｔ ｃ Ｎ ３ １ ＋ ． ｒ１ Ｍ ｔ ｄ ｏ Ｎ ａ ｘ ａｔ ｒ Ｃ ３４ ｓ ｙｉ ｓｏ ｏ ｈ ａ ｒ ｅ ｏ
ｆ ｇ ｅ ｔ ｆ ｃ Ｎ ３ １ ＋）Ｗ Ｓｄｇｓ ｄｗｔ ｏｂｅｅｚｍ ｎ ｅｐｒ ｅ ＴＰ Ｒ ｐ ｄ ｃ ｅ ｇｔ ｒ ｍ ｎ Ｄ Ａ ．（ ａ ｏｐ ａ ｉ ｔ ｉ ｄｕｌ－ ｙ ｅａ ｄｔ ｕｉ ｄ Ｒ －Ｃ ｒ ｕｔ ｗ ｒ ｌ ａ ｄ ｅｅ ｈ ｎ ｈ ｉ ｆ ｏ ｓ ｅ３４ ５
第 ５期
哈 尔 滨 医科 大学 学报
Ｊ ＯＵＲＮＡＬ Ｏ Ｆ ＨＡＲＢＩ ＭＥＤＩ Ｌ ＵＮＩ Ｎ ＣＡ ＶＥＲ Ｉ ＳＴＹ
Ｖ０ ． ０． ｏ． １４ Ｎ ５ Ｏｃ ． ２ Ｏ ｔ ，Ｏ ６
２Ｏ Ｏ ６年 １ ０月
［ 摘要］ 日的 从 Ｅ Ｖ ０ Ｃ ３４细胞 中克 隆谷氧 还蛋 白 １ｇ ｔ ｅｏｉｌ Ｇｘ ） ｅ Ｎ （ｌａ ｄｘ ， ｒ１的 Ｄ Ａ序 列并 构建 真核 表 达载体 ｐＤ ｕｒ ｎ ｃ．
Ｎ ３ １ ＋）Ｇｘ。 方 法 利 用 Ｔｉ ｌ 步 法 从 Ｅ Ｖ ０ 胞 中 提 取 总 Ｒ Ａ， 用 Ｒ －Ｃ Ａ ．（ ． ｒｌ ｒ ｏ一 ｚ Ｃ ３４细 Ｎ 采 ＴＰ Ｒ技 术 从 中 获 得 Ｇｘ 的 ｃ ． ｒｌ Ｄ
人胰岛素样生长因子-1基因克隆及其真核表达载体的构建
Ｋｏ ａ ｅ ｕ ｎ ｅｗａ ｂａｎ ｄ ｂ ｍｐｉｃ ｔ ｎ ａ ｄ ｔ ｅｐ — ｅ ／ ｌ － ｕ ａ ｙ ｔ ｘ ｒｓｉｎ ｖ ｃｏ ｓ ｓ ｃｅ ｓｕｌ ｏ — ｚｋ ｓ ｑ ｅ ｃ ｓｏ ｔｉｅ ｙ ａ ｌ ｉａｉ ｎ ｈ ＣＩ ｏ ｈＧＦ １ｅ ｋ ｒｏ ｉ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｅｔ ｒｗａ ｕ ｃｓ ｆｌ ｃ ｎ＿ ｆ ｏ — ｎ ｃ ｙ
胰 岛素 样 生 长 因 子一 （ｎ ｕｉ ｌ ｅｇｏ ｈ ｆｃ ｒ １ ｉｓ ｌ ｉ ｒｗｔ ａｔ 一 ｎ ｋ ｏ
１ Ｉ 一） 有促 进生 长 发 育 、 质代 谢 和 细胞 分化 与 ， ＧＦ１具 物
增殖 等 功 能 ｌ 。近 年 来 研 究 显 示 ， 尿 病 患 者 血 清 １ ］ 糖 ＩＦ Ｉ Ｇ － 水平 降低 ， 与血 糖 的 控 制水 平 呈 明显 负 相 关 。 并
最 近一项研 究ｌ 表 明 ， ２ ］ 低浓 度 的 Ｉ Ｆ １ ４ Ｇ 一 在 ～５年 间增
参 考 基 因 Ｂ ｎ 登 录 的 Ｉ Ｆ１ Ｄ ａｋ Ｇ－ ｅ ＮＡ 序 列 （ ９４ ．） Ｍ２ ６ ４ １ 进行 设计 ， 由上 海生物 工程有 限公 司合 成 。 其序 列 如 下 ： 游 引 物 序 列 为 ：５＿ ＧＡＡＴ Ｃ Ｃ 上 ， Ｇ Ｔ Ｃ ＡＣ Ｃ ＴＣ Ｔ ＡＧＡＡＧ ＡＡＴＧ ３， 游 引 物 序 列 为 ：５＿ Ｃ Ｇ－ 下 ｆ Ｇ ＴＣ ＡＧ ＡＧＣ ＡＴ Ｔ Ｃ Ｃ Ｃ Ｃ Ｔ ＡＣ Ａ Ｃ ＡＣ ＡＡ ＴＣ ＡＧ－ 分 别 ３ 在上 游引 物 ５ 端 、 游 引 物 ３ 端 引入 Ｅ ｏ 工和 Ｘｂ 下 ｃＲ ａ Ｉ的酶切位 点 （ 划线碱 基 ） 框 内所 示 为 Ｋｏａ 列 ， 下 ， ｚｋ序
（ 承德 医学 院基 础 医学 研 究 所 ，承德 ０７０） ６ ００
人转化生长因子-β1基因克隆、测序及真核表达载体的构建
要 ］ 目的： 克隆人转化 生长因子 一ｐ （ Ｇ ３） 。 Ｔ Ｆ一１ 基因编码 区 ｃ Ｎ Ｄ Ａ序列 ， 构建并鉴定 Ｔ Ｆ—ｐ 真核 表达载体 。方 法 ： Ｇ 。
设计含有 Ｅ ｏ 和 Ｘ ｏ Ｉ ｃＲ Ｉ ｈｌ 酶切位点的 Ｔ Ｆ—Ｂｃ Ｎ Ｇ 。Ｄ Ａ引物 ， 利用逆转 录聚合酶链反应 （ Ｔ—Ｐ Ｒ） ， Ｒ Ｃ 法 以人 白细胞 ｍ Ｎ Ｒ Ａ为模 版 ，
样本结果分别与参考检测系统测定结 果进行 Ｕ检 验 ， Ｐ均 ＞
００ ， 异 无 统 计 学 意 义 。 而 以 国 产 试 剂 为 基 础 建 立 的 ２个 ．５ 差
检测 系统间血清 Ｃ Ｅ检 测结果 可 比性 还要优 于 与参考 系 统 Ｈ
间的比较 ， 且精密度 Ｃ ％ ＜ ％ 。 Ｖ ５
Ａ ｐｒｖｄｇｉｌ ｅ Ｓ ．Ｎ Ｃ Ｓ Ｅ ９一Ａ，９５ ｐｏｏｅ ｔ ｉ ［ ］ Ｃ Ｌ ，Ｐ ｌ ｎ ｄ １９ ．
［ ］ 冯仁峰． ３ 临床 检验管 理技术 基础 ［ ． Ｍ］ 上海 ： 上海 科学
文 献 出版 社 ，０３ ５一ｌ． ２０ ： １
题 。标 准化 、 系统化 及溯源性对加强质 量管理 ， 高临床检 验 提
由此可见 ， 并非 只有 原装 试剂才 能够保 证检 测结果 的 准 确性 。只要在选择试 剂前做 好详 细 的论证 与评 估 ， 使用 国产
试剂在保证测定结果准确的基础 上还 能有 效的降低成本 。
４ 参 考文 献
３ 讨 论
［ ］ 付文金 ， １ 彭兰芬． 自建与配套检 测系统生化结 果一致性 探讨 ［ ］ 检验 医学 ，０ ７ ２ （ ） ４２ Ｊ． ２ ０ ，２ ４ ：０ ． ［ ２］
表 １ 国产 Ｃ ＨＥ精 街度分 析
人类TAP1基因克隆及表达载体的构建
文章编号:1007-8738(2004)01-0053-02人类T AP1基因克隆及表达载体的构建刘 玉1,李殿俊1,吕雪莹1,杨秋霞1,谷金宇2,王 兰1(哈尔滨医科大学:1免疫学教研室,2附属二院普外科,黑龙江哈尔滨150086)收稿日期:2003-06-16; 修回日期:2003-09-05基金项目:黑龙江省自然科学基金资助课题(No.D0122)作者简介:刘 玉(19762),女,黑龙江五大连池人,助教,硕士生.Tel :(0451)86674566;Email :christineliuyu @关键词:TAP1;基因克隆;表达载体的构建;序列分析中图分类号:Q785 文献标识码:A 抗原处理相关转运体(TAP )属于ABC (A TP 2binding cas 2sette )转运体超家族B 亚家族。
人类TAP 基因位于6号染色体上的MHC 2II 类基因区,其编码的TAP1和TAP2分子,分别由748和686个氨基酸残基所组成,两者可形成异源二聚体参与肽类的转运过程,在MHC 2I 类分子介导的抗原递呈途径中起着重要作用[1,2]。
因此,TAP 的异常将严重影响抗原递呈,成为病毒感染及肿瘤细胞逃避免疫监视的重要机制[3],如卵巢癌[4]、肝癌[5]及宫颈癌[6]细胞中TAP1的表达量明显下降。
我们在本实验中,从B 淋巴母细胞系中克隆出TAP1基因,并构建了其表达载体pcDNA3.1/V52His TOPO TA 2TAP1。
1 材料和方法1.1 材料 人类B 2LC L 细胞由本校生物学教研室惠赠。
TRI 2zol 试剂、Therm oscript RT 2PCR system 及P fx DNA 聚合酶,以及pcDNA 3.1/V52H is TOPO T A 载体,均购自Invitrogen 公司。
CONCEPT 凝胶纯化试剂盒购于G ibcoBRL 公司。
MiniBEST 质粒提取试剂盒及特异性T AP1引物购于T a K aRa 公司。
人转化生长因子β1(TGF-β1)ELISA试剂盒说明书
人转化生长因子β1（TGF—β1）ELISA试剂盒说明书产品名称：人转化生长因子β1（TGFβ1）ELISA试剂盒英文名称:TGFβ1 ELISA Kit检测原理：ELISA试剂盒采纳抗体夹心法:将抗某蛋白抗体包被于酶标板上，标本和标准品中的某蛋白与抗体结合，加入生物素化的抗某蛋白抗体，再加入SABC复合物与生物素抗体结合，形成免疫复合物，然后加入TMB显色底物，显色剂显蓝色，最后加停止液变黄色，游离的成分被洗去。
在450 nm处测OD值，某蛋白浓度与OD值之间呈正比，可通过绘制标准曲线计算出标本中某蛋白的浓度。
试剂盒组分: （保管温度4℃）名称规格（48 T）规格（96 T）预包被酶标板8×6条8×12条1支1支标准品/样品稀释液10ml15ml生物素化检测抗体（100×）60ul120ul生物素化检测抗体稀释液6ml12mlSABC复合物6ml12mlTMB显色液（A/B）各3ml停止液6ml12ml20×浓缩洗涤液30ml60ml封板胶纸2张4张产品说明书1份1份本试剂盒用于血清、血浆、组织匀浆、细胞培育上清液及其它生物体液。
标本收集与试剂准备:1. 血清、血浆样本收集应使用一次性的无热原，无内毒素试管（EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝均可），血清、血浆躲避使用溶血，高血脂标本，标本悬浮物应离心去除，使标本清亮透亮。
待测样本应尽早检测，28℃保管48小时；更长时间须冷冻（20℃或80℃）保管，躲避反复冻融。
2. 洗涤液配置：用蒸馏水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的蒸馏水）3. 标准品配制：取7个1.5ml离心管，分别标注1/2,1/4,1/8,1/16,1/32,1/64，blank。
从第一至七管中分别加入标准品/样品稀释液200ul。
在第一管中加入标准品溶液200ul，置于漩涡混合器上混匀后用加样器吸出200ul，移至第二管。
如此反复作对倍稀释，从第六管中吸出200ul弃去，第七管为空白对比。
人DNA修复基因HOGG1真核表达载体的构建及序列测定(1)(精)
人DNA修复基因HOGG1真核表达载体的构建及序列测定(1)】目的：克隆人HOGG1基因并构建其真核表达载体，进行序列测定. 方法：提取人胎肝总RNA，设计HOGG1特异性引物，通过RTPCR扩增，将HOGG1基因克隆到pCMVMyc载体,菌落PCR鉴定阳性克隆并测序验证. 结果：获得人HOGG1基因全长，并成功构建pCMVMyc/HOGG1真核表达载体. 结论： HOGG1真核表达载体的构建为HOGG1基因生物靶向治疗药物的开发提供一种新的手段.【关键词】遗传载体；HOGG1基因；克隆，分子；DNA修复0引言细胞的有氧代谢过程及其暴露于环境诱变剂时均可产生活性氧(reactive oxygen species, ROS) ［1-2］. 在患病情况下,生物的抗氧化能力有一定限度, 一旦生物体内的氧化应激负荷超过抗氧化系统所承载的极限, ROS便可攻击DNA 造成DNA损伤. 损伤的DNA在再次复制和分裂时可形成突变. DNA突变可激活癌基因或使抑癌基因失活,从而导致细胞生长周期紊乱. DNA氧化损伤产生大量的修饰碱基, 其中8羟基鸟嘌呤（8oxoG）能高度致突变性损伤. 鉴于此，研究者把它用作肿瘤发生过程中氧化损伤的敏感标志物［3］. HOGG1基因编码的hOgg1 蛋白具有DNA 修复功能, 参与8oxoG的切除,从而保护遗传物质不受损伤［4］. 我们采用基因工程的方法, 从人胎肝组织中克隆人HOGG1基因，并构建其真核表达载体，以进一步研究该基因在肿瘤DNA 氧化损伤修复中的作用.1材料和方法1.1材料Trizol(invitrogen公司)；限制性内切酶EcoRI/KpnI(SibEnzyme 公司)；pCMVMyc载体试剂盒(Clonetech公司)； RNA酶抑制剂和 MMLV逆转录酶（Promega公司）；Taq酶、DH5α感受态细菌、凝胶回收试验盒、所有寡核苷酸和引物及克隆测序均由上海申能博彩公司提供. 其他试剂为通用高纯试剂. DNA扩增采用PE9600扩增仪.1.2方法1.2.1RTPCR扩增HOGG1基因取来自于意外流产的100 mg人胎肝组织,在液氮中研磨至粉末状，加入1 mL Trizol，按产品提供的操作手册抽提总RNA. 紫外吸收测定法检测RNA浓度和纯度，使A260 nm/A280 nm比值在1.8～2.1之间. 变性琼脂糖凝胶电泳, 紫外透射光下观察并拍照. 在2 mg总RNA中，加入DEPCH2O，使总体积为8 mL，加入0.5 mL RNA酶抑制剂、 2 mL oligo(dT) 引物、400 U MMLV RT逆转录合成cDNA第一链，逆转录反应为37℃ 1 h，90℃ 5 min，冰上冷却，室温高速离心5 s. 将cDNA溶液储存于-20℃备用. 参考GenBank登录的HOGG1基因的cDNA序列 (NM_016820.2)设计扩增HOGG1全长的引物. 上游引物序列为F(Eco RI)：5′AGAGAATTCGGATGCCTGCCCGCGCGCTTCTG3′，上游引物从起始密码子ATG开始. R(KpnI)下游引物序列为：5′TTTCTGGTACCGATAAAACCATCCTTAGCG 3′，终止于终止密码子TGA，即该序列中的TCA. 分别在上游引物5′，下游引物3′端引入EcoRI和KpnI的酶切位点，目的是为了克隆到真核表达载体pCMVMyc对应的位点中. 预期扩增产物长度为1233 bp. PCR反应体系50 μL： 25 mmol/L的PCR特异引物各1 μL ，Taq聚合酶0.5 μL， dNTP混合液0.5 μL，cDNA 2 μL. 扩增条件：94℃变性5 min,94℃ 30 s, 55℃ 40 s，72℃ 40 s，35个循环后，72 ℃延伸10 min. PCR扩增产物用12 g/L琼脂糖电泳，胶回收试剂盒回收目的条带.1.2.2HOGG1基因真核表达载体的构建及鉴定PCR扩增产物用EcoRI和KpnI 双酶切2 h，凝胶回收试剂盒回收DNA，该片段与同样双酶切回收后的pCMVMyc 载体连接，转化宿主E.coli DH5a感受态细胞（氯化钙法），挑取单克隆白色菌落筛选重组质粒. 重组克隆用克隆PCR方法鉴定，鉴定引物为载体测序引物CMVF和扩增HOGG1的下游引物，扩增条件同上,扩增产物大小正确的克隆，用含氨苄青霉素(100 mg/L)的LB培养，用质粒制备试剂盒制备质粒，阳性用于序列测定.2结果2.2.1HOGG1基因扩增成功地扩增出全长的HOGG1基因. 图1为RTPCR的扩增产物，电泳可见1200 bp左右的扩增条带，与预计的大小基本吻合.2.2.2构建HOGG1基因真核表达载体通过RTPCR扩增HOGG1获得PCR产物，经过胶回收酶切产物，回收直接克隆到pCMVmyc载体对应的位点，转化大肠杆菌. 通过菌落PCR方法，初步筛选出重组克隆（图2）. 随机挑选出5个克隆，其中一克隆（泳道1），与其他4个克隆（泳道25）相比,插入片段偏小,没有做进一步分析. 泳道2～5共4个克隆插入大小一致，经过测序分析，结果表明这4个克隆的插入片段为HOGG1基因. 通过序列分析和比较部分克隆的序列与预计的不同，泳道5对应的序列与Genbank公布的序列相同.2.2.3序列测定05TH1CMVF测序报告表明，在该报告中显示pCMVMYC载体的部分序列，酶切位点EcoRI GAATTC, 启动密码子ATG和HOGG1 基因N端的部分序列. 采用ABI377 序列分析仪分析插入片段的序列,阳性克隆进一步测序结果表明，05TH1CMVF；51TH1G6509；52TH1CMVR 拼接为HOGG1全序列（图3）.M： marker； HOGG1： HOGG1基因.作者：魏永长，南克俊，惠凌云，贺大林【关键词】遗传载体；HOGG1基因；克隆,分子；DNA修复Construction and sequen本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。
生物制药技术中的生长因子的表达与纯化方法详解
生物制药技术中的生长因子的表达与纯化方法详解在生物制药技术中，生长因子是一类可以促进细胞增殖、分化和发育的蛋白质信号分子。
它们在医药领域具有广泛的应用，常被用于治疗癌症、遗传性疾病和退行性疾病等。
为了获得高纯度的生长因子，生物制药技术中采用了一系列的表达和纯化方法。
本文将详细介绍生物制药技术中生长因子的表达与纯化方法。
生长因子的表达是指将相关基因导入到宿主细胞中，通过转录和翻译过程使基因表达为具有生物活性的蛋白质。
表达方法主要有原核表达和真核表达两种。
原核表达是将生长因子基因克隆到大肠杆菌等细菌的表达载体中，通过转化、培养和诱导等步骤使基因表达为目标蛋白。
在原核表达中，由于基因表达系统简单、成本较低且表达量较高，常被用于小规模的试验和研究。
然而，细菌中的表达系统无法正确翻译和修饰复杂的生长因子，因此并不适用于大规模生产。
真核表达是将生长因子基因克隆到真核细胞（如哺乳动物细胞）的表达载体中，通过转染、培养和诱导等步骤实现基因表达。
相比于原核表达，真核表达能够保留生长因子的天然结构和生物活性，因此更适用于大规模生产。
近年来，重组DNA技术的发展使得真核表达系统的建立更加高效，同时也提高了纯化效率。
表达获得的生长因子需要经过纯化才能得到高纯度的蛋白质。
生长因子的纯化方法一般包括以下几个步骤：细胞破碎、先导蛋白的去除、拟静态层析、亲和层析和尺寸排除层析。
细胞破碎是将表达获得的细胞打破，释放出蛋白质。
常用的方法有机械破碎、超声波破碎和高压破碎等。
破碎后的细胞溶液包含了大量的其他蛋白质和杂质，需要进行进一步的纯化。
先导蛋白的去除是为了排除掉无法识别的非生长因子蛋白质。
一般采用的方法是利用具有亲和性的纯化材料（如亲和树脂或金属螯合材料）结合标签或结构域与生长因子结合，以实现生长因子的分离和纯化。
拟静态层析是利用柱层析将目标蛋白与其他蛋白质分离。
常用的方法有离子交换层析、亲和层析和蛋白A/G层析等。
通过对样品的特定性质进行调整，可以实现目标蛋白质的选择性结合和洗脱。
人转化生长因子β1TGF
人转化生长因子β1（TGF-β1）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中转化生长因子β1（TGF-β1）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人转化生长因子β1（TGF-β1）水平。
用纯化的人转化生长因子β1（TGF-β1）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中加入转化生长因子β1（TGF-β1），再与HRP标记的转化生长因子β1（TGF-β1）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的转化生长因子β1（TGF-β1）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人转化生长因子β1（TGF-β1）的含量。
样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
人干细胞生长因子cDNA克隆、表达和纯化及其造血种属特异性
人干细胞生长因子cDNA克隆、表达和纯化及其造血种属特异性【摘要】人干细胞生长因子（human stem cell growth factor，hSCGF）是一种早期造血调控因子。
已知人干细胞生长因子具有两种形式，包括全长分子hSCGF以及在Ca2+依赖糖识别结构域（calcium-dependent carbohydrate recognition domain，CRD）内缺失78氨基酸的截短型分子hSCGFβ。
hSCGFβ的造血刺激活性具有严格的种属特异性。
本研究目的在于探讨hSCGF能否协同刺激小鼠粒/单系祖细胞增殖。
为克服hSCGF的cDNA GC含量较高的困难，本研究以两步PCR的方法从人胎肝cDNA文库（Clontech）中成功克隆hSCGF cDNA，进而将hSCGF成熟肽编码序列亚克隆于原核表达载体pGEX4T-2中，融合表达。
研究结果表明，通过低温诱导（28℃），重组表达产物主要以可溶蛋白的形式存在于裂解上清中，利用亲和层析纯化融合表达蛋白。
对重组蛋白的造血刺激活性分析表明，不同于截短型分子hSCGFβ，全长分子hSCGF能够刺激小鼠骨髓粒/单系造血祖细胞增殖。
结论： hSCGF CRD不直接结合受体，可能具有其他生物学功能。
【关键词】 cDNA克隆Cloning，Expression and Purification of Human Stem Cell Growth Factor cDNA and Its Species-specificity in HematopoiesisAbstract Stem cell growth factor (SCGF) is an early-acting hematopoitic cytokine that has two isoforms including hSCGF with full length molecules and hSCGFβ，78 amino acids of which lost in the conserved calcium-dependent carbohydrate-recognition domain (CRD).It has been demonstrated that hSCGFβ is strictly species-specific inregulating he-matopoiesis.This study was aimed to explore whether human SCGF can exert synergistic stimulatory effect on heterogenous murine CFU-GM progenitor.Firstly，hSCGF cDNA was amplified from human fetal liver cDNA library by using two-step PCR.The hSCGF mature peptide coding sequence was subsequently placed at downstream of glutathione S-transferase (GST) sequence in GST gene fusion expression vector. The results indicated that there existed an additional 60 kD protein compared with mock BL21 when the cells hosting recombinant plasmid were induced with IPTG at 37℃.SDS-PAGE analysis demonstrated that the GST-hSCGF fusion protein mainly existed in insoluble form.When induced at low temperature (28℃)，the recombinant protein was mostly soluble.The GST-fusion recombinant protein was subsequently purified by usingaffinity chromatography.The clonogenic assay revealed that，unlike hSCGFβ，hSCGF had the granulocyte/ macrophage promoting activity (GPA)for murine bone marrow GM progenitor. It is concluded that，in contrast to human SCGFβ，the intact molecular hSCGF may have no species specificity，implying that CRD domain in human SCGFβ does not directly bind to corresponding SCGF receptor，but may have certain biological function.Key words human stem cell growth factor; CRD region; cDNA clone; fusion expression; hematopoietic species specificity细胞因子在造血过程中起到十分重要的调控作用［1，2］。
重组人转化生长因子β1原核表达及多克隆抗体制备
重组人转化生长因子β1原核表达及多克隆抗体制备郭冉;刘洁婷;吴丹;刘海峰;初彦辉【摘要】Purpose To clone human TGF-pl gene and prokaryotic expression of TGF-pl protein through the expression of this gene, and then to get the rabbit-anti-human TGF-pi polyclonal antibody from the immune rabbit with this protein. Methods Using RT-PCR technique to amplified human TGF-pl gene sequence. Then the target gene was cloned into a prokaryotic expression vector pET-28a by using the recombinant DNA technique. After induced by IPTG,the protein TGF-pl was expressed in E. coli BL21 ( DE3) . The protein testified its antigenicity by Western-blot. Next, we immunized New Zealand white rabbits with the obtained recombinant protein as antigen. We collected the immune sera of rabbit. Then purified antibody by ammonium sulfate fractionationthen, the indirect Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the polyclonal antibodies titer. Western-blot techniques were used to identify antibody specificity. Results The encoding sequence and expression vector of TGF-pl was obtained while the interest protein was mainly expressed in the inclusion body. Western-blot detection of the target protein displays antigenicity. The purified rabbit anti-human polyclonal antibodies titer is l:10 000. Conclusion The rabbit anti-human TGF-pi polyclonal antibodies titer is higher and has a better specificity.%目的克隆人转化生长因子β1( TGF-β1)基因,原核表达TGF-β1蛋白,制备兔抗人TGF-β1多克隆抗体.方法应用RT-PCR技术扩增人TGF-β1基因序列,构建pET-28a-TGF-β1重组质粒.转化至E.coliBL21( DE3)中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达.Western-blot检测目的蛋白的抗原性.免疫新西兰白兔,获得兔抗人TGF-β1多克隆抗血清.饱和硫酸铵盐析法纯化多克隆抗体,间接ELISA法检测多克隆抗体效价,Westernblot技术进行抗体特异性检测.结果获得了TGF-β1编码序列和表达载体,目的蛋白主要存在于超声破碎后的包涵体中;经Western-blot检测目的蛋白存在抗原性;获得纯化的兔抗人多克隆抗体效价达1:10 000.结论获得的兔抗人TGF-β1多克隆抗体效价较高,具有良好的特异性.【期刊名称】《中国生化药物杂志》【年(卷),期】2012(033)004【总页数】4页(P354-357)【关键词】转化生长因子β1;抗纤维化;原核表达;多克隆抗体【作者】郭冉;刘洁婷;吴丹;刘海峰;初彦辉【作者单位】牡丹江医学院生理教研室,黑龙江牡丹江157011;牡丹江医学院黑龙江省抗纤维化生物治疗重点实验室,黑龙江牡丹江157011;牡丹江医学院黑龙江省抗纤维化生物治疗重点实验室,黑龙江牡丹江157011;牡丹江医学院黑龙江省抗纤维化生物治疗重点实验室,黑龙江牡丹江157011;牡丹江医学院黑龙江省抗纤维化生物治疗重点实验室,黑龙江牡丹江157011【正文语种】中文【中图分类】Q78转化生长因子β(TGF-β)对瘢痕成纤维细胞的生物学效应起到主要的调控作用并参与瘢痕形成中的调节活动，目前研究最为广泛［1-2］。
人胰岛素样生长因子-1基因的克隆及其表达
人胰岛素样生长因子-1基因的克隆及其表达吴岚晓;李明;王萍;陈白虹【期刊名称】《中国生化药物杂志》【年(卷),期】2002(023)001【摘要】目的获得大量高纯度、具有生物学活性的人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1),构建hIGF-1原核表达载体,并进行表达与纯化.方法以pUCIGF质粒为模板,PCR 扩增了hIGF-1基因.经适当酶切后,构建表达载体pRSET-IGF,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,并经阴离子交换色谱、疏水色谱和凝胶过滤纯化.结果带有重组质粒pRSET-IGF的大肠杆菌经IPTG诱导后,以可溶性形式表达7.8 kD大小的蛋白,其表达量占菌体总蛋白量的10%～20%,纯化后目的蛋白纯度达95%以上,Western印迹表明重组蛋白具有hIGF-1抗原活性.结论构建了pRSET-IGF重组质粒,并成功地在大肠杆菌中获得可溶性表达,为获得大量基因工程产品奠定了基础.【总页数】3页(P1-3)【作者】吴岚晓;李明;王萍;陈白虹【作者单位】第一军医大学,珠江医院,血液科,广东,广州,510282;第一军医大学,热带病研究室,广东,广州,510515;第一军医大学,热带病研究室,广东,广州,510515;第一军医大学,热带病研究室,广东,广州,510515【正文语种】中文【中图分类】Q78;R977.15【相关文献】1.人胰岛素样生长因子Ⅱ基因的克隆与表达 [J], 王保莉;王凤泽;张涌;郭蔼光2.人胰岛素样生长因子-1基因克隆及其真核表达载体的构建 [J], 牛嗣云;岳凤鸣;陈志宏;高维娟;高福禄3.人胰岛素样生长因子-1基因的克隆、表达及生物活性分析 [J], 祁雅慧;王雅梅;孙丽翠;司杨;闫豫东;张静宜;邴国英4.人胰岛素样生长因子-1基因的克隆及在真核细胞的表达 [J], 周海斌;郑祖根;董启榕5.大肠杆菌偏嗜性人胰岛素样生长因子1基因的克隆及表达 [J], 梁东春;左爱军;郭刚;张镜宇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人转化生长因子基因重组克隆及高效表达
人转化生长因子基因重组克隆及高效表达于丽莉;赵涵芳;刘军;章有章【期刊名称】《上海医学》【年(卷),期】2000(23)2【摘要】目的克隆人转化生长因子（ＴＧＦβ１）基因并且在大肠杆菌中表达。
方法从人的血小板中抽提总ＲＮＡ，经逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）得到全长ＴＧＦβ１ｃＤＮＡ，将其克隆于表达质粒ｐＢＬＭＶＬ２中，构建了在ＰＬ启动子控制的含有ＴＧＦβ１ｃＤＮＡ重组子，转化到大肠杆菌ＲＲ１菌株中，进行温敏诱导表达。
结果表达产物经ＳＤＳＰＡＧＥ电泳染色后，显示其相对分子质量为１２．５×１０３，计算机灰度扫描分析，表达产物约占全菌蛋白的２０％左右，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析证实，表达产物为ＴＧＦβ１，细胞实验显示其具有一定的生物活性。
结论在大肠杆菌中表达出具有活性的人ＴＧＦβ１。
这为我们下一步研究其功能和临床应用打下了基础。
【总页数】4页(P84-87)【关键词】TGFβ1;基因工程;基因表达;克隆;烧伤【作者】于丽莉;赵涵芳;刘军;章有章【作者单位】上海第二医科大学生化教研室分子生物学实验室【正文语种】中文【中图分类】R644.02;R394【相关文献】1.人转化生长因子-β1基因克隆、测序及真核表达载体的构建 [J], 金善爱;柴红梅;崔极哲;杨波;吴宏;柳忠辉;张晓光2.人转化生长因子-β1基因克隆、测序及真核表达载体的构建 [J], 金善爱;柴红梅;催极哲;杨波;吴宏;柳忠辉;张晓光3.人转化生长因子β3、结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶抑制剂1基因重组慢病毒多表达质粒的构建及活性检测 [J], 江峰;岳斌;马学晓;张国庆;胡有谷;陈伯华4.人成熟转化生长因子β1蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定 [J], 张建军;王东洋;齐共建;曾令宇;徐开林5.人成熟转化生长因子β1蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定 [J], 张建军; 王东洋; 齐共建; 曾令宇; 徐开林因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
转化生长因子β 1基因克隆及重组真核表达质粒的构建
转化生长因子β 1基因克隆及重组真核表达质粒的构建王义生;王刚;殷力【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2008(012)042【摘要】背景:通过基因转移方法研究某一外源性基因存细胞中的作用是目前分子生物学常用的技术手段,与病毒载体相比,应用pcDNA4.0-TGF.B 1真核表达质粒的转染方法无遗传毒性和细胞毒性,有更高的安全性.目的:通过克隆转化生长因子γβ1基因,观察构建重组转化生长因子β1l基因真核表达质粒的可行性.设计、时间及地点:以细胞为观察对象的体外实验,于2007-03/2008-02在河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室完成.材料:2月龄清洁级健康SD大鼠,雌雄不拘,用于分离细胞中RNA.方法:从大鼠骨髓细胞中分离提取转化生长因子β 1的mRNA,反转录-聚合酶链反应扩增后,克隆入pGEM-T载体,PCR鉴定重组子;酶切下目的基因转化生长因子β1,再亚克隆入载体pcDNA4.0质粒,酶切鉴定亚克隆重组子并进行DNA 序列分析.主要观察指标:TGF-β1cDNA、pGEM-T-TGF-β1和重组子pcDNA4.0-TGF-β1的表达.结果:经过反转录-聚合酶链反应扩增得到TGF-β1 cDNA条带;PCR 扩增鉴定得到pGEM-T-TGF-β1.酶切鉴定得到亚克隆重组子pcDNA4.0-TGF-β1,经测序鉴定证实插入DNA序列与设计完全一致.结论:成功克隆大鼠转化生长因子β1基因,并构建出重组转化生长因子β1真核表达载体.【总页数】4页(P8255-8258)【作者】王义生;王刚;殷力【作者单位】郑州大学第一附属医院骨科,河南省高等学校临床学重点学科开放实验室,河南省郑州市,450052;郑州大学第一附属医院骨科,河南省高等学校临床学重点学科开放实验室,河南省郑州市,450052;郑州大学第一附属医院骨科,河南省高等学校临床学重点学科开放实验室,河南省郑州市,450052【正文语种】中文【中图分类】R392【相关文献】1.Marc-145细胞CD163基因克隆及其真核表达质粒构建 [J], 曹宗喜;焦培荣;林哲敏;于俊勇;吴欣伟;张桂红2.鸡PTH基因克隆、序列测定及其真核表达质粒的构建 [J], 章世元;俞路;王雅倩;刘波;李治学;周联高;严桂芹;汪益峰;林显华3.结核分枝杆菌Ag85B基因克隆及真核表达质粒pIRES-Ag85B的构建 [J], 吴汉霞;唐小龙4.结核分枝杆菌Ag85B基因克隆及真核表达质粒pIRES-Ag85B的构建 [J], 吴汉霞;张荣波;唐小龙5.Mfn2基因克隆及pEGFPmfn2真核表达质粒的构建 [J], 席少静;何军;滕艳萍;王晓婕;范倩因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
胰岛素样生长因子-1基因原核表达载体的构建及表达蛋白的生物学活性
胰岛素样生长因子-1基因原核表达载体的构建及表达蛋白的生物学活性曹传平;陈晓虹;吴建国;商阿丽;虞慧华;康五朋;郑玲莉;张敬;鞠佃文【期刊名称】《中国生物制品学杂志》【年(卷),期】2008(21)10【摘要】目的构建人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)基因原核表达载体,并检测表达的重组人IGF-1(rhIGF-1)蛋白的生物学活性。
方法以pUC57-hIGF-1质粒为模板,PCR扩增hIGF-1基因,克隆入pTEtrans载体,进行DNA序列分析后,亚克隆入表达载体pTE,转化大肠杆菌W3110,进行诱导表达,表达产物经阳离子交换层析和凝胶过滤层析纯化,并进行Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析。
MTT法检测rhIGF-1促MCF-7细胞的增殖作用。
结果转化质粒pTE-hIGF-1的大肠杆菌经诱导后,以可溶性形式表达相对分子质量约为7700的目的蛋白,表达量约占菌体总蛋白的8%。
Western blot证实该蛋白具有良好的反应原性,Tricine-SDS-PAGE证实纯度达98%以上,MTT证实具有良好的促MCF-7细胞增殖的作用。
结论已成功构建了含hIGF-1基因的原核表达载体,并获得具有生物学活性的高纯度rhIGF-1。
【总页数】4页(P848-851)【关键词】人胰岛素样生长因子-1;原核表达;纯化;生物学活性【作者】曹传平;陈晓虹;吴建国;商阿丽;虞慧华;康五朋;郑玲莉;张敬;鞠佃文【作者单位】上海美恩生物技术有限公司;同济大学生命科学与技术学院【正文语种】中文【中图分类】Q782;Q786【相关文献】1.Flt3配体基因原核表达载体的构建、表达、纯化及生物学活性鉴定 [J], 刘小林;段秀梅;方艳秋;谭岩;史宏博;车媛媛;刘力华2.大鼠补体C5a蛋白真核、原核表达载体的构建以及体外表达的鉴定、纯化和生物学活性分析 [J], 季明德;单锴;庞蓉蓉;赵聃;王迎伟3.不同激酶活性的hPAK6基因原核表达载体的构建及重组蛋白的表达 [J], 刘彤;李洋;朱戈;李丰4.蜂毒肽基因原核表达载体的构建及重组蛋白生物活性作用的研究 [J], 王文佳;田维毅;蔡琨;王平;梁建东;何光志5.BPI_(23)-Fcγ1重组蛋白原核表达载体的构建、表达和生物学活性的测定 [J], 安云庆;柯岩;杨贵贞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人转化生长因子β1RNA干扰真核表达载体的构建的开题报告
人转化生长因子β1RNA干扰真核表达载体的构建的开题
报告
标题：人转化生长因子β1RNA干扰真核表达载体的构建
研究背景：
转化生长因子β1（TGF-β1）是一种重要的一般性生长因子，参与了许多生命过程的调节，包括细胞增殖、分化、凋亡、生长和发育等。
过度表达或缺少调控的TGF-β1会引发多种疾病，如心血管疾病、癌症、肝纤维化和糖尿病等。
因此，对TGF-β1的调控机制和治疗疾病的策略的研究具有重要意义。
RNA干扰是一种在基因表达调控中广泛应用的新技术，该技术通过RNA小分子干扰RNA的特异性降解，从而降低特定基因的表达水平。
因此，利用RNA干扰寻找TGF-β1的治疗靶点已成为当前各种疾病研究的热点之一。
研究目的：
本研究旨在构建一种高效的人TGF-β1 RNA干扰真核表达载体，并在细胞水平上评估其RNA干扰效率，为进一步研究TGF-β1的调控机制和相关疾病的治疗提供支持。
研究方法和步骤：
1. 获取人TGF-β1的RNA序列，设计TGF-β1 siRNA序列；
2. 构建TGF-β1 RNA干扰真核表达载体；
3. 通过PCR、限制酶切和测序验证所构建的载体序列的正确性；
4. 利用真核细胞转染方法将所构建的载体转化进入人类肺腺癌A549细胞，筛选得到RNA干扰效率高的基因型细胞株；
5. 通过Western blot及实时荧光定量PCR等方法检测TGF-β1 mRNA和蛋白的表达水平。
研究意义：
本研究将有助于更深入地了解TGF-β1的调控机制和其在各种疾病中的作用，并为相关疾病的治疗提供一种新的策略。
人HMGB1-boxA基因克隆及其原核表达载体的表达的开题报告
人HMGB1-boxA基因克隆及其原核表达载体的表达的开题报告一、项目背景高移动性族细胞内胚质结合蛋白1（HMGB1）是一种高度保守并广泛存在于真核生物中的核蛋白，常常被用作细胞核DNA的结构稳定化，参与基因转录和修复等生命过程。
然而，它在细胞外的作用引起了许多研究者的注意，研究表明在创伤性损伤、炎症和肿瘤等情况下，HMGB1被释放到细胞外，发挥了调节炎症反应、增强免疫功能、促进细胞增殖等生物学效应。
因此，HMGB1成为了一种重要的免疫调节分子。
目前，已经有研究报道在小鼠系统中采用腺病毒载体将HMGB1基因转染到肌肉中，能够刺激肌肉细胞增殖和修复，这项工作使得将HMGB1基因运用到基因治疗中成为可能。
因此，对HMGB1的研究越来越受到重视。
本项目旨在克隆人类HMGB1-boxA基因，构建原核表达载体，并表达出推测蛋白酶切片段的重组蛋白，为后续研究奠定基础。
二、研究内容1.克隆人类HMGB1-boxA基因从人类基因组组织DNA中扩增出人类HMGB1-boxA基因，进一步纯化并进行酶切。
2.构建原核表达载体选用适当的载体，将人类HMGB1-boxA基因插入表达的诱导区域，构建重组质粒并验证质粒正确性。
3.原核表达及纯化利用大肠杆菌表达人类HMGB1-boxA蛋白，利用亲和层析纯化筛选出重组蛋白。
4. SDS-PAGE和Western blot检测利用凝胶电泳技术和Western blot技术检测经SDS-PAGE和电泳分离后纯化出的人类HMGB1-boxA蛋白的表达情况和纯度。
三、研究意义通过克隆人类HMGB1-boxA基因并构建原核表达载体，能够将人类HMGB1-boxA蛋白在大肠杆菌中表达并高效纯化。
此项研究为之后HMGB1-boxA蛋白的进一步功能研究奠定基础。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
自建检测系统间结果比较:Y2=0.996Y1-3.671γ= 0.999。
2.2 U检验:2个自建检测系统测定样本结果与参考检测系统测定结果进行U检验,得出U1=0.1906、U2=0.079均<1.96,即P均>0.05,差异无统计学意义。
2.3 国产CHE精密度分析:结果见表1。
表1 国产CHE精密度分析项目(U/L)批内(CV%)批间(CV%)患者水平1(CHE:1846) 1.59 2.35患者水平2(CHE:12279) 1.26 1.84正常质控品(CHE:4258) 2.04 2.81异常质控品(CHE:2128)0.65 1.363 讨论 随着临床生化检验工作量的日益增加,各种高档全自动生化分析仪在各家医院广泛得以应用,但是一般医院难以承受相应配套试剂昂贵的费用,在全自动生化分析仪上大多使用非配套的国产试剂。
如何确定国产试剂与原装试剂检测结果是否一致,是目前临床生化工作人员所面临的一个重要课题。
标准化、系统化及溯源性对加强质量管理,提高临床检验质量具有重要意义。
我们在选用任何一种试剂前,要对自行建立的检测系统进行详细的论证与评估,以保证临床检测结果的准确性及各实验结果间的可比性[3]。
本研究结果显示以国产CHE为基础建立的不同检测系统与Roche Modular可溯源的参考检测系统血清CHE检测结果间具有很好的相关性,γ均>0.99,2个自建检测系统测定样本结果分别与参考检测系统测定结果进行U检验,P均> 0.05,差异无统计学意义。
而以国产试剂为基础建立的2个检测系统间血清CHE检测结果可比性还要优于与参考系统间的比较,且精密度CV%<5%。
由此可见,并非只有原装试剂才能够保证检测结果的准确性。
只要在选择试剂前做好详细的论证与评估,使用国产试剂在保证测定结果准确的基础上还能有效的降低成本。
4 参考文献 [1] 付文金,彭兰芬.自建与配套检测系统生化结果一致性探讨[J].检验医学,2007,22(4):402.[2] Nati onal Comm ittee f or Clinical Laborat ory Standards. Method comparis on and bias esti m ati on using patients sa mp les: Appor oved guidline[S].NCC LS,EP9-A,1995.[3] 冯仁峰.临床检验管理技术基础[M].上海:上海科学文献出版社,2003:5-11.[收稿日期:2008-03-21 编校:李晓飞 郑英善]人转化生长因子-β1基因克隆、测序及真核表达载体的构建金善爱1,柴红梅1,崔极哲2,杨 波2,吴 宏2,柳忠辉3,张晓光2(1.吉林大学第二医院麻醉科,吉林 长春 130041;2.吉林大学第二医院眼科,吉林 长春 130041;3.吉林大学基础医学部免疫教研室,吉林 长春 130021)[摘 要] 目的:克隆人转化生长因子-β1(TGF-β1)基因编码区c DNA序列,构建并鉴定TGF-β1真核表达载体。
方法:设计含有EcoRⅠ和XholⅠ酶切位点的TGF-β1c DNA引物,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法,以人白细胞mRNA为模版,扩增TGF-β1基因,纯化PCR产物,T A克隆,双酶切与pc DNA3质粒表达载体连接,转化感受态大肠杆菌J M109,酶切鉴定阳性重组子,并进行序列测定。
结果:琼脂糖凝胶电泳显示,用双酶切后形成分子量1.2kb的条带,符合物理图谱,表明表达载体构建成功,序列测定结果与预测结果完全一致。
结论:成功克隆了TGF-β1基因,并成功地构建了真核表达载体pc DNA3-TGF-β1。
[关键词] 转化生长因子-β1基因克隆;逆转录聚合酶链反应;pc DNA3-TGF-β1真核表达载体Gene clon i n g and constructi on of expressi on vector for hu man TGF-β1J I N Shan-ai1,CA I Hong-m ei1,CU I J i-zhe2,et al(1.D epart m ent of A nesthesiology,the Second Hospital of J ilin U niversity,Chang2 chun130041,China; 2.D epart m ent of O phthal m ology,the Second Hospital of J ilin U niversity,Changchun130041,China)Abstract:O bjecti ve To construct and identify eukaryotic exp ressi on vect or f or hu man TGF-β1gene,c DNA sequence of encoding regi on of hu man transf or m ing gr owth fact or-β1(TGF-β1)was cl oned.M ethod Pri m ers f or TGF-β1c DNA containing restricti on endo2 nuclease site sequences f or either EcoRⅠor XholⅠwere designed,then TGF-β1gene was a mp lified with mRNA fr om hu man bl ood leu2 cocytes as te mp late by reverse transcri p ti on-poly merase chain reacti on(RT-PCR),and the p r oduct of RT-PCR was purified and liga2 ted with T A cl oning vect or,and identified by restricti on endonucleases digesting,and ligated with exp ressi on vect or pc DNA3and transfect2 ed int o competent E.coli J M109,the positive recombinant was identified by restricti on endonucleases digesting and DNA sequencing.Re 基金项目:国家自然科学基金资助课题(30500548)sults Agar ose gel electr ophoresis showed there was a1.2kb of band after restricti on endonucleases digesting,which was consistent with the sequences publicized by Gene bank,s o exp ressi on p las m id was successfully constructed,and the result of DNA sequencing analysis was comp letely consistentwith whatwe had p redicted.Conclusi on Hu man TGF-β1gene is successfully cl oned,and eukaryotic exp ressi on vect or pc DNA3-TGF-β1is successfully constructed.Key W ords: Transfor m ing gr owth fact or-β1;Gene cl oning;RT-PCR;Eukaryotic exp ressi on 人转化生长因子-β1(transfor m inggr owthfact orbeta1,TGF-β1),是一种具有多功能的生长因子。
其生物学功能非常复杂,在多种组织细胞的增殖分化、间质形成、组织损伤修复、骨质再生、胚胎发育以及免疫调控中起着重要的作用[1]。
目前已经证实TGF-β1是一种强效免疫抑制因子,其功能比环孢菌素A(Cycl os porines,Cs A)还要强大约104～106倍[2]。
近年来的研究发现TGF-β1不仅能通过下调淋巴细胞和巨噬细胞功能等非特异性免疫抑制作用参与移植免疫,还能抑制树突状细胞(dendrticcell,DC)表面MHC抗原、协同刺激分子的表达,降低DC的抗原呈递功能,干扰DC分化成熟,诱导供者特异性移植耐受[3]。
为此我们考虑能否通过增加局部内源性TGF-β1表达来抑制异体视网膜色素上皮(Retinal p ig metep i2 theliu m,RPE)细胞移植免疫排斥反应,诱导产生移植免疫耐受。
为了探讨其临床应用的可能性,实验首先构建TGF-β1真核表达系统,为进一步应用奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料:pGE M-T质粒载体(Pr omega公司)、pc DNA3质粒载体(I nvitr ogen公司)、Trizol试剂(I nvitr ogen公司)、RT-PCR 试剂盒(TaKaRa公司,onestep)、LATaq聚合酶(Takara公司)、d NTP混合物和T4DNA连接酶(Takara公司)、限制性内切酶Ba mH I、EcoRⅠ/Xho I(Takara公司)、PCR引物(由Takara公司合成)、PCR仪(Perkin-El m er/Cetus公司)、DNA回收试剂盒(Takara公司)、DNAL igati onSoluti onⅠ(Takara公司)、大肠杆菌J M109(吉林大学医学部免疫实验室保存)。
1.2 人TGF-β1c DNA的扩增1.2.1 人白细胞总RNA提取:采用Trizol试剂从人外周血白细胞提取总RNA,实验操作按试剂说明书操作(I nvitr ogen)。
1.2.2 PCR引物设计:根据人TGF-β1(hTGF-β1)基因序列,分别设计上游、下游2条引物用于克隆hTGF-β1全编码c DNA,上游引物引入EcoRⅠ酶切位点,5′--cgaattcatgccgc2 cctccgggctgc--3′;下游引物引入XholⅠ酶切位点,5′--cctcgaggacctcagctgcacttgcag--3′。
1.2.3 RT-PCR反应:采用TaKaRaonestepRT-PCR试剂盒,按照说明书操作,循环参数位:48℃、30m in,94℃、2m in, (94℃、1m in,55℃、30sec,72℃、1m in30sec)30cycles,72℃10m in。