实验八 甲基绿一派洛宁法
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实验八核酸细胞化学——甲基绿一派洛宁法
(methyl green—pyronin method)
【目的要求】
(1) 学会制作血涂片。
(2) 熟悉甲基绿一派洛宁法显示核酸的原理及操作步骤。
(3) 观察DNA、RNA在细胞中的分布。
【实验原理】
甲基绿、派洛宁为两种碱性染料,与带负电荷的磷酸根形成盐键。甲基绿分子有两个正电荷,易与双链DNA分子结合,使DNA显示绿色,派洛宁分子有一个正电荷,易与单链RNA结合使RNA显示红色。也有人认为染色原理与核酸分子的空间构型有关(图5—5)。
【实验用品】
(1) 器材:注射器、载玻片、盖玻片、染色缸、显微镜。
(2) 试剂:①0.2mol/L醋酸缓冲液(pH4.8):A.冰醋酸1.2ml加蒸馏水至100ml。B.醋
酸钠(NaAc·3H20)2.72g溶于100ml。使用时,A液与B液按2:3比例混
合。②甲基绿一派洛宁染色:A.2 g甲基绿加0.2mol/L醋酸缓冲液至100ml;
B.1.0g派洛宁Y加醋酸缓冲液至100ml;临用时:甲液与乙液5:2混合
即成。
甲基绿中常混有甲基紫,如不除去,会影响染色效果。纯化甲基绿的方法是:先把甲基绿倒入分液漏斗,加入氯仿,用力摇匀,静置,弃去溶有甲基紫的氯仿,再换入新氯仿。如此,反复几次,直到氯仿无甲基紫的颜色为止,干燥之后备用。此法为显示DNA、RNA的经典方法,配制染色试剂时要注意比例适当。
(3) 材料:蟾蜍血涂片。
【方法与步骤】
(1) 蟾蜍血涂片,干燥后入70%乙醇溶液固定10min,取出晾干。
(2) 滴染色液于血膜上,染15min。
(3) 蒸馏水冲洗。
(4) 95%乙醇溶液分色,晾干,封片。
【观察结果】
蟾蜍红细胞的核因含DNA显绿色,细胞质及核仁因含RNA显示红色。【作业】
绘蟾蜍红细胞图示DNA、RNA的分布。