嗜水气单胞菌外膜蛋白ompA基因的原核表达及免疫保护性研究

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嗜水气单胞菌孔蛋白OmpF重组表达及其免疫原性分析

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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2019, 35(9):23组表达及其免疫原性分析
高云山刘丹丹徐俊林桑雨浓梁夏夏刘建欣王文彬
（1. 江苏海洋大学海洋生命与水产学院，连云港 222005 ；2. 江苏海洋大学江苏省海洋生物技术重点实验室，连云港 222005）
关键词：嗜水气单胞菌；外膜蛋白 OmpF ；重组表达；免疫原性 DOI ：10.13560/ki.biotech.bull.1985.2019-0628
Recombinant Expression and Immunogenicity Analysis of the Porin Protein OmpF of Aeromonas hydrophila
Abstract: Outer membrane protein（Omp）F in Aeromonas spp. is β-barrel like porin，and involves in the adaption of osmotic pressure and is highly conservative in this common pathogen for human and fish，thus poses a promising research value as immune-detection target. The A. hydrophila OmpF fragment published in GenBank was synthesized，and inserted into plasmid pET-28a（+）. The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli BL21（DE3）and induced by isopropy-β-D-thiogalactoside（IPTG）. The molecular size of the expressed protein was about 40 kD，which mainly expressed as inclusion bodies after optimization of inducing temperatures and IPTG concentrations. BALB/c mice were immunized with purified OmpF inclusion bodies. The results of ELISA showed that the immunized mice serum cross-reacted with 10 of 11 boiled and deactivated strains of Aeromonas spp.，the serum titers were around 1∶81 000. However，the mice serum did not react with Vibrio cholerae，Bacillus licheniformis，V. parahaemolyticus，V. vulnificus，and V. anguillarum. The above results indicate that the protein OmpF is immunogenic，conserved and was promising in developing Aeromonas cross-reactive antibodies.

不同来源嗜水气单胞菌外膜蛋白基因检测及序列分析

不同来源嗜水气单胞菌外膜蛋白基因检测及序列分析葛慕湘;张艳英;靳晓敏;房海;陈翠珍【摘要】Forty - two pathogenicity Aeromonas hydrophila strains isolated from Whitmania pigra, Rana temporaria chens-inensis, Paralkhthys olivaceus, Ctenopharyngodon idellua, Mylopharyngodon piceus and Cyprinus carpio were investigated for the presence of outer membrane protein (OMP) genes using PCR methods in this study, and the homology of OMP genes from diverse representative A. hydrophila strains were compared with available sequences in the NCBI GenBank including four strains of A. hydrophila ( FJ437030. 1, AF183931. 1, AF276639. 2 andCP000462. 1 ) and one strains of A. sobria (FJ437029. 1) using the soft - ware DNAStar. The results show that all the detective strains contain the OMP gene, the carrier rate is 100% . The OMP genes of seven A. hydrophila strains which were sequenced share 86. 0% ~ 99. 2% nucleotide sequence homology with the reference strains. There is higher homology (98. 3% ~ 100% ) within seven A. hydrophila strains which were isolated from different hosts. Among them, the strain HTQ010505 - 1 isolated from W. pigra display the highest nucleotide (100% ) homology with strainsHL060811 -4 isolated from M. piceus.%采用PCR方法,对分离于发病宽体金线蛭(Whitmania pigra)、中国林蛙(Rana temporaria chensinensis)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、草鱼(Ctenopharyngodon idellua)、青鱼(Mylopharyngodon piceus)、鲤(Cyprinus carpio)的42株致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)进行了外膜蛋白(OMP)基因的检测；将代表菌株的外膜蛋白基因通过DNAStar软件与GenBank中报道的4株嗜水气单胞菌(FJ437030.1、AF183931.1、AF276639.2、CP000462.1)和l株温和气单胞菌(A.sobria,FJ437029.1)参考菌株进行了核苷酸同源性比较分析.结果表明,所检不同来源嗜水气单胞菌的OMP基因携带率为100％；所测代表菌株的OMP基因与参考菌株的同源性在86.0％～ 99.2％之间.所测得的不同来源嗜水气单胞菌OMP基因的同源性98.3％～100％,其中分离于宽体金线蛭的HTQ010505-1与青鱼的HL060811-4两菌株间同源性高达100％.【期刊名称】《淡水渔业》【年(卷),期】2013(043)002【总页数】5页(P75-79)【关键词】嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila);外膜蛋白基因;序列分析【作者】葛慕湘;张艳英;靳晓敏;房海;陈翠珍【作者单位】河北科技师范学院,河北省预防兽医学重点实验室,河北昌黎066600【正文语种】中文【中图分类】S917.4;Q789嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是危害鱼类、两栖类、爬行类和哺乳类动物的一种革兰氏阴性条件致病菌，可引起细菌性败血症、腹水病、腐皮病等多种疾病，给多种淡水养殖动物带来严重威胁［1］。

创伤弧菌OmpU与嗜水气单胞菌OmpⅡ外膜蛋白二联表达及其初步免疫原性

创伤弧菌OmpU与嗜水气单胞菌OmpⅡ外膜蛋白二联表达及其初步免疫原性郭松林;陆盼盼;冯建军;林鹏【摘要】从发病的养殖鳗鲡中分离出创伤弧菌(Vibrio vulnificus)和嗜水气单胞菌(Aeromona shydrophila),提取其基因组DNA,再通过PCR法克隆创伤弧菌外膜蛋白OmpU和嗜水气单胞菌外膜蛋白OmpⅡ的基因全长.采用融合PCR法体外连接这2个基因表达膜外片段的序列并成功构建了二联表达载体(pGEX-2T-Vibr-Aero-his).在大肠杆菌(BL21)的吸光度A600为0.6~1.0时,采用1.0 mmol/L IPTG诱导剂,16℃过夜诱导表达.表达产物经离心柱亲和层析纯化后获得分子量为82.2 ku的外膜蛋白.蛋白经透析复性后免疫于鳗鲡以测定其血清抗体效价.结果表明,重组蛋白注射组的鳗鲡血清抗体效价在免疫后第14天和第21天显著(P<0.05)高于PBS对照组,第28天和第42天达到极显著(P<0.01)水平.【期刊名称】《集美大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(022)003【总页数】7页(P1-7)【关键词】创伤弧菌;迟缓爱德华氏菌;OmpU;OmpⅡ;表达产物;免疫原性【作者】郭松林;陆盼盼;冯建军;林鹏【作者单位】集美大学水产学院, 福建厦门361021;鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心, 福建厦门361021;集美大学水产学院, 福建厦门361021;鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心, 福建厦门361021;集美大学水产学院, 福建厦门361021;鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心, 福建厦门361021;集美大学水产学院, 福建厦门361021【正文语种】中文【中图分类】S917养殖鳗鲡时常发生由细菌性病原引起的病害，使鳗鲡养殖户蒙受巨大经济损失。

嗜水气单胞菌(Aeromona shydrophila)和创伤弧菌(Vibrio vnlnificus)是引起养殖鳗鲡发病的2种主要病原菌，人工养殖的日本、欧洲和美洲鳗鲡均可因其引发肝脏溃疡、肾肿大、败血症、烂尾或烂鳃等传染性疾病[1-2]。

嗜水气单胞菌外膜蛋白TolB的原核表达及生物信息学分析

河南农业科学，2024，53（2）：136‐143Journal of Henan Agricultural Sciencesdoi:10.15933/ki.1004-3268.2024.02.015嗜水气单胞菌外膜蛋白TolB 的原核表达及生物信息学分析陈甜梦，蔡彤璇，王嘉璐，田牧野，赵宝华，刘东（河北师范大学生命科学学院，河北石家庄050024）摘要：为筛选TolB 作为嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila ）渔用疫苗候选抗原，从嗜水气单胞菌中克隆了外膜蛋白tolB 基因并异源表达，采用生物信息学方法预测TolB 的理化性质和结构特征。

结果显示，tolB 基因片段（去除信号肽）全长1263bp ，编码1条含有420个氨基酸残基的多肽，分子质量45.78ku 。

成功在大肠杆菌E .coli BL21（DE3）中异源表达TolB 蛋白，其为稳定的亲水性外膜蛋白。

TolB 蛋白家族在不同菌株间具有同源性，尤其在气单胞菌间亲缘关系更近。

TolB 蛋白二级结构以无规则卷曲为主，具有潜在的B 细胞、细胞毒性T 淋巴细胞（CTL ）和辅助T 细胞（Th ）抗原表位；相互作用网络主要为Tol-Pal 系统蛋白。

综上，TolB 具有成为嗜水气单胞菌亚单位疫苗有效候选抗原的特性。

关键词：嗜水气单胞菌；TolB ；原核表达；蛋白质纯化；生物信息学中图分类号：S94；Q816文献标志码：A文章编号：1004-3268（2024）02-0136-08Expression and Bioinformatics Analysis of Aeromonas hydrophilaOuter Membrane TolB ProteinCHEN Tianmeng ，CAI Tongxuan ，WANG Jialu ，TIAN Muye ，ZHAO Baohua ，LIU Dong（College of Life Science ，Hebei Normal University ，Shijiazhuang 050024，China ）Abstract ：The purpose of this study is to evaluate the application of TolB as the candidate vaccine antigento prevent Aeromonas hydrophila infection in fish.Outer membrane protein gene tolB from A .hydrophila was cloned and expressed in Escherichia coli BL21（DE3）.Physicochemical properties and advanced structures of TolB protein were analyzed by bioinformatics.The results indicated that tolB gene had an open reading frame of 1263bp （exclude signal peptide ），encoding a protein （TolB ）of 420amino acidswith molecular mass of 45.78ku.TolB was successfully expressed and purified from Escherichia coliBL21（DE3）.TolB was a stable and hydrophilic outer membrane protein.TolB had homology among different bacteria ，and was more closely related in Aeromonas .The secondary structure of TolB was dominated by random coil.TolB had potential B ，CTL and Th cell antigen epitopes and interacted with other Tol‐Pal system proteins.In conclusion ，TolB could be used as an effective vaccine candidate antigen agaisnt A .hydrophila .Key words ：Aeromonas hydrophila ；TolB ；Prokaryotic expression ；Protein purification ；Bioinformatics 收稿日期：2023-06-15基金项目：河北省自然科学基金项目（C2019205044）；河北省高等学校科学技术研究项目（ZD2018070）；河北省教育厅优秀青年基金项目（YQ2014026）；河北师范大学重点基金项目（L2016Z03）作者简介：陈甜梦（2000-），女，河北石家庄人，在读硕士研究生，研究方向：微生物生物化学。

单壁碳纳米管载嗜水气单胞菌外膜蛋白亚单位疫苗的研制及免疫效果评价

单壁碳纳米管载嗜水气单胞菌外膜蛋白亚单位疫苗的研制及免疫效果评价姜倩雯1,2，张丽珊1,2，李小艳1,2，武瑶1,2，赵怡扬1,2，徐慧铭1,2，林向民1,2*(1. 福建农林大学生命科学学院，福建福州 350002；2. 福建农林大学，福建省农业生态过程与安全监控重点实验室，福建福州 350002)摘要：为了筛选细菌的疫苗候选蛋白，本实验根据课题组前期的研究，挑选了2个嗜水气单胞菌外膜蛋白(A0KLQ6和A0KH89)，以A0KHR9(OmpAII)为对照，通过比较外膜蛋白与碳纳米管载外膜蛋白通过腹腔注射与浸泡免疫模式，比较和评价斑马鱼的免疫反应与免疫保护效果。

结果显示，腹腔注射组和浸泡组与普通蛋白组对比，碳纳米管载蛋白能够显著提高斑马鱼免疫相关基因表达量。

腹腔注射组在5 μg剂量下免疫A0KHR9、A0KLQ6和A0KH89蛋白分别获得61.60%、65.39%和84.96%相对免疫保护率(relative immune protection rate，RPS)，在5 μg剂量下免疫碳纳米管载蛋白SWCNTs-A0KHR9、SWCNTs-A0KLQ6和SWCNTs-A0KH89分别获得68.10%、77.50%和90.43%的RPSs。

浸泡组在40 mg/L 剂量下免疫A0KHR9、A0KLQ6和A0KH89蛋白分别获得30.80%、25.85%和37.80%的RPSs，在40 mg/L最高剂量下免疫碳纳米管载蛋白疫苗SWCNTs-A0KHR9、SWCNTs-A0KLQ6和SWCNTs-A0KH89分别获得63.60%、73.74%和68.49%的RPSs。

研究表明，铁离子限制下嗜水气单胞菌外膜蛋白A0KLQ6和A0KH89等能够作为抗嗜水气单胞菌的亚单位疫苗候选蛋白，而单壁碳纳米管载蛋白通过注射免疫与浸泡免疫均能显著提升免疫疗效，是一种疫苗的适宜纳米载体。

以上研究为寻找高效的嗜水气单胞菌亚单位疫苗候选蛋白及佐剂提供了理论依据。

嗜水气单胞菌外膜蛋白ompA基因的原核表达及免疫保护性研究

嗜水气单胞菌外膜蛋白ompA基因的原核表达及免疫保护性研究郑宗林;郑曙明;DelbertM.GatlinIII;汪开毓【摘要】The expression of outer membrane protein A (OmpA) from Aeromonas hydrophila (PDK06) in Escherichia coli, the antigenicity and immunoprotection in Ictalurus punctatus were analyzed. According to ompA gene sequence published in GenBank (AF146597), no signal peptide primers were designed and the DNA fragment of about 1 000 bp was amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR) from genomic DNA of A. hydrophila PDK06, isolated from disease I. punctatus. The se-quence was sub-cloned into pET-32a ( +) and the recombinant plasmid was named pET-32a ( +) -pompA which was further transferred into host bacteria E. coli BL21 (DE3) with IPTG induction for expression. The immune effect of the pompA with adjuvants ( FIA) against I. punctatus infected A. hydrophila were detected. The results showed the no signal peptide ompA gene of A. hydrophila was 960 bp in length, encoding a protein comprising 319 amino acids, of which the putative relative molecular mass was 53. 67 kDa. The FIA can improve the serum lysozyme activity, ACH50 activity and head kidney macrophage respiratory burst activity. The antibody level of the vaccinated fish without FIA were the highest at 4 weeks p. v. , while the antibody level of the vaccinated fish with FIA peaked at 5 weeks p. v. , which indicated FIA can significantly improve serum antibody levels of I. punctatus. The cumulative mortalities of the vaccinated fish were 93.33%(PBS), 93. 33% (FIA), 50. 00% (pompA), and 13. 33% (FIA +pompA), respectively, which correspond to an RPS of 46. 43% and 85. 71% for pompA and FIA + pompA, respectively. The result of serum bactericidal activity sugges-ted that the survival rates of A. hydrophila of the vaccinated fish were significantly lower than the survival rate of the control, and the bacterial survival rate of the FIA+pompA vaccinated fish was the lowest. These indicated that pompA can be a sub-unit vaccine candidate vaccine, and FIA was a suitable adjuvant to enhanced the performance of pompA.%为评价嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila, Ah)PDK06株外膜蛋白A(ompA)的原核表达产物是否具有抗原性及其对斑点叉尾 ( Ictalurus punctatus)的免疫保护力, 根据GenBank上嗜水气单胞菌外膜蛋白ompA基因序列(GenBank登录号: AF146597)设计去信号肽引物, 扩增获得一段约1 000 bp的序列, 经鉴定正确后, 构建重组表达质粒pET-32a( +) -pompA; 然后将该质粒转入BL21 (DE3)后用IPTG诱导表达, 经纯化后得到pompA重组蛋白; 最后将pompAompA蛋白与弗氏不完全佐剂( FIA)混合免疫斑点叉尾 , 评价其免疫效果. 结果显示:克隆的嗜水气单胞菌pompA基因全长为960 bp, 编码319个氨基酸, 融合表达的重组蛋白相对分子质量约为53, 670 kDa;FIA能够提高斑点叉尾的溶菌酶活性、 ACH50活性、头肾巨噬细胞呼吸暴发活性; pompA组抗体水平在第4周达到峰值, FIA免疫组抗体水平在第5周达到峰值, 且FIA能够显著提高斑点叉尾的抗体水平; 攻毒后各组累计死亡率分别为93. 33%( PBS)、 93. 33%( FIA)、50. 00%( pompA)和13. 33%( FIA+pompA) , pompA和FIA+pompA组相对保护率分别为46. 43%和85. 71%; 免疫组靶器官中的细菌数量显著低于对照组, 且FIA+pompA细菌含量最低. 说明pompA可以作为一个亚单位疫苗候选疫苗, 而FIA佐剂能较好的增强亚单位疫苗的免疫效果.【期刊名称】《淡水渔业》【年(卷),期】2015(045)005【总页数】9页(P3-10,28)【关键词】嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila);ompA;亚单位疫苗;斑点叉尾(Ictaluruspunctatus);免疫效果【作者】郑宗林;郑曙明;DelbertM.GatlinIII;汪开毓【作者单位】水产动物繁育和健康养殖研究中心, 西南大学荣昌校区, 重庆荣昌402460;Department of Wildlife and Fisheries Sciences and Faculty of Nutrition, Texas A&M University System, College Station, Texas 77840-2258, USA;四川农业大学动物医学院, 成都 625014;水产动物繁育和健康养殖研究中心, 西南大学荣昌校区, 重庆荣昌 402460;Department of Wildlife and Fisheries Sciences and Faculty of Nutrition, Texas A&M University System, College Station, Texas 77840-2258, USA;四川农业大学动物医学院, 成都625014【正文语种】中文【中图分类】S917.4嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)广泛存在于自然界的淡水、污水和土壤中，通过污染的水和相关产品感染人类。

嗜水气单胞菌外膜蛋白原核表达及其免疫保护性研究

嗜水气单胞菌外膜蛋白原核表达及其免疫保护性研究刘望;杨佳杰;杨静;薛茜;张苗;刘欢【期刊名称】《陕西科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(035)006【摘要】Aeromonas hydrophila is one of the important fish pathogen in China,and antibiot-ics treatment for this disease can cause the drug-resistance.Therefore,it′s an urgent need for developing new prevention methods now.In order to obtain the subunit vaccine with better immunoprotective effect,the two outer membrane proteins,OmpA and OmpTS were fusion expressed in Escherchia coli and the products were purified and its protective efficiency on the zebra fish against Aeromonas hydrophila were tested.The results showed that the ompA (1032 bp) and ompTS (1068 bp) genes were successfully cloned and the fusion fragment, OmpA-OmpTS (2100 bp),was obtained by overlap PCR.Then the recombinant expression plasmid,pET28a-OmpA-OmpTS,was constructed and introduced into the host strain,esche-richia coli BL21 (DE3).The conditions for fusion protein expression were that with the addi-tion of 1 mM IPTG after 2 h of the strain growth at 16 ℃ for 16 h.The recombinant protein, OmpA-OmpTS was purified and mixed with the adjuvant (FIA ) to be injected to the zebra fish to test its protection effect against Aeromonas hydrophila.The immunoprotectivity reached 87.5%,indicating that this fusion protein can be a candidate vaccine for further de-velopment.%嗜水气单胞菌是我国水产养殖鱼类重要病原菌,抗生素防治易产生耐药性等问题,亟需开发新型防治手段.外膜蛋白OmpA和OmpTS是嗜水气单胞菌主要的免疫原蛋白,为了得到免疫效果更佳的亚单位疫苗,利用大肠杆菌将OmpA和OmpTS进行融合表达,并对表达产物进行纯化,检测其对斑马鱼的免疫保护效果.结果表明:成功扩增获得大小分别为1032 bp和1068 bp的OmpA和OmpTS基因序列,随后进行Overlap PCR,得到大小为2100 bp的融合片段OmpA-OmpTS.成功构建重组表达质粒pET28a-OmpA-OmpTS,将其转入BL21(DE3),重组蛋白的表达条件为:菌体培养2 h后添加IPTG 1 mM,16℃下培养16 h.经纯化后得到重组蛋白OmpA-OmpTS;最后将OmpA-OmpTS蛋白与弗氏不完全佐剂(FIA)混合免疫斑马鱼,免疫保护率可达82.1%,表明该融合蛋白可作为候选亚单位疫苗进行进一步的开发.【总页数】6页(P125-130)【作者】刘望;杨佳杰;杨静;薛茜;张苗;刘欢【作者单位】陕西科技大学食品与生物工程学院,陕西西安 710021;陕西科技大学食品与生物工程学院,陕西西安 710021;陕西科技大学食品与生物工程学院,陕西西安 710021;陕西科技大学食品与生物工程学院,陕西西安 710021;陕西科技大学食品与生物工程学院,陕西西安 710021;陕西科技大学食品与生物工程学院,陕西西安710021【正文语种】中文【中图分类】S917.1【相关文献】1.嗜水气单胞菌外膜蛋白原核表达及其免疫保护性研究 [J], 刘望;杨佳杰;杨静;薛茜;张苗;刘欢;;;;;;2.嗜水气单胞菌外膜蛋白(OMP)的原核表达及其对BALB/c小鼠的免疫保护研究[J], 胡春霞;李梅;李卫芬;许梓荣;沈文英3.嗜水气单胞菌外膜蛋白ompA基因的原核表达及免疫保护性研究 [J], 郑宗林;郑曙明;DelbertM.GatlinIII;汪开毓4.鱼类致病嗜水气单胞菌外膜蛋白P5的原核表达、免疫保护及抗血浆杀菌作用研究 [J], 荣娜;简思杰;孙薇;康超;伍娜娜;刘祥5.嗜水气单胞菌外膜蛋白OmpK的原核表达、抗原性分析及抗血浆杀菌作用研究[J], 荣娜;康超;孙薇;简思杰;伍娜娜;刘祥因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

鱼类致病嗜水气单胞菌外膜蛋白P5的原核表达、免疫保护及抗血浆杀菌作用研究

西北农业学报 2021,30(3):333-342Acta Agricu11urae Boreaii-occidentalis Sinica网络出版日期：2021-03-18 doi ：10.7606/j.issn.1004-1389.2021.03.002网络出版地址:https ://kns . cnki. net/kcms/detail/61. 1220. S. 20210317. 1353. 016. html鱼类致病嗜水气单胞菌外膜蛋白P5的原核表达、免疫保护及抗血浆杀菌作用研究荣娜，简思杰，孙薇，康超，伍娜娜，刘祥(陕西理工大学生物科学与工程学院，中德天然产物研究所，陕西汉中723001)摘要研究鱼类致病嗜水气单胞菌外膜蛋白P5的免疫学功能，为相关疫苗开发奠定理论基础。

采用生物信息学方法分析P5的理化性质；分子克隆构建P5表达菌株并确定其最佳诱导表达条件,包涵体洗涤和SDS-PAGE 电泳切胶纯化P5蛋白，并免疫小鼠制备P5抗血清;Western blotting 检测抗血清特异性与效价，免疫酶联法模拟P5抗血清对嗜水气单胞菌的体外识别；P5抗血清被动免疫红鲫，攻毒以评价P5蛋白的免疫保护功能;Western blotting 分析P5蛋白抵抗鱼血浆的杀菌作用。

结果表明:P5蛋白在气单胞菌属间同源性较好，进化保守。

成功克隆表达、纯化P5蛋白，其最佳表达条件为：诱导时菌液浓度OD 600 = 1. 0 ,IPTG 浓度0. 5mmol/L,32 C 诱导8 h … Western blotting 验证P5抗血清特异性较好，效价达到1 : 1 600,ELISA 显示P5抗血清与嗜水气单胞菌存在识别作用，表明P5蛋白具有较好的免疫原性与抗原性。

被动免疫显示P5抗血清对红鲫的免疫保护率为显著性的56%，具有良好的免疫保护作用。

Western blotting 发现P5蛋白可通过表达下调有效抵抗鱼血浆的杀菌作用，表明其可能与细菌抗血浆杀菌有关。

鸭疫里默氏杆菌分离株外膜蛋白(ompA)基因的克隆、表达及其单克隆抗体制备

鸭疫里默氏杆菌分离株外膜蛋白（ompA）基因的克隆、表达及其单克隆抗体制备鸭疫是由鸭疫里默氏杆菌引起的一种严重传染病，对鸭类养殖业造成了严重的经济损失。

为了深入研究鸭疫病原菌的特性，我们进行了鸭疫里默氏杆菌分离株外膜蛋白（ompA）基因的克隆、表达及其单克隆抗体的制备研究。

首先，我们从临床鸭疫样品中分离到鸭疫里默氏杆菌，并进行了鉴定确认。

鉴定结果显示，我们成功分离到了鸭疫里默氏杆菌分离株。

接下来，我们利用PCR技术从鸭疫里默氏杆菌分离株中扩增得到了ompA基因片段。

通过电泳检测，确定所得到的PCR产物符合预期大小。

然后，我们将ompA基因片段与表达载体pET-28a(+)连接，并转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，得到了具有ompA基因的重组质粒。

随后，我们进行了重组ompA蛋白的表达和纯化。

在IPTG诱导下，重组菌株产生了大量的目标蛋白。

通过SDS-PAGE分析，我们确认了目标蛋白的分子量与理论值相符。

接下来，我们利用亲和层析柱纯化了重组ompA蛋白。

为了制备ompA的单克隆抗体，我们将纯化得到的ompA蛋白免疫BALB/c小鼠。

经过多次免疫和ELISA筛选，我们获得了能特异性识别ompA蛋白的单克隆抗体。

最后，我们对所制备的单克隆抗体进行了性能评价。

Western blot实验证实，该单克隆抗体可以与鸭疫里默氏杆菌中的ompA蛋白结合。

此外，我们进行了间接免疫荧光分析，结果显示该单克隆抗体能够在鸭疫里默氏杆菌中特异性地定位ompA蛋白。

总结起来，我们成功地克隆和表达了鸭疫里默氏杆菌分离株的ompA基因，并制备了特异性的单克隆抗体。

这为进一步研究鸭疫病原菌的致病机制和抵御鸭疫的防控策略提供了基础。

此外，所制备的单克隆抗体还可用于鸭疫的疾病诊断和预防。

我们的研究为控制和防治鸭疫提供了新的手段和理论基础通过将ompA基因转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，我们成功地实现了鸭疫里默氏杆菌的ompA蛋白的表达和纯化。

嗜水气单胞菌外膜蛋白原核表达及其免疫保护性研究

第35卷第6期陕西科技大学学报 V o l.35N o.6 2017年12月 J o u r n a l o f S h a a n x iU n i v e r s i t y o f S c i e n c e&T e c h n o l o g y D e c.2017* 文章编号:2096-398X(2017)06-0125-06嗜水气单胞菌外膜蛋白原核表达及其免疫保护性研究刘望,杨佳杰,杨静,薛茜,张苗,刘欢*(陕西科技大学食品与生物工程学院,陕西西安 710021)摘要:嗜水气单胞菌是我国水产养殖鱼类重要病原菌,抗生素防治易产生耐药性等问题,亟需开发新型防治手段.外膜蛋白O m p A和O m p T S是嗜水气单胞菌主要的免疫原蛋白,为了得到免疫效果更佳的亚单位疫苗,利用大肠杆菌将O m p A和O m p T S进行融合表达,并对表达产物进行纯化,检测其对斑马鱼的免疫保护效果.结果表明:成功扩增获得大小分别为1032b p和1068b p的O m p A和O m p T S基因序列,随后进行O v e r l a p P C R,得到大小为2100b p的融合片段O m p A-O m p T S.成功构建重组表达质粒p E T28a-O m p A-O m p T S,将其转入B L21(D E3),重组蛋白的表达条件为:菌体培养2h后添加I P T G1mM,16℃下培养16h.经纯化后得到重组蛋白O m p A-O m p T S;最后将O m p A-O m p T S蛋白与弗氏不完全佐剂(F I A)混合免疫斑马鱼,免疫保护率可达82.1%,表明该融合蛋白可作为候选亚单位疫苗进行进一步的开发.关键词:嗜水气单胞菌;外膜蛋白;原核表达;免疫保护性中图分类号:S917.1 文献标志码:AT h e p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o na n d i m m u n o p r o t e c t i o na n a l y s i so f o u t e rm e m b r a n e p r o t e i n s o f A e r o m o n a s h y d r o p h i l aL I U W a n g,Y A N GJ i a-j i e,Y A N GJ i n g,X U E Q i a n,Z H A N G M i a o,L I U H u a n* (S c h o o l o fF o o d a n dB i o l o g i c a l E n g i n e e r i n g,S h a a n x iU n i v e r s i t y o f S c i e n c e&T e c h n o l o g y,X i'a n710021,C h i-n a)A b s t r a c t:A e r o m o n a s h y d r o p h i l a i s o n e o f t h e i m p o r t a n t f i s h p a t h o g e n i nC h i n a,a n d a n t i b i o t-i c s t r e a t m e n t f o r t h i s d i s e a s e c a n c a u s e t h e d r u g-r e s i s t a n c e.T h e r e f o r e,i t's a nu r g e n t n e e d f o rd e v e l o p i n g n e w p r e v e n t i o nm e t h o d sn o w.I no r d e r t oo b t a i nt h es u b u n i tv a c c i n ew i t hb e t t e r i mm u n o p r o t e c t i v e e f f e c t,t h e t w oo u t e rm e m b r a n e p r o t e i n s,O m p Aa n dO m p T Sw e r e f u s i o ne x p r e s s e d i n E s c h e r c h i a c o l i a n dt h e p r o d u c t sw e r e p u r if i e da n d i t s p r o t e c t i v ee f f i c i e n c y o nt h e z e b r a f i s h a g a i n s t A e r o m o n a s h y d r o p h i l a w e r e t e s t e d.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e o m p A*收稿日期:2017-08-10基金项目:国家自然科学基金项目(31301059);陕西省科技厅自然科学基础研究计划面上项目(2017J M3010);陕西省科技厅自然科学基础研究计划青年项目(2013J Q3011);陕西省大学生创新创业训练计划项目(1326);陕西科技大学博士科研启动基金项目(B J12-24)作者简介:刘望(1991-),男,陕西西安人,在读硕士研究生,研究方向:食源性病原微生物通讯作者:刘欢(1983-),女,陕西西安人,讲师,博士,研究方向:食源性病原微生物,l i u h u a n@s u s t.e d u.c n陕西科技大学学报第35卷(1032b p)a n do m p T S(1068b p)g e n e sw e r e s u c c e s s f u l l y c l o n e da n d t h e f u s i o n f r a g m e n t, O m p A-O m p T S(2100b p),w a s o b t a i n e db y o v e r l a p P C R.T h e n t h e r e c o m b i n a n t e x p r e s s i o np l a s m i d,p E T28a-O m p A-O m p T S,w a s c o n s t r u c t e d a n d i n t r o d u c e d i n t o t h e h o s t s t r a i n,e s c h e-r i c h i a c o l i B L21(D E3).T h e c o n d i t i o n s f o r f u s i o n p r o t e i n e x p r e s s i o nw e r e t h a tw i t h t h e a d d i-t i o no f1mMI P T Ga f t e r2h o f t h e s t r a i n g r o w t h a t16℃f o r16h.T h e r e c o m b i n a n t p r o t e i n, O m p A-O m p T Sw a s p u r i f i e d a n dm i x e dw i t h t h ea d j u v a n t(F I A)t ob e i n j e c t e d t o t h e z e b r af i s ht ot e s ti t s p r o t e c t i o ne f f e c tag a i n s t A e r o m o n a sh y d r o p hi l a.T h ei mm u n o p r o t e c t i v i t yr e a c h e d87.5%,i n d i c a t i n g t h a t t h i s f u s i o n p r o t e i nc a nb e a c a n d i d a t ev a c c i n e f o r f u r t h e rd e-v e l o p m e n t.K e y w o r d s:A e r o m o n a s h y d r o p h i l a;o u t e r m e m b r a n e p r o t e i n;p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n;i m-m u n o p r o t e c t i o n0 引言嗜水气单胞菌(A e r o m o n a s h y d r o p h i l a)是一种条件致病菌,主要存在于海水㊁淡水㊁河流㊁湖泊等水环境以及污泥㊁土壤㊁人类粪便中,是我国水产养殖鱼类爆发性传染病的主要病原[1],可以感染草鱼㊁鲤鱼㊁鲫鱼以及罗非鱼等多种水产养殖鱼类,此外,嗜水气单胞菌还可以感染人和动物等[2],能引发人类的中耳炎㊁败血症及创伤面感染㊁腹膜炎以及急性肠胃炎等疾病[3,4].近年来,世界各地均陆续报道从食品㊁医疗用品以及急性胃肠炎患者粪便中检测出嗜水气单胞菌[5,6],在国外,嗜水气单胞菌已经被列入食品卫生检验的对象和医院腹痛腹泻病原菌检测的一项内容.因此,嗜水气单胞菌相关疾病的爆发不仅给水产养殖业造成巨大损失,还直接对人类健康造成了威胁,受到水产㊁兽医学界的重视[7].目前,防治该病的主要方法仍是使用抗生素,但是随着抗生素的反复使用,细菌产生耐药性,抗菌治疗的效果不明显,导致患病鱼的平均死亡率达40%~50%,给水产养殖业造成了严重的经济损失.因此,寻找免疫保护性抗原是预防该病暴发的重要手段.国内外学者已对嗜水气单胞菌进行了系统研究,发现嗜水气单胞菌可产生多种毒力因子,得到认可的毒力因子包括外毒素㊁胞外蛋白酶㊁脂多糖㊁外膜蛋白等.外膜蛋白(O u t e r m e m b r a n e p r o-t e i n s,O m p s)是存在于细菌外膜中所有蛋白的总称,在维持外膜结构㊁保证物质运输等方面有着重要作用[8].同时,由于其位于细胞的最外面而在细菌适应环境变化及致病性过程中亦扮演着重要角色.当细菌进入一个新的环境时,其外膜蛋白的合成会跟着变化[9].有许多研究结果表明,细菌的主要外膜蛋白的免疫原性很强,是重要的保护性抗原,利用致病菌的OM P做免疫原还可使鱼产生对不同血清型菌株感染的交叉保护力[10-12].本研究选取嗜水气单胞菌外膜蛋白o m p A基因和o m p T S基因在大肠杆菌中进行融合共表达,分离和纯化,并与弗氏不完全佐剂(F r e u d's i n-c o m p l e t e a d j u v a n t,F I A)结合,考察其对斑马鱼的免疫保护效果,旨在为研制嗜水气单胞菌基因工程奠定基础.1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株与质粒大肠杆菌D H5α㊁B L21(D E3)㊁嗜水气单胞菌L S01㊁表达质粒p E T28a均由本实验时保存. p M D19T购自T a K a R a公司.1.1.2 主要试剂和仪器(1)主要试剂:L B培养基,购自上海生工生物工程有限公司;T a q D N A聚合酶㊁P f u高保真聚合酶㊁蛋白质分子标准量M a r k e r㊁D N A分子标准量M a r k e r㊁D N A回收试剂盒及质粒抽提试剂盒,购自北京天根生化科技有限公司;T4D N A连接酶及限制性内切酶,购自T a K a R a公司.(2)主要仪器:恒温培养箱,L R H-250,上海一恒科学仪器有限公司;摇床,T H Z-C-1,太仓市仪器设备厂;P C R仪,M y C y c l e r t h e r m a l c y c l e r;核酸电泳仪,p o w e rP a c T MH C,伯乐生命医学产品有限公司;凝胶成像系统,F R980,上海复日科技有限公司.1.1.3 引物表1为本研究中使用的引物,参照G e n B a n k 上公布的基因序列设计,由上海捷瑞生物工程有限㊃621㊃第6期刘望等:嗜水气单胞菌外膜蛋白原核表达及其免疫保护性研究公司合成.下划线为限制性内切酶识别位点.表1 实验中所使用的引物引物名称序列(5'-3')A F C CG T C G A C A T G A A A A T G G C T C C T T C C C T GA R T C T T T T T C A T T T A C T T C T G A A C T T C T T G T A C GT S F T T C A G A A G T A A A T G A A A A A G A C A A T T C T G G CT S R G GC T C G A G T T A G A A G T T G T A T T G C A G G G C A A C 1.2 方法1.2.1 o m p A和o m p T S基因的克隆及o m p A-o m p T S融合基因的构建将-80℃保存的嗜水气单胞菌接种于L B液体培养基,30℃恒温培养24h,取1m L培养菌液按照天根细菌D N A提取试剂盒提取基因组D N A,以其为模板,分别利用引物对A F/A R和T S F/T S R进行基因扩增,分别克隆获得o m p A和o m p T S基因.P C R反应体系为50μL:2×T a q M a s t e rM i x25μL,D N A模板3μL,上下游引物各3μL,补加d dH2O至50μL.反应条件:94℃预变性4m i n,94℃50s,55℃30s,72℃1m i n,共30个循环,最后72℃延伸7m i n.反应产物以1%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统检测扩增结果.随后以回收到的o m p A和o m p T S基因序列为模板,以引物对A F/T S R进行O v e r l a p P C R,反应条件除延伸时间增加至2m i n钟外,其他条件同上.产物检验后割胶回收并用试剂盒纯化,最后以物质的量之比3∶1(插入片段/载体)的比例克隆入p M D19-T载体,转化大肠杆菌D H5α,在含氨苄青霉素(100μg/m L)的L B平板上挑取含有重组质粒p M D19T-o m p A-o m p T S的阳性克隆,利用T载体通用引物M13进行菌落P C R鉴定后进行基因测序.1.2.2 重组表达质粒p E T28a-o m p A-o m p T S的构建分别对重组质粒p M D19T-o m p A-o m p T S和表达质粒p E T28a进行质粒提取,并根据引物中设计的酶切位点,分别利用S a l I和X h o I对所抽提的质粒进行双酶切消化,琼脂糖凝胶电泳分析并将酶切后的融合基因o m p A-o m p T S与表达质粒p E T28a进行连接,转化大肠杆菌B L21(D E3),在含卡那霉素(100μg/m L)的L B平板上挑取含有重组质粒p E T28a-o m p A-o m p T S的阳性克隆,利用p E T系列载体T7通用引物进行菌落P C R鉴定后进行基因测序.1.2.3 重组表达载体p E T28a-o m p A-o m p T S在大肠杆菌中的表达和纯化将构建好的含有重组表达质粒p E T28a-o m-p A-o m p T S的大肠杆菌B L21置于添加卡那霉素的L B培养基中过夜活化培养.次日按照体积比1∶100加入到1m L同样的培养液中,37℃振荡培养.当菌种O D600达到0.6~0.8时,加入I P T G,不同温度下进行诱导表达,随后收集菌体进行S D S-P A G E分析.将诱导表达后以包涵体形式存在的融合蛋白进行超声破碎,沉淀用含2m o l/L尿素的包涵体洗涤液洗涤,洗涤后离心倒去上清,重复3次;再用含6m o l/L盐酸胍缓冲液溶解重组蛋白,将溶解后的溶液用0.45μm孔径的滤膜过滤,过滤后的溶液经N i柱亲和纯化,纯化的蛋白于4℃进行梯度尿素复性透析至P B S,复性产物经S D S-P A G E进行检测.1.2.4 重组融合蛋白与弗氏不完全佐剂混合乳化将纯化后的O m p A-O m p T S融合蛋白用P B S 重悬,将其浓度调整至2m g/m L,然后与弗氏不完全佐剂F I A按照1∶1的比例混合,在10m L无菌注射器中进行乳化.乳化时先用移液器乳化5 m i n,然后用注射器反复推进,直至水相与油相完全融到一起,形成油包水的乳白色液滴.取一滴滴入水中,如果液滴不扩散则说明乳化完全,若扩散则需继续乳化.将乳化好的样品放4℃冰箱保存备用.1.2.5 免疫将健康斑马鱼随机分成4组,其中2个组为免疫组(O m p A-O m p T S+F I A㊁O m p A-O m p T S),2个组为对照组(F I A㊁P B S),每组20条,平行设置3组.亚单位疫苗O m p A-O m p T S免疫剂量为2μg/ g鱼,与佐剂按照1∶1进行混合,每尾鱼背部肌肉注射配比好的佐剂疫苗,对照组注射等量的F I A 或P B S.2周后免疫组用等量的亚单位疫苗加强免疫一次(不包含佐剂).1.2.6 攻毒试验将嗜水气单胞菌L S01菌株接种于新鲜培养基中,于30℃过夜培养.以7.5×107C F U/m L为攻毒浓度,每尾背部肌肉注射0.2m L,攻毒后连续观察7d,记录死亡情况.以相对保护率表示免疫效果:相对保护率(R P S)=[1-(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100%.2 结果与讨论2.1 o m p A和o m p T S基因的克隆与鉴定以嗜水气单胞菌L S01基因组D N A为模板,用设计的引物对A F/A R和T S F/T S R分别进行P C R扩增,通过凝胶电泳分析发现,成功获得大小㊃721㊃陕西科技大学学报第35卷分别为1032b p和1068b p的o m p A和o m p T S 基因片段(如图1所示).P C R产物纯化后构建T-A克隆进行测序,在N C B I上进行序列比对分析,确定二者分别为嗜水气单胞菌O m p A和O m p T S 蛋白编码基因的开放阅读框编码序列区,其编码的蛋白质分别包含345个和356个氨基酸残基.图1 o m p A和o m p T S基因克隆P C R电泳图2.2 序列同源性分析在对O m p A和O m p T S蛋白编码基因进行测序后,将两个基因编码的氨基酸序列分别与N C B I 数据库中已登录的嗜水气单胞菌及其他气单胞菌属氨基酸序列进行比对分析:结果发现嗜水气单胞菌L S01的O m p A基因和O m p T S基因编码的蛋白与嗜水气单胞菌A T C C7966外膜蛋白O m p A 和O m p T S的同源性为99%,表明嗜水气单胞菌O m p A和O m p T S高度保守.同时,O m p T S与其他气单胞菌属(温和气单胞菌,豚鼠气单胞菌)中的O m p T S亦具有较高的保守性,同源度均达到82%以上.而O m p A与其它气单胞菌属中的O m p T S 氨基酸组成的同源性亦可达到65%以上(如图2㊁图3所示).可见,O m p A和O m p T S不止在嗜水气单胞菌中具有较高的保守性,且在气单胞菌属中亦具有较高的保守性,因此,以这两种蛋白构建的亚单位疫苗可能对多种气单胞菌属的病原菌实现多效价的免疫保护作用.图2 O m p A氨基酸序列同源性比对分析图3 O m p T S氨基酸序列同源性比对分析2.3 融合基因o m p A-o m p T S的克隆在成功克隆得到了嗜水气单胞菌L S01中外膜蛋白O m p A和O m p T S编码基因后,进一步地,通过O v e r l a p P C R将O m p A和O m p T S编码基因进行融合连接.结果显示,以O m p A和O m p T S编码基因为模板,利用引物对A F/T S R成功扩增得到大小为2100b p的特异性D N A片段(如图4所示),对产物进行回收和测序后证实其为融合基因o m p A-o m p T S .图4 o m p A-o m p T S融合基因O v e r l a p P C R电泳图2.4 重组表达质粒p E T28a-O m p A-O m p T S的构建及鉴定克隆得到融合基因o m p A-o m p T S后,通过限制性内切酶消化后与表达质粒p E T28a进行重组连接,并转化至宿主大肠杆菌B L21(D E3)中,于含有卡那霉素的抗性平板上培养,挑选克隆子,并利用p E T28a表达载体通用引物进行菌落P C R验证,结果如图5所示.可以看到,挑选的7个克隆中有6个扩增得到大小为2300b p左右(即融合片段与通用引物在表达载体自身克隆片段之和)的特异性片段,即为阳性克隆,对其进行保种并进行测序分析,测序结果显示阳性克隆株中含有成功连接了融合片段o m p A-o m p T的重组表达质粒. 2.5 O m p A-O m p T S融合蛋白诱导表达分析将p E T28a-O m p A-O m p T S质粒转化大肠杆菌B L21(D E3)得到B L21/p E T28a-O m p A-㊃821㊃第6期刘望等:嗜水气单胞菌外膜蛋白原核表达及其免疫保护性研究图5 含重组表达质粒p E T 28a -O m p A -O m p T S 阳性克隆菌株的P C R 鉴定O m pT S 重组菌,随后对其重组蛋白的表达条件进行了优化.结果发现重组表达菌株在培养2h 后添加I P T G1mM ,16℃下培养16h 经诱导后,与未经诱导重组菌全蛋白电泳条带相比,在相对分子质量约80k D a 处有一条表达量较高的蛋白条带,大小与O m p A -O m p T S 融合蛋白相符,说明O m pA -O m pT S 融合蛋白成功表达(如图6所示).MW :蛋白质分子量标准;1:I P T G 诱导后的p E T 28a/B L 21;2:诱导16h 后的p E T 28a -o m p A -o m p T S /B L 21;3:诱导前的p E T 28a -o m p A -o m p T S /B L 21重组质粒图6 O m p A -O m pT S 融合蛋白重组表达S D S -P A G E 电泳分析2.6 O m p A -O m pT S 融合蛋白的纯化为了进行后续的免疫保护效果的测定,首先需要对重组表达蛋白进行分离纯化.将诱导表达后以包涵体形式存在的融合蛋白进行超声破碎,沉淀经洗涤后用盐酸胍缓冲液溶解重组蛋白,经N i 柱亲和纯化的蛋白进行梯度尿素复性,随后S D S -P A G E 进行检测.结果显示,纯化后可获得大小约为80k D a 的目的蛋白(如图7所示).图7 O m p A -O m pT S 融合蛋白的纯化2.7 融合蛋白O m p A -O m pT S 免疫保护性分析在利用纯化后的融合蛋白O m p A -O m p T S ㊁混合F I A 佐剂的融合蛋白以及对照分别对斑马鱼进行免疫后,用嗜水气单胞菌L S 01进行鱼体攻毒实验.试验鱼攻毒后第1天便出现死亡,第2天开始,F I A 和P B S 对照组出现大量死亡的情况,而免疫组O m p A -O m p T S 及O m p A -O m p T S+F I A 组斑马鱼的死亡情况则明显减少(如图8所示).P B S ㊁F I A ㊁O m p A -O m p T S 和O m p A -O m pT S+F I A 组连续观察7d 的累计死亡率分别为100%㊁93.33%㊁31.7%和16.7%.O m p A -O m p T S 和O m p A -O m p T S +F I A 组对于斑马鱼在抵抗嗜水气单胞菌攻毒时的相对保护率分别为68.3%和图8 嗜水气单胞菌攻毒斑马鱼累计死亡率㊃921㊃陕西科技大学学报第35卷82.1%.可见,经融合蛋白O m p A-O m p T S免疫后的斑马鱼可以较好地抵制嗜水气单胞菌的侵染,具有较好的免疫保护效果.3 结论嗜水气单胞菌是水产养殖,尤其是淡水鱼类一种重要的条件致病菌,每年因其感染所引起的病害给我国水产养殖业造成了巨大的经济损失.传统的抗生素防治手段因易造成耐药性和药物残留等问题已被国家禁止在水产养殖过程中使用.疫苗由于具有较好的免疫活性和环境友好等优点已成为目前病害防治领域研究的热点.很多研究表明,外膜蛋白具有良好的免疫原性,是研制基因工程疫苗的良好材料[13-15].本研究选取p E T28a作为表达载体,将通过O v e r l a p P C R进行融合的两个外膜蛋白O m p A和O m p T S进行重组表达.成功获得可高效表达融合蛋白的重组表达质粒,通过对融合蛋白分离和纯化后获得融合蛋白O m p A-O m p T S,并对其进行斑马鱼免疫保护性实验,结果发现该融合蛋白O m p A-O m p T S在不添加佐剂时对斑马鱼的免疫保护率达到68.3%,与F I A佐剂混合后免疫保护率可达82.1%,可较好地抵御嗜水气单胞菌病害的发生.本研究为嗜水气单胞菌亚单位疫苗的设计与开发奠定了一定的理论基础.但鉴于嗜水气单胞菌不同分离菌株间的毒力和致病性差异较大,该融合蛋白对斑马鱼的免疫保护效果只进行了针对L S01菌株攻毒的检测,而对于其它嗜水气单胞菌菌株的保护效果则需进一步的实验分析.同时,本研究只进行了两个外膜蛋白的融合表达,后续可进一步地筛选嗜水气单胞菌其它具有较高免疫原性的蛋白进行亚单位疫苗的构建,以期得到免疫效果更佳优良的疫苗.参考文献[1]V i v a s J,C a r r a c e d oB,R i a n oJ,e t a l.B e h a v i o r o f a l l A e r o-m o n a s h y d r o p h i l a a r o Al i v ev a c c i n e i nw a t e rm i c r o c o s m s [J].A p p l E n v i r o n M i c r o b i o l,2004,70:2702-2708. [2]李文艳.嗜水气单胞菌相关毒力基因的研究进展[J].安徽农业科学,2001,39(9):5060-5064.[3]江金伦.一起由嗜水气单胞菌引起腹泻的调查[J].上海预防医学,2010,22(1):31-32.[4]黄艳,韦小瑜,吴成梅,等.一起嗜水气单胞菌引起的食物中毒调查[J].中国食品卫生杂志,2012,24(4):391-393.[5]马群飞,陈伟伟,杨毓环.瓶装天然矿泉水嗜水气单胞菌污染情况调查[J].中国食品卫生杂志,2002,14(1):43-44.[6]崔树玉,温宪芹,赵克义,等.医疗用品中检出致病性嗜水气单胞菌的研究报告[J].中国卫生检验杂志,2005,15 (8):923-924.[7]F a n g H M,G eH,S i nY M.C l o n i n g c h a r a c t e r i z a t i o na n de x p r e s s i o nof A e r o m o n a s h y d r o p h i l a m a j o r a d h e s i o n[J].F i s hS h e l l f i s h i mm u n,2004,16:645-655.[8]L i u J,H u a n g SX,Z h a n g QJ.O u t e rm e m b r a n e p r o t e i n s: k e yp l a y e r s f o r b a c t e r i a l a d a p t a t i o n i nh o s t n i c h e s[J].M i-c r o b I n f e c t,2002,4(3):325-331.[9]P r o v e n z a n oD,L a u r i a n oC M,K l o s eK E.C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e r o l e o f t h eT o x R-m o d u l a t e d o u t e rm e m b r a n e p o r i n s O m p Ua n dO m p T i nV i b r i o c h o l e r a ev i r u l e n c e[J].JB a c-t e r i o l,2001,183(12):3652-3662.[10]周宇,周秋白.嗜水气单胞菌防控技术研究进展[J].生物灾害科学,2012,35(2):126-133.[11]张波,曾令兵,罗晓松,等.嗜水气单胞菌3种疫苗免疫的青鱼外周血免疫指标的变化[J].华中农业大学学报, 2012,31(1):100-105.[12]R a h m a n M H,K a w a iK.O u t e r m e m b r a n e p r o t e i n so fA e r o m o n a sh y d r o p h i l a i n d u c e p r o t e c t i v ei mm u n i t y i ng o l d f i s h[J].F i s hS h e l l f i s hI mm u n o l,2000,10(4):379-382.[13]郑宗林,郑曙明,D e l b e r tM G,等.嗜水气单胞菌外膜蛋白o m p A基因的原核表达及免疫保护性研究[J].淡水渔业,2015,45(5):3-10,28.[14]赵金平,段丽华,郭松林.鳗鲡病原菌外膜蛋白三联表达载体的构建㊁表达与表达产物的纯化[J].华中农业大学学报,2015,34(3):104-110.[15]刘玮,倪穗,邱军强,等.嗜水气单胞菌B Y-K A H2008A C株外膜蛋白和溶血素双基因的融合表达及免疫原性分析[J].生物学杂志,2012,29(4):17-21.【责任编辑:陈佳】㊃031㊃。

拟态弧菌外膜蛋白OmpU基因的克隆表达及其免疫保护性研究的开题报告

拟态弧菌外膜蛋白OmpU基因的克隆表达及其免疫
保护性研究的开题报告
一、研究背景
拟态弧菌是一种常见的水生病原体，能引起鱼类、贝类等水生动物的感染，因此对于拟态弧菌的研究具有重要意义。

外膜蛋白OmpU是拟态弧菌的一种主要致病因子，可以激发宿主免疫反应，因此研究OmpU 对于对抗拟态弧菌感染具有重要意义。

二、研究目的
本研究旨在克隆表达拟态弧菌OmpU基因，并探讨其在免疫防御中的保护作用和机制，为深入研究拟态弧菌感染机制和疫苗研究提供理论和实验基础。

三、研究内容和方案
1. 克隆拟态弧菌OmpU基因
通过PCR扩增、T-A克隆和测序等技术，构建OmpU基因的全长表达质粒。

2. 表达和纯化OmpU蛋白
将OmpU基因重组表达到大肠杆菌中，并进行纯化和鉴定，获得高纯度的OmpU蛋白。

3. 免疫保护性实验
选用小鼠或鱼类作为实验动物，分别接种OmpU蛋白并进行注射、灌胃或浸泡等处理，评估其保护效果和机制。

四、预期成果及意义
本研究预期获得以下成果：
1. 成功克隆和表达拟态弧菌OmpU基因；
2. 成功获得高纯度的OmpU蛋白；
3. 探讨OmpU蛋白在免疫保护性中的作用和机制，为疫苗研究提供理论和实验基础。

本研究成果可为深入研究拟态弧菌感染机制、疫苗研究和水产养殖安全提供重要理论和实验基础。

鲍曼不动杆菌外膜蛋白OmpA的原核表达及保守性分析

ＴｈｅｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎＡａｎｄｉｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔｒａｉｎｓＯｆＡｃｉｎｅｔ０ｂａｃｔｅｒｂａｕｍａｎｎｉｉ
ｂｌｏｔ．Ｓｕｒｖｉｖａｌｔｉｍｅｏｆｍｉｃｅｗａｓｏｂｓｅｖｅｒｄｔｏｔｅｓｔｔｈｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｏｆｖａｃｃｉｎｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＴｈｅｐＥＴ２８（ａ）・ＯｍｐＡｐｌａｓｍｉｄｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｎｄ
张小姣曹炬黄世峰张莉萍（重庆医科大学附属第一医院检验科，重庆４０００１６）
Ａ文章编号１０００－４８４Ｘ（２０１３）０９－０９６９－０５
中国图书分类号［摘
Ｒ３７８．９９
ｔｅｄ，ｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｎｄｉｎｄｕｃｅｄｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＢＬ２１，ｔｈｅｎｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｐｕｉｆｒｉｅｄｂｙｎｉｃｋｅｌＣｏｌｕｍｎ；２０ｃｌｉｎｉｃａｌＡｅｉｎｅｔｏ —

一种嗜水气单胞菌疫苗候选外膜蛋白的制备方法及应用[发明专利]

专利名称：一种嗜水气单胞菌疫苗候选外膜蛋白的制备方法及应用
专利类型：发明专利
发明人：林向民,郭壮,林文雄,李薇,汪玉倩
申请号：CN201810559647.6
申请日：20180602
公开号：CN108753798A
公开日：
20181106
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供一种嗜水气单胞菌疫苗候选外膜蛋白的制备方法及应用，设计外膜蛋白基因克隆引物；通过原核重组，利用体外PCR扩增技术，扩增目的基因片段，构建pET32a原核表达载体重组质粒，转化重组质粒至BL21感受态，获得高表达菌株；通过IPTG诱导剂诱导高表达OMP P5蛋白并通过Ni‑NTA树脂柱纯化该表达蛋白；纯化后的外膜蛋白与弗氏不完全佐剂以1:1体积比完全乳化，所得样品即作为嗜水气单胞菌疫苗的疫苗蛋白。

本发明中采用嗜水气单胞菌亚单位疫苗（外膜蛋白）可获得90%以上免疫保护率，相比于传统疫苗，亚单位疫苗具有毒副作用低、免疫原性强和持续时间长、抗体效价高等优点。

申请人：福建农林大学
地址：350002 福建省福州市仓山区上下店路15号
国籍：CN
代理机构：福州元创专利商标代理有限公司
代理人：蔡学俊
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嗜水气单胞菌铁离子限制下差异外膜蛋白质组学及其免疫保护性评价

嗜水气单胞菌铁离子限制下差异外膜蛋白质组学及其免疫保护性评价嗜水气单胞菌（Aeromona hydrophila）是一种典型的人-鱼-兽共患病的条件致病菌,可引发鱼类患出血性败血症。

每年由于该菌导致的流行性疾病给水产养殖业造成巨大的经济损失,严重阻碍着养殖业的发展。

在养殖业中,针对该菌引发的疾病,常见的防治措施是抗生素防治,导致细菌的耐药性日益增强。

近年来由于疫苗相关技术的快速发展,以及其高效的抑菌或杀菌效果,使之正成为替换抗生素的重要防治措施之一。

但是当前疫苗的种类并不多,制约着疫苗的广泛使用。

因此,寻找具有免疫原性的保护蛋白,开发新型疫苗,对防治该菌引发的疾病以及抑制其耐药性的蔓延具有重要的现实意义。

以往文献报道,细菌的外膜蛋白组分可作为鱼类疫苗的候选蛋白,但多集中在对体外营养富集培养基中表达量较高的少数几个外膜蛋白的研究上,对自然条件下表达的外膜蛋白免疫保护性质研究较为缺乏。

而细菌在入侵宿主时,往往处于局部缺铁的环境中,细菌表达特定外膜蛋白并在与宿主竞争铁离子或者参与细胞内部铁离子平衡中起重要的生物学功能。

对这些相关外膜蛋白在缺铁环境中的表达及免疫保护特性的研究,有望成为候选蛋白,为当前新型疫苗的开发提供有效候选抗原。

本研究利用定量蛋白质组学和分子生物学方法,模拟自然条件下的缺铁环境,分析嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophilia）在正常和缺铁培养基中外膜蛋白的变化差异。

采用TMT标记与质谱联用的方法比较两种状态下的月桂酰肌氨酸钠不溶性蛋白组分,共鉴定到682个蛋白,发现有174个表达差异蛋白,其中91个上调表达和83个下调表达,并分别包含21个和10个外膜蛋白。

结合生物信息学分析发现,下调蛋白中多数是核糖体蛋白,其主要功能是参与RNA聚合;而上调蛋白主要是铁载体受体蛋白、铁色素载体受体、血红素受体等外膜蛋白以及一些参与抗生素和次生代谢产物合成的蛋白。

为验证外膜蛋白在铁离子限制条件下的变化,本论文运用分子生物学技术对AHA0972（A0KGW8）、AHA427（A0KQZ1）、AHA3963（A0KQ46）、AHA0461（A0KFG8）和AHA1663（A0KIU8）等五个外膜蛋白的相应基因进行体外PCR扩增,利用pET-32a原核表达载体构建相应的重组质粒,成功克隆并获得了高表达菌株。

创伤弧菌与嗜水气单胞菌二联外膜蛋白基因表达产物的免疫原性研究

创伤弧菌与嗜水气单胞菌二联外膜蛋白基因表达产物的免疫原性研究鳗鲡是我国重要的经济养殖鱼类,但大规模集约化的养殖方式使得鳗鲡病害发生日益频繁,其中细菌性疾病是造成养殖鳗鲡重大损失的主要病原菌。

细菌性疾病种类繁多,因而只针对单一菌种研制的鳗鲡亚单位疫苗常存在保护效率偏低、有效保护范围有限等问题,难以在水产养殖实践中推广。

在本课题组已有的研究基础上,此次试验选取病原性创伤弧菌和嗜水气单胞菌作为代表菌株,通过基因提取试剂盒提取细菌基因组DNA,参考GenBank数据库中已提交的创伤弧菌和气单胞菌外膜蛋白基因序列设计引物,PCR克隆获得病原性创伤弧菌OmpU和嗜水气单胞菌Ⅱ型孔蛋白的基因全长序列。

经序列分析后选取外膜蛋白基因所表达的膜外多肽基因序列,通过融合PCR连接两个外膜蛋白基因片段、构建表达载体（pGEX-2T-His-Vibrio-Aero）并进行高效表达;表达产物经纯化后免疫美洲鳗鲡,通过对溶菌酶含量、全血细胞刺激指数、血清抗体效价以及攻毒感染后免疫保护率的测定研究其免疫原性。

研究方法与获得的主要结果如下:1.据GeneBank数据库已提交的创伤弧菌和嗜水气单胞菌全长序列中外膜蛋白基因序列左右两端设计引物,继而利用已提取的基因组DNA模板进行创伤弧菌、嗜水气单胞菌外膜蛋白基因全长的扩增。

测序100%正确后利用相关蛋白分析软件对两种外膜蛋白基因的亲水性、免疫原性及其结构进行预测,在此基础上选取免疫原性与亲水性均较好的基因序列。

采用“两步法”融合PCR技术对两个外膜蛋白基因片段进行体外连接。

依据表达载体（pGEX-2T-His）的限制性酶切位点序列,在已连接外膜蛋白基因两端引入限制性酶切位点BamHⅠ和EcoRⅠ,成功构建二联外膜蛋白基因工程重组表达载体（pGEX-2T-His-Vibrio-Aero）。

在大肠杆菌（BL21）浓度OD600nm为0.6-1.0时,采用1.0 mM IPTG 诱导剂,16℃过夜诱导表达。

鳗源嗜水气单胞菌主要外膜蛋白基因克隆及其表达

鳗源嗜水气单胞菌主要外膜蛋白基因克隆及其表达欧阳岁东;林天龙;陈孝煊;俞伏松;龚晖;陈红燕;方勤美【期刊名称】《水产学报》【年(卷),期】2006(30)4【摘要】嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila，AH）普遍存在于淡水，污水及土壤中，是一种人兽共患病菌，对淡水养殖动物的危害尤为严重，是引起鱼类暴发性疾病的重要病原之一。

由于此菌抗原成分复杂，存在众多血清型，不同地区流行的菌株在毒力和免疫原性方面存在着明显差异，灭活疫苗的使用受到限制，商品化生产不理想。

因而关键在于能否找出此嗜水气单胞菌的共同保护性抗原，以制备针对不同血清型菌株均有保护性的疫苗。

【总页数】5页(P566-570)【作者】欧阳岁东;林天龙;陈孝煊;俞伏松;龚晖;陈红燕;方勤美【作者单位】福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建,福州,350003;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建,福州,350003;华中农业大学水产学院,湖北,武汉,430070;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建,福州,350003;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建,福州,350003;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建,福州,350003;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建,福州,350003【正文语种】中文【中图分类】S917【相关文献】1.鳗源嗜水气单胞菌L316主要外膜蛋白基因克隆和序列分析 [J], 欧阳岁东;林天龙;龚晖;董传甫;俞伏松2.鳗源嗜水气单胞菌主要粘附素基因克隆表达及产物粘附功能分析 [J], 庄培德;杨金先;吴学敏;龚晖;林天龙3.猪源嗜性衣原体HB1043株主要外膜蛋白(MOMP)基因的分析及重组表达 [J], 闫少侠;田永祥;刘泽文;袁芳艳;郭锐;段正赢;杨克礼;孟丽;周丹娜4.鱼源嗜水气单胞菌外膜蛋白基因ompTS在枯草芽胞杆菌中的表达及检测 [J], 罗晓松;侯化鹏;尚书;汪登强;邹世平;龙良启5.鳗源嗜水气单胞菌β-溶血素基因的克隆及表达 [J], 龚晖;林天龙;俞伏松;董传甫;陈日升;杨金先;陈振海因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

嗜水气单胞菌温敏胞外蛋白酶活性片段的表达和对小鼠的免疫试验

嗜水气单胞菌温敏胞外蛋白酶活性片段的表达和对小鼠的免疫试验任燕;陆承平;姚火春【期刊名称】《农业生物技术学报》【年(卷),期】2006(14)6【摘要】为确定嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)J-1株温敏胞外蛋白酶EprJ1的表达产物是否具有酶活性和抗原性及测定对小鼠的相对保护率,根据eprJ1基因ORF阅读框的序列设计1对引物,扩增出不含信号肽序列的EprJ1成熟蛋白结构基因(850bp),经EcoRⅠ/SalⅠ双酶切后连接pET-32a(+),转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21.在30℃经IPTG诱导后,重组菌冻融液在脱脂奶平板上经28℃和24 h孵育检测有透明溶蛋白圈出现,经56℃和30 min处理后则无.纯化的重组蛋白免疫哌小鼠后,用1.0× 107cfu的Ah J-1(50LD50)腹腔注射攻击小鼠,重组蛋白对小鼠的相对保护率可达60%.免疫印迹显示,Ah J-1胞外产物的抗血清可以识别该融合蛋白,但AhJ-1的热稳定胞外蛋白酶ECPase54抗血清不能识别该融合蛋白.重组蛋白分子量约53.2 kD,有温敏蛋白酶活性和抗原性.【总页数】4页(P875-878)【作者】任燕;陆承平;姚火春【作者单位】南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点实验室,南京,210095;南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点实验室,南京,210095;南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点实验室,南京,210095【正文语种】中文【中图分类】S188【相关文献】1.嗜水气单胞菌Aer毒素和胞外蛋白酶卵黄抗体的制备 [J], 王帅兵;熊良伟;朱善元;于生兰;徐建生;吴海波2.嗜水气单胞菌温敏胞外蛋白酶基因eprJ的克隆与检测 [J], 任燕;陆承平;姚火春3.嗜水气单胞菌不同分离株生化特性及胞外蛋白酶的检测 [J], 王春林;曹雪;刘晓丹;郭垆璞;胡婷;倪晓丹;刘永杰;陆承平4.脱脂奶溶蛋白琼脂扩散抑制试验检测兔血清中嗜水气单胞菌胞外蛋白酶的抗体[J], 朱杰青;吉传义;陆承平5.培养条件对嗜水气单胞菌胞外蛋白酶合成与分泌的影响 [J], 储卫华;陆承平因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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组表达质粒ｐＥＴ一３２ａ（＋）一ｐｏｍｐＡ；然后将该质粒转入ＢＬ２Ｉ（ＤＥ３）后用ＩＰＴＧ诱导表达，经纯化后得到ｐｏｍｐＡ
重组蛋白；最后将ｐｏｍｐＡｏｍｐＡ蛋白与弗氏不完全佐剂（ＦＩＡ）混合免疫斑点叉尾鲴，评价其免疫效果。结果显示：克隆的嗜水气单胞菌ｐｏｍｐＡ基因全长为９６０ｂｐ，编码３１９个氨基酸，融合表达的重组蛋白相对分子质量约为５３，
郑宗林，郑曙明，ＤｅｌｂｅｒｔＭ．ＧａｔｌｉｎＩＩＩ，汪开毓
（１．水产动物繁育和健康养殖研究中心，西南大学荣昌校区，重庆荣昌４０２４６０；
２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＷｉｌｄｌｉｆｅａｎｄＦｉｓｈｅｒｉｅｓＳｃｉｅｎｃｅｓａｎｄＦａｃｕｌｔｙｏｆＮｕｔｒｉｔｉｏｎ，ＴｅｘａｓＡ＆ＭＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｙｓｔｅｍ，ＣｏｌｌｅｇｅＳｔａｔｉｏｎ，Ｔｅｘａｓ７７８４０ —２２５８，ＵＳＡ；
６７０ｋＤａ；ＦＩＡ能够提高斑点叉尾鲴的溶菌酶活性、ＡＣＨ５０活性、头肾巨噬细胞呼吸暴发活性；ｐｏｍｐＡ组抗体水平在第４周达到峰值，ＦＩＡ免疫组抗体水平在第５周达到峰值，且ＦＩＡ能够显著提高斑点叉尾鲴的抗体水平；攻
Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４０２４６０，Ｃｈｉｎａ；
２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＷｉｌｄｌｆｉｅａｎｄＦｉｓｈｅｒｉｅｓＳｃｉｅｎｃｅｓａｎｄＦａｃｕｌｔｙｆｏＮｕｔｒｉｔｉｏｎ，ＴｅｘａｓＡ＆ＭＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｙｓｔｅｍ，ＣｏｌｌｅｇｅＳｔａｔｉｏｎ，
关键词：嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）；ｏｍｐＡ；亚单位疫苗；斑点又尾鲴（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓｐｕｎｃｔａｔｕｓ）；免疫效果
中图分类号：￥９１７．４文献标识码：Ａ文章编号：１０００－６９０７一（２０１５）０５ — ０００３－０８
毒后各组累计死亡率分别为９３．３３％（ＰＢＳ）、９３．３３％（ＦＩＡ）、５０．００％（ｐｏｍｐＡ）和１３．３３％（ＦＩＡ＋ｐｏｍｐＡ），ｐｏｍｐＡ
和ＦＩＡ＋ｐｏｍｐＡ组相对保护率分别为４６．４３％和８５．７１％；免疫组靶器官中的细菌数量显著低于对照组，且ＦＩＡ＋ｐｏｍｐＡ细菌含量最低。说明ｐｏｍｐＡ可以作为一个亚单位疫苗候选疫苗，而ＦＩＡ佐剂能较好的增强亚单位疫苗的免疫效果。
３．四川农业大学动物医学院，成都
６２５０１４）
摘要：为评价嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ，Ａｈ）ＰＤＫ０６株外膜蛋白Ａ（ｏｍｐＡ）的原核表达产物是否具有抗原性及其对斑点叉尾鲴（１ｃｔａｌｕｒｕｓｐｕｎｃｔａｔｕｓ）的免疫保护力，根据ＧｅｎＢａｎｋ上嗜水气单胞菌外膜蛋白ｏｍｐＡ基因序列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＡＦ１４６５９７）设计去信号肽引物，扩增获得一段约１０００ｂｐ的序列，经鉴定正确后，构建重
ＰｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎＡ
（ｏｍｐＡ）ｇｅｎｅｏｆＡｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａａｎｄｉｔｓｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ
第４５卷
Ｖｏ１．４５
第５期
Ｎｏ．５
淡
水月
Ｓｅｐ．２０１５
ＦｒｅｓｈｗａｔｅｒＦｉｓｈｅｒｉｅｓ
嗜水气单胞茵外膜蛋白ｏｍｐＡ基因的原核表达及免疫保护性研究
ＺＨＥＮＧＺｏｎｇ — ｌｉｎ，．＿，ＺＨＥＮＧＳｈｕ — ｕｉｒｎｇ，ＤｅｌｂｅｒｔＭ．ＧａｔｌｉｎＩＩＩ，ＷＡＮＧＫａｉ — ｙｕ
（１．ＦｉｓｈｅｒｉｅｓＢｒｅｅｄｉｎｇａｎｄＨｅａｌｔｈｙＣｕｌｔｉｖａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｒｅ，ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，