NO.8 —— 如何建立HPLC法测定有关物质的方法
高效液相色谱法的实验操作指南
高效液相色谱法的实验操作指南高效液相色谱法是一种广泛应用于各个领域的分析技术。
它通过将溶液在高压下通过固定好的柱子进行分离，可以快速、准确地测定样品中的成分。
本文将介绍高效液相色谱法的实验操作指南，包括仪器和试剂准备、样品制备、色谱条件设定等。
首先，进行高效液相色谱实验前，准备好所需的仪器和试剂是必不可少的。
一般情况下，实验使用的仪器包括高效液相色谱仪、进样器、柱温箱等。
在使用前需要进行仪器的检查和校准，确保各项参数正常。
此外，还需要准备好色谱柱、移液管、吸管、试剂瓶等实验所需的小工具。
对于试剂的选择，需要根据实验的目的和需要选择适当的溶剂和试剂浓度。
其次，样品的制备是高效液相色谱实验中的重要一步。
样品的制备需要根据实验的具体要求进行。
一般情况下，可将样品溶解于适当的溶剂中，并进行必要的稀释。
在样品制备过程中，需要注意样品的溶解度、稳定性以及是否需要进行预处理等因素。
在进行实验时，色谱条件的设定是至关重要的。
首先，选择合适的柱子和移液管进行分离，根据需要设定流速和柱温。
其次，根据实验目的和需要，选择适当的流动相。
流动相的选择基于试剂的性质、溶解度以及对样品成分的分离效果等因素。
在色谱条件的设定过程中，需要进行系统的优化，比如调整流动相组分和浓度、柱温等参数来提高分离效果。
在进行实验时，操作的细节也需要特别关注。
首先，在进行进样时，需要控制好样品的体积和进样速度，以免影响实验结果。
另外，在进行分离时，需要注意观察波峰的形态和峰面积，以判断分离效果的好坏。
最后，在实验结束后，需要及时清洗仪器和柱子，并妥善保存。
高效液相色谱法的实验操作指南不仅涵盖了仪器和试剂的准备，还包括了样品制备和色谱条件设定等方面的内容。
在进行实验时，需要注意细节，并进行适当的优化和调整，以保证实验结果的准确性和可靠性。
通过遵循实验操作指南，我们可以更好地掌握高效液相色谱法的实验技巧，为科研工作提供有力的支持。
希望本文的介绍能够对读者有所帮助，促进高效液相色谱法的应用和发展。
_HPLC基础高效液相基本原理和使用方法
_HPLC基础高效液相基本原理和使用方法HPLC（高效液相色谱）是一种分离和分析化学品的常用技术。
它通过将需要分离的化合物溶解在流动相中，然后在高压马达的驱动下，将混合物通过填充了固定相的柱子，利用固定相与流动相间的相互作用来分离混合物中的成分。
HPLC主要由柱子系统、流动相系统、检测系统和数据处理系统组成。
HPLC的基本原理是通过不同样品成分与固定相之间的相互作用来分离化合物。
固定相可以是各种各样的填料，如硅胶、C18烷基硅胶等。
当样品进入柱子时，各个成分会以不同的速度进行吸附和解吸，从而分离出各组分。
流动相系统是HPLC中的重要部分，它主要负责将混合物带入柱子和在柱子中移动。
流动相可以是无机溶液，也可以是有机溶剂与无机溶液的混合物。
常见的流动相包括水，甲醇，乙酸和醋酸等溶液。
检测系统用于检测流出柱子的化合物并生成信号。
HPLC的常见检测器包括紫外-可见光谱检测器（UV-Vis）和荧光检测器。
它们通过测量样品在不同波长下的吸收或荧光发射来定量分析各个组分。
数据处理系统用于接收和处理从检测系统获得的信号。
它可以通过线性回归方法将信号转换成样品浓度，并通过柱子排列和峰面积积分来确定样品中各成分的含量。
在使用HPLC之前，首先要准备样品。
样品的制备涉及样品的提取、纯化和浓缩等步骤。
样品提取方法的选择取决于所分析样品的性质和所需分离的化合物类型。
接下来，需要准备流动相。
选择适当的流动相是成功分析的关键。
流动相的选择根据所需分离的化合物种类，以及固定相和样品的亲疏水性来确定。
然后，选择适当的柱子。
柱子的选择取决于分析目标和分离条件。
HPLC柱子的尺寸和填料类型会影响分析的时间和分离的效果。
之后，需要设置检测器，并根据所需分析的化合物选择合适的检测器。
对于紫外-可见光谱检测器，需要选择合适的波长以提高灵敏度和分辨率。
在实际操作中，还需要考虑一些其他因素。
例如，设置压力和流速以控制样品在柱子中的流动速度。
还需要进行一些温度调节，以确保溶剂和柱子的稳定性。
请简述hplc的使用流程
HPLC的使用流程1. 准备样品和溶剂在开始使用高效液相色谱（HPLC）之前，首先需要准备好需要测试的样品和相应的溶剂。
样品应该经过预处理，以确保样品的纯度和稳定性。
如果需要，可以使用溶剂稀释样品以达到分析要求。
2. 准备色谱柱和流动相接下来，需要准备好色谱柱和所需的流动相。
选择合适的色谱柱是非常重要的，根据样品的性质和分析要求选择合适的填料材料和柱型。
柱子通常需要进行活化处理和平衡，以确保柱子的性能稳定。
流动相的配制也非常重要。
根据样品的性质和分析要求，选择合适的溶剂和缓冲液，然后按照特定的比例混合。
确保流动相的稳定性和纯度。
3. 提前设置好HPLC仪器在进行实际的样品分析之前，需要提前设置好HPLC仪器。
这包括连接好色谱柱和流动相，设置好流速、检测器类型和波长，并进行仪器的校准和优化。
4. 注射样品当一切准备就绪后，可以将样品注射到HPLC系统中进行分析。
注射样品时需要注意样品的体积和浓度，确保注射采样的准确性和重复性。
5. 分析过程监控一旦样品注射到HPLC系统中，需要对分析过程进行监控。
可以通过系统软件监测流速、压力和检测器输出等参数。
确保分析过程的稳定性和准确性。
6. 数据处理和解释完成样品分析后，需要对得到的数据进行处理和解释。
根据需要可以使用专业的软件对数据进行处理和分析，比如峰面积计算、峰识别、峰纯度评估等。
7. 结果报告和记录最后，根据分析结果生成报告并进行记录。
报告应该包括样品的信息、分析方法、分析结果和结论等。
同时，也需要将实验记录在实验记录簿中，以备后续参考和验证。
以上是HPLC的使用流程的简要描述，根据实际情况可能会有一些细微的差别和调整。
在使用HPLC仪器进行样品分析时，需要遵循安全操作规程，并根据具体的实验要求进行操作。
HPLC分析方法开发与验证
HPLC分析方法开发与验证分析方法开发与验证在不同行业有不同的要求，医药化学行业对于质量的控制非常严格，高效液相分析是控制产品质量的重要手段，其开发与验证对其它行业有很好的借鉴意义。
一、分析方法开发分析方法的开发主要包括色谱柱的选择、流动相的选择、检测波长的选择和梯度的优化几个方面。
目前高效液相多做反相使用，所以本文主要以反相为例进行讲解。
1.色谱柱的选择原料药生产对产品的纯度和杂质含量的要求非常苛刻，要求检测使用的色谱柱有较高的理论塔板数，能提供更好的分离度，从而对可能存在的杂质有更大的分离的可能性，所以5um填料的色谱柱长要250mm，3.5um填料的柱长要150mm，基本上都是各个粒径柱长最长的。
我比较喜欢近两年新出的亚二微米填料的色谱柱，50mm柱长就能提供很高的理论塔板数，而且柱长和粒径小了，流速增加很多，能节省很多的分析时间，极大的提高工作效率。
一般选用直径为4.6mm或3.0mm的柱子，太细了可能会增大柱外效应。
填料的孔径对于小分子合成药物不需要考虑，普通的分析柱都在100A左右，能满足分析检测的需要。
对于API分析方法开发，一般要求必须做色谱柱的筛选实验，最少使用三种不同类型的色谱柱，每种类型三只，要来自于不同厂家。
三种类型包括:1)普通的C18或相应的C8色谱柱，如Waters的Symmetry C18或C8，YMC的Pack Pro C18或C8，Agilent的RX C8等，其它公司如菲罗门和热电也有相应的色谱柱; 2)封端处理的或者极性嵌入型色谱柱，如Waters的Symmetry Shield RP18或RP8，XTerra RP18或RP8，YMC的ODS AQ，Agilent的Zorbax SB AQ等，其它公司如菲罗门和热电也有相应的色谱柱;3)填料用其它官能团修饰过的色谱柱，如苯基柱等，很多公司都有。
一般不同类型的色谱柱在选择性上会有很大的差异，相同类型的色谱柱生产厂家不同在选择性上也会有差异，这个主要是填料的性质和生产工艺决定的，有时候用一只色谱柱分离不好，除了优化梯度和流动相外，换一个厂家的柱子也是一个很好的选择。
高效液相色谱（HPLC）操作规程
高效液相色谱（HPLC）操作规程一操作1.准备工作⑴流动相的准备应根据实验选择合适的流动相，所有流动相原则上应选择HPLC级别，水应选择超纯水，并应保持新鲜。
所有流动相在进行实验前应经过相应的脱气处理，脱气时间应根据流动相的量相应增加，但一般超声脱气不应少于20min。
在实验过程中应保证足够的流动相，流动相的量与流速、洗脱时间等有关，应根据具体情况进行准备。
⑵样品的准备对于待测的样品，在进样之前应经过滤膜过滤，根据样品的不同选择不同种类、不同直径的滤膜。
2. 排气打开purge阀，键入stop→prime，直到无气泡停止stop。
B泵同样操作。
关闭purge阀。
3. 开机打开电脑主机和显示器，点击Galaxie，进入工作站。
选择系统，点击Agilent HPLC.点击overview，可观察仪器各部分状态。
打开泵及检测器的电源。
二 分析方法建立1.进入工作站系统界面。
点击数据，文件→新建→方法，出现视窗，点击前进即可。
键入方法名和相应描述→点击ok后出现方法文档。
2.210的设定点击控制→210图标→Elution。
选择流动相A和B的种类。
Compressibility、Pressure Constant以及Refill Time属于内置参数无需设定。
设置A、B流动相的比例，通过改变B的比例设定。
如需梯度洗脱，则根据方法对Equilibrium Time 和Hold Time进行设定。
点击Misscellaneous。
Start Mode选择Inject Trigger on Pump A。
End of Sequence 选择Leave Pump on。
210设定结束。
3.325的设定点击325图标，选择Signal。
其中Detector Bunch Rate建议设置成2（10Hz），Noise Monitor Length建议设定成64，Response Time建议设定0.5。
根据方法设定相应波长。
HPLC原理及基本操作
HPLC原理及基本操作HPLC（高效液相色谱法）是一种广泛应用于分析化学和制药工业中的分离技术。
它基于液相色谱法，通过将样品溶解在流动相中，并通过固定填料进行分离和分析。
1.样品的溶解：样品通常是固体或液体，在HPLC中需要将其溶解在流动相中。
流动相可以是水、有机溶剂或它们的混合物。
2.固定相填料的选择：HPLC中的填料通常是高度吸附性和具有大表面积的细小颗粒。
这些颗粒被填充在色谱柱中，提供了分离和分析的平台。
3.流动相选择：流动相的选择取决于样品的性质和目标分析的目的。
流动相的成分和配比可以根据需要进行调整，以改变分离效果和分辨率。
4.注射样品：将样品通过注射器引入HPLC系统，注射器将样品推入色谱柱中。
5.流动相的微量泵：流动相的微量泵非常重要，它通过控制流动相的流速将样品推过填料。
6.色谱分离：样品在填料中根据其亲水性（亲水性成分被保留在固定相上，疏水性成分则被推至溶剂流动相）进行分离。
固定相越亲水，则与样品中的亲水性成分相互作用越强；固定相越疏水，则与样品中的疏水性成分相互作用越强。
7.检测器：色谱柱的末端通常装有检测器，用于检测样品溶液中目标化合物的浓度。
8.数据处理：使用计算机系统分析检测器输出的图形数据，然后计算和解释结果。
HPLC基本操作：1.准备样品：将样品溶解在适当的溶剂中。
2.准备色谱柱：将填料装入色谱柱中，并使其适当压实。
3.连接色谱柱：将装有填料的色谱柱连接至HPLC系统。
4.设置流动相：根据需要设置流动相的组成和配比，通过微量泵提供流动相。
5.设置检测器：根据需要设置检测器，选择适合目标化合物的检测方法。
6.注射样品：使用自动或手动注射器将样品引入HPLC系统。
7.运行分析：通过微量泵控制流速，运行HPLC系统使样品通过色谱柱，分离和分析目标化合物。
8.数据处理：使用计算机系统分析检测器输出的图形数据，进行峰面积计算、峰高定量等数据处理。
9.结果解释：根据分析结果解释样品中的目标化合物的存在和浓度。
hplc操作流程
hplc操作流程高效液相色谱（HPLC）是一种常用的分析技术，它能够对化合物进行快速、高效、精确的分离和定量分析。
在实验室中，HPLC操作流程的规范性和准确性对于保证实验结果的可靠性至关重要。
下面将介绍HPLC操作流程的具体步骤，希望能够对大家有所帮助。
1. 样品处理。
首先，对待测样品进行处理。
通常情况下，样品需要通过溶解、过滤等步骤进行前处理，以确保样品的纯度和稳定性。
在处理过程中，需要注意避免样品受到外界污染或损害。
2. 色谱柱装填。
接下来是色谱柱的装填。
在进行色谱柱装填之前，需要根据待测化合物的性质选择合适的色谱柱和填料。
在装填过程中，要确保色谱柱的完整性和稳定性，避免气泡和漏液的产生。
3. 流动相配置。
根据待测样品的特性和分析要求，配置合适的流动相。
流动相的选择和配置对于分离和分析的效果具有重要影响，需要根据实际情况进行调整和优化。
4. 仪器参数设置。
在进行HPLC分析之前，需要对色谱仪进行参数设置。
包括流速、检测波长、温度等参数的设定，以确保分析的准确性和稳定性。
5. 样品进样。
将处理好的样品注入到进样装置中，进行自动或手动进样。
在此过程中，需要保证样品的进样量和速度均匀稳定，避免产生进样峰。
6. 色谱条件优化。
在进行分析之前，可以通过调整色谱条件来优化分离效果。
包括流速、温度、梯度程序等参数的调整，以获得最佳的分离效果和分析结果。
7. 数据采集和分析。
在分析过程中，需要对数据进行实时采集和记录。
通过色谱软件进行数据处理和分析，得到分析结果并进行解释和评价。
8. 仪器维护。
分析结束后，需要对色谱仪进行清洗和维护。
包括色谱柱的冲洗、流动相的更换、仪器的保养等工作，以确保仪器的正常运行和延长使用寿命。
以上就是HPLC操作流程的基本步骤，希望能够对大家在实验中的操作有所帮助。
在进行HPLC分析时，需要严格按照操作流程进行，确保实验的准确性和可靠性。
同时也要注意安全操作，避免发生意外事故。
祝大家实验顺利，取得理想的分析结果！。
仪器分析高效液相色谱法
仪器分析高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的仪器分析方法，广泛应用于化学、药学、环境科学、食品科学等领域。
本文将介绍HPLC的原理、仪器组成、操作步骤以及应用领域。
HPLC的原理是利用样品在液态流动条件下在固定相上的分配行为进行分离和定量分析。
相比于传统的色谱法，HPLC具有操作简便、分离效果好、灵敏度高等优点。
HPLC的仪器组成主要包括溶液配制系统、进样系统、柱温控制系统、分离柱、检测器和数据处理系统。
其中，溶液配制系统主要用于调配流动相，进样系统用于将样品注入分离柱，柱温控制系统用于控制柱温度，分离柱用于实现样品的分离，检测器用于检测样品，数据处理系统用于处理和分析检测结果。
HPLC的操作步骤如下：1.首先，需要根据需要选择合适的固定相和流动相，然后将固定相充填到分离柱中。
2.将样品溶解于合适的溶剂中，并按照一定的稀释比例稀释溶液。
3.将稀释后的溶液注入进样器中。
4.打开柱温控制系统，设置合适的柱温。
柱温的选择应考虑到样品的性质以及分离柱的要求。
5.打开溶液配制系统，调配合适的流动相，并将流动相以一定的流速通过分离柱。
6.启动检测器，并设置适当的检测波长和灵敏度，以便对样品进行检测。
7.数据处理系统会自动记录检测结果，并进行相应的数据处理和分析。
HPLC广泛应用于化学、药学、环境科学、食品科学等领域，常见的应用包括药物分析、环境污染物检测、食品成分分析等。
例如，可以利用HPLC对药物中的成分进行分离并进行定量分析，以保证药物的质量和疗效。
在环境科学中，HPLC可以用于检测空气、水体和土壤中的有机污染物。
在食品科学中，HPLC可以用于检测食品中的残留农药、添加剂和重金属等。
总之，HPLC是一种常用的高效仪器分析方法，通过流动相在固定相上的分配行为实现样品的分离和定量分析。
由于其操作简便、分离效果好、灵敏度高等优点，成为化学、药学、环境科学、食品科学等领域中不可或缺的分析工具。
高效液相色谱法测定药品有关物质时的操作要点
高效液相色谱法测定药品有关物质时的操作要点摘要】药品安全与人们的生命健康密切相关，因此，加强药品测定方法的研究，对确保药品安全意义重大。
药品测定中高效液相色谱法（HPLC）在测定药品有关物质时具有较高精准度，优点突出，被广泛应用在药品物质测定中。
本文对药品有关物质测定中HPLC操作要点进行探讨，为提高测定质量提供参考。
【关键词】高效液相色谱法；药品；有关物质；测定【中图分类号】R927 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）16-0322-01药品中的相关物质主要指药物生产、贮存环节引入的有机杂质，不仅给药物纯度造成较大影响，而且影响药物疗效的正常发挥，甚至引起不良反应。
HPLC在当前药品中有关物质测定中应用广泛，如何把握测定操作中的要点，提高测定结果准确性，受到越来越多业内人士的关注。
1.溶液配制及系统适用性试验1.1 配制溶液如使用自身对照法进行测定，应分别配制两份对照溶液、供试品溶液，均需进行两次进样。
当需进行复验、产生边缘数据或采用外标法时在分别配制两份的同时，至少各进行三次进样。
另外，使用外标法时，还需对其中一份溶液进行五次连续进样。
1.2 系统适用性试验系统适用性是否满足规范要求直接影响药品有关物质测定结果准确性，其中拖尾因子、重复性、分离度是系统适用性试验中的重要参数，应引起足够的重视。
首先，使用反相高效液相色谱法测定药品中有关物质时，借助峰面积实现，通常对拖尾因子不做要求，而如果出现严重的拖尾现象，会给测量峰面积以及分离效果造成不利影响，甚至会包含杂质，严重影响测定结果准确性，因此，应注重对拖尾因子严加控制。
其次，重复性。
当杂质含量不足0.5%时，要求峰面积相对标准差不能达到10%；当含有0.5%～2%的杂质时峰面积相对标准差不能达到5%。
当杂质含量超过2%时，峰面积相对标准差应控制在2%以下。
当使用外标法时要求对照溶液进行连续五次的进样，要求峰面积相对标准差不能超过2%。
有关物质测定HPLC方法的建立
有关物质测定hplc方法的建立一、开始之前必须明白：1、有关物质来源的两种途径：1）合成过程中的中间体和副产物；2）储存过程中产生的降解产物；2、分析你的样品结构，熟悉样品的基本性质；3、样品中可能含有的中间体；4、样品的基本稳定性和可能产生的降解产物；二、准备工作1、查阅文献，看看是否同行已经做过类似的工作，有的话就简单了，直接奔主题了。
2、没有文献（苦！），那就很是麻烦了。
1）分析结构，看看有无紫外吸收，有就比较简单，选用紫外检测器就行了，没有的话那就麻烦，可以选用蒸发光散射检测器等；2）分析结构，看看选用何种色谱方式进行分离（正相或者反相色谱）；3）分析结构，看看流动相该如何选择，要不要选用一些离子对试剂。
4）分析结构。
5）与同类产品进行比较；三、开工（以紫外检测为例）1、流动相的选择（采用粗品进行选择）1）、有文献，按文献进行优化。
不过我得提醒一下，文献的方法参考是可以的，要想完全按照他的条件做出来是很难的。
2）、没有文献。
a、紫外扫描一下，看看哪里有最大吸收。
将能得到的中间体、副产物、分解产物、样品配成相同浓度，在紫外扫描分光光度计上扫描一下，选择所有物质具有相同的最大吸收处的波长作为测定波长。
要是有pda检测器就不需要这一步了。
b、还是得找一些资料，看看类似的样品的流动相，以它为起始流动相进行选择，如果没有，那就找专业书吧，看看它是怎么教你选择流动相的。
2、最低检测限。
3、系统适应性试验。
重复进样5次，记录色谱图，给出系统评价报告4、考察中间体及副产物和样品的分离度。
同时定出中间体在色谱图中的出峰位置，为定质量标准提供依据。
5、考察降解产物和样品的分离情况。
这个一般是通过破坏性试验来考察。
常用的一般是高温、强光、氧化、强酸、强碱五个因素进行考察，通过考察，应该可以知道色谱图中那些峰是由于什么因素产生，这个也可为定质量标准提供依据。
6、根据上面的试验，应该可以知道样品的一些大概情况了，样品中有哪些杂质应该比较明确了。
HPLC试验步骤和方法开发
– 需要调整流速、进样量
? 注意梯度条件 ? 了解系统的滞后体积（梯度）
一）选择HPLC检测器
? 对样品有响应并有一个输出信号 ? 应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线
性关系；并且所设计的校正技术应该促进这种 关系 但是： ? 由于受HPLC系统其他部件的影响会产生响应 与浓度之间关系的与线性偏离现象 ? 并不是所有的检测器是线性的 ? 受HPLC系统其他部件的影响，检测器的表现 可能与其最佳水平有较大的差距
二）色谱基本分类
? 色谱基本分类： 按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质可以分为：
1.分配色谱—分配系数 *** 2.亲和色谱—亲和力 3.吸附色谱--吸附力 4.离子交换色谱—离子交换能力 5.凝胶色谱（体积排阻色谱）--分子大小引起的体积排阻
分配色谱
分配色谱分为： 正相色谱：固定相（填料）为极性，流动相为非极性 反相色谱：固定相（填料）为非极性，流动相为极性。 用得最多，约占60-70%
? 在精细化工分析中的应用
醇、醛和酮、醚的分离分析 酸和酯的分离分析 表面活性剂的分析 聚合物的分析研究 药物、农药、染料、炸药等工业产品
HPLC的应用领域
?化妆品行业要控制和分析： 防腐剂、防晒剂、性激素以及维生素等；
?在公安、刑警破案工作需要 投毒药物、毒品分析等
?在环境污染分析中的应用 废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、酚 类和胺类的检测
? 离子型化合物的分离方式
– 多数化合物是离子型的！
? 使用离子交换柱：离子交换法
– 主要用于“强”阴、阳离子
? 使用反相柱
– 离子抑制色谱法：通过改变流动相的 pH值，使 样品成中性
如何建立高效液相色谱法测定有关物质的方法
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5
10
15
t/min
1—1；2—中间体Ⅰ；3—中间体Ⅱ
图3 1与中间体的混合溶液色谱图
参考文献：
[1] 艾建国, 晋 展. 抗抑郁药Duloxetine Hydrochloride[J]. 药 学进展, 2003, 27(3): 188.
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中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2007, 38(1)
XIE Mu-feng
(Shanghai Institute for Drug Control, Shanghai 200233)
ABSTRACT: How to establish a HPLC method for determination of related substances in drugs is discussed. The principles of establishment of the chromatographic conditions and some problems in the drawing the quality standard of drugs are exemplified.
中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2007, 38(1)
有关物质的HPLC方法建立
有关物质的HPLC方法建立有关物质特定物质中不是主要组成物，但与成份相关的物质。
有关物质的来源原料药合成过程中带入;制剂过程中产生;或是在贮藏、运输、使用过程中产生。
有关物质的计算方法杂质对照品法@加响应因子（即重量校正因子）计算的自身对照法、@不加响应因子计算的自身对照法@根据不同杂质采用不同方法等。
有关物质的计算方法定量检测和限度检测溶解度考察考察被测物在水、甲醇、乙腈、冰醋酸、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷等几种常用溶剂中的溶解度，判断被测物极性强弱。
紫外光谱绘制考察被测物在水、甲醇、乙腈等常用溶剂的紫外吸收情况，一般选取最大吸收波长作为流动相选择时的检测波长。
几种被测物最大吸收波长不一致时，选取共同吸收较大的波长。
流动相的选择中性成分▪被测物为中性成分时，一般选择甲醇-水、乙腈-水、四氢呋喃-水三种系统。
乙腈-水系统由于粘度小，通常可以得到良好的柱效。
此外，乙腈的紫外末端吸收比甲醇小，在低波长处检测基线波动小，测定误差小。
▪被测物为极性较大的中性成分时，系统中甲醇或乙腈的比例可适当小些。
被测物为极性较小的中性成分时，可适当增大甲醇或乙腈的比例。
碱性成分▪向流动相中加入胺类扫尾剂。
常用三乙胺、二乙胺、乙二胺、正丁胺等。
▪加入反离子，常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠及十二烷基磺酸钠。
高碳数离子对试剂使保留时间过长，可更换低碳数的离子对试剂。
流动相的pH 一般为3-5。
酸性成分▪向流动相中加入少量弱酸，常用甲酸、醋酸。
适用于分离3≤pKa≤7的弱酸。
▪加入反离子，常用的离子对试剂为四丁基季胺盐及四丁基磷酸盐等。
流动相的pH一般为7-7.5。
流动相的要求▪被测物之间分离良好，分离度达到1.5以上。
主成分保留时间以10分钟为宜。
分析时间通常为主成分保留时间的2-3倍。
分析时间过长的可考虑采用剃度洗脱。
检测波长的确定▪以选定的流动相为溶剂，考察被测物的紫外吸收情况。
有DAD检测器的，考察主成分峰纯度，应达到98%以上。
HPLC方法建立经验
一.背景我的研究课题是从发酵液中提取一种小分子抗生素，并得到其纯品。
在这个过程中，想用高效液相色谱帮助指导分离，最终开发出用于测定发酵液效价的方法。
要达到这个目的，首先要找到一种合适的分析方法，可以将目标组分与其它杂质分开，并优化到合适的保留时间和良好的峰型。
这其中有一个很大的困难：没有目标组分的纯品，不了解其结构。
在这种情况下，如何选着色谱柱？如何配比流动相？这一切都是摆在我这个新手面前的挑战。
希望此贴能给像我一样刚开始接触HPLC的战友一些经验。
-----------------------------------------------------------------------二.样品介绍我的目标成分（发酵液中的活性成分）是一种小分子抗生素，到目前为止对它有以下了解：1.这是一种小分子物质2.这种物质极性很强，不溶于绝大多数有机溶剂3.这种物质在酸性条件下带正电荷，可能呈碱性在进行高效液相分析之前，发酵液已经经过了预处理，并用大孔树脂、离子交换树脂等在生物显影的指导下进行了初步的分离纯化（事实上到这可能很多朋友都看出来了，这种物质在发酵液里，说明它溶于水的。
可以用离子交换，就是能电离，那么一定极性不低。
如果是行家，可能就不会像我傻乎乎的还用C18+甲醇水摸半个月条件了^-^ ）。
用于上样的样品组成应该不是特别复杂，推测只有一个活性成分，另外活性成分和杂质应该极性都较强。
------------------------------------------------------------------------三.用到的色谱柱和色谱仪1.某品牌C18柱，5μm，4.6×200mm2.极限C18-AQ，5μm，4.6×250mm（Ul timate柱试用体验）Agilent 1100 series，在线脱气机，手动进样器VWD检测器-------------------------------------------------------------------------四.曾经的思路我主修的专业和仪器分析相去甚远，也没有接触过HPLC，这次要完成这个任务，起初还是很盲目的。
实用HPLC方法的建立
弱酸浓度在0.5－10％。三氟乙酸是强酸用量同无机酸。
加酸的作用一是在低pH 下，抑制被弱酸性物质的电离； 延长保存时间抑制拖尾。二是调节流动相的pH，起到 缓冲作用。
注意：流动相的pH一般不能低于2，否那么将缩短色谱 柱的寿命。
无机盐和有机盐
种类很多，常用的是钾盐和钠盐。磷酸盐、硫酸盐醋 酸盐。
Na2HPO4,NaH2PO4,K2HPO4,KH2PO4,Na2SO4,NaAC,柠檬 酸钠，EDTA钠。
胺类试剂
三乙胺、二乙胺、NH4OH等，
类似离子对的作用，在C18中，并能抑制峰的拖尾。其 次调节流动相的pH。
流动相的选择原那么是，非极性的一般有机溶剂和水 能解决。极性样品，要添加改性剂，并控制pH值。离 子样品，C18柱用离子对试剂，也可控制pH值来处理， 或者用离子交换树脂。
残留、环境样品等〕 5 分析的工作量，少数还是大量？时间和效率与别离的
选择。 6 实验室的条件，如HPLC仪器的配置和档次；色谱柱系
统；是否有恒温；是否可以做梯度；分析本钱；实验室 人员的操作技能；方法的移植等等。
2.3 样品的预处理与检测
样品来源的形式 1 可直接进样的溶液〔注意是否与流动相匹配〕 2 需稀释、pH缓冲、加内标或其它操作 3 固体样品－选择适宜的溶剂 4 需提取别离的样品 5 预处理，除去干扰物尤其对仪器和柱子有损害的
水理论上要求超纯水，但在实际中，我们认为HPLC－ MS〔飞行时间质谱〕和HPLC－ELSD必须用超纯水。其 它的用纯水和蒸馏水及类似水质也可以，用优质的桶 装蒸馏水、纯水是能满足分析要求的。去离子水勉强 可以，不能在低波长下使用。
酸，可添加一定量的无机酸和有机酸。
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27
有关物质在质量标准中的制订
3。系统适用性试验进行一强破坏试验，以验 证分离度。如中国药典中的氧氟沙星所有品 种，均在HPLC法的色谱条件下拟定了：取 供试品溶液，臵紫外灯下（254nm）照射4
小时以上，使产生的紧邻主峰前的杂质峰与
主峰的分离度应符合规定。
28
有关物质在质量标准中的制订
4。再如：国家药品标准WS1-(X-350)-
即所谓重量校正因子的问题。（f=A杂质/A被测成分）
@ @ 选取主成分与各杂质具有相同紫外吸收的波长（f=1.0）。 选取各杂质紫外吸收大于主成分紫外吸收的波长 （f>1.0），这样可更加严格控制杂质的限度。 @ 如选取各杂质紫外吸收小于主成分紫外吸收的波长，应
必须加入重量校正因子（f<1.0），否则将得到错误的判断。
此时供试品溶液的浓度可设定为 1mg/ml
~20mg/ml，或者再高一些，但始终需保持主成
分峰不拖尾为准，即不超过最大进样量。
• 拖尾情况也可通过流速进行适当调节
10
3. 供试品溶液浓度的确定
浓 度 最大进样量 供试品溶液 对照溶液 最低检出量 50mg/ml 以上 5mg/ml 50μg/ml 1μg/ml
@ 归一化法
3
有关物质的计算方法
@ 杂质对照品法
@ 加响应因子（即重量校正因子）计算
的自身对照法、 @ 不加响应因子计算的自身对照法 @ 根据不同杂质采用不同方法等。
* 有关物质的计算方法
定量检测和限度检测
4
高效液相色谱法（HPLC法）
1 .色谱条件的确定（即专属性试验）
专属性是提供被分析物在杂质和辅料存在
2004Z——注射用奥美拉唑钠的质量标准中
规定：取供试品溶液，加3%过氧化氢溶液
3ml，放臵10分钟后，再加流动相稀释至刻
度，摇匀，作为系统适用性验证用溶液。色 谱图中与主成分峰相邻的氧化降解产物峰与 主成分峰的分离度应符合规定。
29
典 型 图 谱 分 析
VWD1 A, Wavelength=280 nm (XMF\05112203.D) mAU 6 4 2 0 0 5 10 VWD1 A, Wavelength=280 nm (XMF\05112204.D) mAU 6
目前USP、BP、EP中的一些规定。
22
4 .定量的确定
由于TLC法通常无法准确定量，故可采用 配制一系列浓度的对照溶液来衡量杂质介于何
种浓度之间的方法进行，但此法较为烦琐。
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紫外分光光度法（UV法）
在一些溶液剂的杂质检测中，也常采用在
可见区某波长处测定样品溶液的吸收度值，以
不超过某限度为准的方法。 这里需注意的是，同时需附有溶剂、辅料 （制剂时）的紫外扫描图谱，以验证该法的专 属性。
进样量 20μl 20μl 20μl 20μl
绝对值
相对于样品测定浓度的
100μg 1μg 20ng
100%（5000 倍） 1% 0.02%
11
4. 加样回收试验（即准确性试验）
准确性试验可采用样品中加入已知量杂质的
方式来评价。准确称量各杂质，将含有1% (w/w)
浓度的各杂质加入到样品溶液中，以验证所采用 的色谱条件是否可分离检出出相应的各杂质。该 原理同前面所述的专属性研究是一致的。
波长——254mn和360nm，故测定有其局限性。
采用显色的方法进行时，通常喷以显色剂后
需立即检视。
21
3 . 供试品溶液与对照溶液浓度的确定 （灵敏度试验——最小检出点样量的测定） 其原理与HPLC法相同。
最低检出量可采用不断稀释样品溶液浓度，点样直 至观测不到为止。
最大点样量可采用不断增加样品溶液浓度，直至不 拖尾的浓度为准。 通常考虑到试验耐受性因素的影响，将供试品溶液 浓度设定为比最大点样量略小一些为好。 该项试验要求必须附有试验的点样图谱照片。
基线漂移的小峰均被积分出作为杂质峰，从而导致杂
质峰面积增加，易判断为不合格；如设定的太大，又 将反应不出杂质的存在情况。
14
6. 最小峰面积的设定
其设定，不是绝对值，而是相对值。 英国药典中有明确的说明：凡有关物质的检测采用HPLC 法测定时，均规定舍弃对照溶液主峰面积几分之几的峰 面积。普通样品测定时，通常为1/10~ 1/20（即相当于样 品测定浓度的0.1%~0.05%）。如规定杂质限度为1.0%， 对照溶液峰面积为10000，那么，最小峰面积可考虑设定 为1000~500左右。新药稳定性考核时，可设定到0.01%的
4. 如分离检测出若干个杂质峰，在制订总杂质限度的基础
上可考虑制订单个杂质限度。
5. 测定制剂时，辅料是否对测定有干扰。如有干扰（通常
出峰较快），可考虑采用规定时间限度的方法予以排除。
32
12
5. 流速、柱温与溶剂的选择
在测定时通常调节流速使主成分保留时间稍长些，
且使主成分峰不拖尾即可。
柱温对分离效果的影响虽有一定的影响，但不甚
显著，如有柱温箱，通常设定不超过35℃。
溶剂的选择应测定样品溶液在该溶剂中的稳定性 来衡量，尽量勿选择挥发性强的溶剂；同时应保 证对照溶液的主成分峰面积精密度良好。
18
10. HPLC/UV二极管阵列检测器
采用二极管阵列检测器进行论证，也是目
前常采用的一个强有力的手段。它通过对一个色
谱峰的几点进行紫外扫描，然后比较所得到的扫
描图谱的接近程度从而评价被检测峰的纯度。
我室有一台该检测器，曾多次做过该方面的 工作。
19
薄
层
色
谱
法
薄层色谱法由于既可检测具有紫外吸收的
物质，又可检测不具有紫外吸收，因此也被广
泛地应用。但由于其不具有准确定量的性质， 故其应用受到一定的限制。 • 1. 展开剂的确定 与HPLC法相同，配制含有1%浓度各中间 体的主成分对照品溶液作为系统适用性试验用 溶液进行试验，来确证展开剂的适用性。
20
2 . 检测方法的确定
可采用紫外灯下检测，由于通常只具有两种
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有关物质在质量标准中的制订
1. 通常在原料药的质量标准中，需制订有关物质检 查项。制剂时，如经制剂工艺后，与原料药比较 有关物质有所增加或经稳定性考核后，有关物质 量有所增加，均应在质量标准中制订有关物质检
查项，如未有明显增加，可考虑不予以制订。
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有关物质在质量标准中的制订
2. 质量标准中的系统适用性试验，应规定理论板数 按主成分峰计应不低于多少（通常为2000） ，且 最好能将相应的杂质（该杂质为最难分离的）订入， 以用于系统适用性试验用溶液的配制，将杂质的浓 度配制为主成分浓度的1%进行试验，从而确保本
5。再如：进口的盐酸氨溴索质量标准中规定：
取对照品5mg，加甲醇1ml溶解后，加甲醛1
滴，臵60℃加热5分钟，氮气吹干，残渣用
水5ml溶解，再加流动相稀释至25ml，进样
测定，使产生的杂质B（相对保留时间为0.8） 与主成分峰的分离度应大于4.0。
31
有关物质在质量标准中的制订
3. 制剂有关物质的检测方法一般应与其原料药有关物质的 检测方法相同。含量测定方法也应尽量与有关物质测定 方法相同，并最好稀释一定倍数。
药品研究及生产过程中有关物 质的控制方法和要求
上海药检所化学室 谢沐风
1
• 有关物质的来源
@ 原料药合成过程中带入; @ 制剂过程中产生;
@ 或是在贮藏、运输、使用过程中产生。
• 控制的必要性
2
有关物质的测定方法
仪器角度： @ 高效液相色谱法（HPLC法）、 @ 薄层色谱法（TLC法）、 @ 紫外分光光度法（UV法）、 @ 气相色谱法（GC法）、 @ 毛细管电泳色谱法（CE）等 试验角度： @ 对照品法 @ 自身（稀释）对照法
最小峰面积。
同时请大家注意，在进行原料药销售与购买的合同中， 为确保双方达成一致意见，此点应予以重视。
15
7. 保留时间的设定
经过上述方法学认证后，确定供试品溶液的 保留时间，通常以洗脱出全部杂质和经强力破坏
试验出的杂质，规定至主成分保留时间的几倍为
止。
16
8. 强力破坏试验 水破坏 取原料适量，加水溶解后，在90℃放臵24小时。 氧化破坏 强碱破坏 强酸破坏 取原料适量，用5%过氧化氢溶液溶解后，在 取原料适量，用1mol/L氢氧化钠溶液溶解后， 取原料适量，加1mol/L盐酸溶液溶解后，在 90℃放臵24小时。
又由于最低检出量受各因素的不同而改变（即耐
受性因数），故供试品溶液的浓度在保证不拖尾
的情况下（即小于最大进样量），可在此基础上
再设定的高一些，以保证该浓度可适用各种条件。
9
3. 供试品溶液浓度的确定
• 举例说明：进样量为20μl，主成分的最低检出量
为1μg/ml（以浓度表示），规定杂质限度为1%，
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6. 积分参数的设定
积分参数的设定是非常重要的。它主要由斜率(Slope)、
峰宽(Width)、最小峰面积(Min Area)组成。
采用自身对照法时，对照溶液与供试品溶液必须在同 一斜率、峰宽下进行积分计算。 这里主要是供试品溶液的最小峰面积设定，它将直接 导致测定结果。设定的太小，会导致很多小峰甚至是
• 最大进样量以不断增加样品溶液浓度，直至被 分析物不拖尾的浓度为准。
8
3. 供试品溶液浓度的确定
• 设定杂质总量不得过1.0%，最低检出量通常需达
到对照溶液浓度的1/10~1/50（即相当于供试品溶
液浓度的0.1%~0.02%）。也就是说供试品溶液 的浓度至少是最低检出量的1000倍~ 20000 倍，
在90℃放臵24小时。
90℃放臵24小时。