激光共聚焦显微术的应用
激光共聚焦显微技术在药学研究中的应用
激光共聚焦显微技术在药学研究中的应用
激光共聚焦显微技术（CLSM）是一种高分辨率、非侵入性的镜下成像技术，被广泛应用于生物医学研究中。
在药学研究中，CLSM可以用于药物释放过程的实时监测、药物靶向性的研究、药物毒性的测试等方面，其应用越来越受到关注。
首先，CLSM可以用于药物释放过程的实时监测。
药物释放过程是药物输送系统的重要研究方向之一。
CLSM可以使用荧光标记的药物或载体材料进行成像，实时监测其释放过程。
通过定量分析释放曲线，可以评估药物的释放速率和累积释放量，从而了解药物输送系统的性能。
其次，CLSM可以用于药物靶向性的研究。
药物靶向性是提高药物治疗效果的重要手段之一。
通过制备靶向药物纳米粒子或高分子材料，并在其表面修饰靶向分子，CLSM可以直观观察药物在细胞或组织中的分布情况。
从而了解药物在靶标区域的浓度分布，为评估药效和药物的副作用提供参考。
最后，CLSM可以用于药物毒性的测试。
药物毒性评价是药物开发过程中不可或缺的一环。
CLSM可以利用涂片、细胞培养等方法，将药物暴露于细胞或组织中，通过成像分析药物诱导的生物标志物变化，确定其毒性。
同时，CLSM还可以用于药物代谢和药效动力学的研究，为药物安全性评价提供科学数据。
总之，CLSM在药学研究中的应用具有广泛的前景和应用价值。
未来，我们可以通过进一步的技术创新，不断提高CLSM的成像分辨率和成像速度，为药物研发提供更加精准、快速、可靠的检测手段。
激光共聚焦显微镜系统的原理和应用
激光共聚焦显微镜系统的原理和应用激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起来的一项具有划时代的高科技产品，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率提高了30%--40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察诸如Ca2+ 、PH值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。
激光共聚焦成像系统能够用于观察各种染色、非染色和荧光标记的组织和细胞等，观察研究组织切片，细胞活体的生长发育特征，研究测定细胞内物质运输和能量转换。
能够进行活体细胞中离子和PH值变化研究（RATIO），神经递质研究，微分干涉及荧光的断层扫描，多重荧光的断层扫描及重叠，荧光光谱分析荧光各项指标定量分析荧光样品的时间延迟扫描及动态构件组织与细胞的三维动态结构构件，荧光共振能量的转移的分析，荧光原位杂交研究（FISH），细胞骨架研究，基因定位研究，原位实时PCR产物分析，荧光漂白恢复研究（FRAP），胞间通讯研究，蛋白质间研究，膜电位与膜流动性等研究，完成图像分析和三维重建等分析。
一.激光共聚焦显微镜系统应用领域：涉及医学、动植物科研、生物化学、细菌学、细胞生物学、组织胚胎、食品科学、遗传、药理、生理、光学、病理、植物学、神经科学、海洋生物学、材料学、电子科学、力学、石油地质学、矿产学。
二.基本原理传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光点倍增管（PMT）或冷电耦器件（cCCD）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。
照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。
共聚焦的原理和应用是什么
共聚焦的原理和应用是什么1. 共聚焦原理共焦显微镜（confocal microscopy）是由澳大利亚物理学家Minsky于1955年提出的一种新型显微镜技术。
它通过单个点的照射和探测，有效地降低了背景噪声，提高了图像的空间分辨率。
共焦显微镜利用点光源和反射镜进行扫描，在光的聚焦和扫描过程中通过孔径控制来排除掉除焦平面外的光，将真实的焦点信息转化为高质量的图像。
共焦显微镜的工作原理可以分为光源系统、荧光探测系统和扫描装置三个部分。
•光源系统：常见的共焦显微镜光源主要有白光光源、激光光源和LED光源。
光源系统提供高质量、稳定的光源，为荧光显微镜提供强光照明。
•荧光探测系统：荧光探测器用于检测样本激发后发出的荧光信号。
常见的荧光探测器有光电二极管（photomultiplier tubes，PMT）和光电倍增管（avalanche photodiode，APD）。
•扫描设备：扫描设备主要包括物镜组件、扫描镜组件和侦测系统。
其中，物镜组件主要用于调焦和聚焦光束，扫描镜组件用于控制束点的位置，侦测系统用于收集和记录样本发出的荧光信号。
2. 共聚焦应用共焦显微镜作为一种高分辨率的显微成像技术，被广泛应用于生物学、医学和材料科学等领域，为科研人员提供了更准确、清晰的样本图像。
2.1 生物学应用共焦显微镜在生物学研究中的应用非常广泛。
它可以用于细胞观察、染色体分析、蛋白质定位等研究领域。
•细胞观察：共焦显微镜可以观察到细胞的形态结构、内部器官以及细胞分裂等细胞生物学过程。
•染色体分析：通过染色体荧光探针标记，可以对染色体结构和组织的分布进行观察和分析。
•蛋白质定位：共焦显微镜结合荧光染料可以实现对蛋白质的定位和跟踪，进一步研究蛋白质功能和相互作用。
2.2 医学应用共焦显微镜在医学领域具有重要的应用价值。
它可以用于医学诊断、药物研发和真菌感染等研究。
•医学诊断：共焦显微镜结合荧光探针可以对疾病的早期诊断和治疗提供重要的依据。
共聚焦显微镜原理和应用范围
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。
把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。
1激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）的原理从基本原理上讲,共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜,它对普通光镜从技术上作了以下几点改进:1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。
1．2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板,将焦平面以外的杂散光挡住,消除了球差;并进一步消除了色差1．3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。
而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。
这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。
1．4用计算机采集和处理光信号,并利用光电倍增管放大信号图在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。
而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号放大,灵敏度大大提高。
由于综合利用了以上技术。
可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。
2ＬＳＣＭ在生物医学研究中的应用目前,一台配置完备的ＬＳＣＭ在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜,它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合,如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ＰＨ)、微分干涉差显微镜(ＤＩＣ)等,因此被称为万能显微镜,通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。
共聚焦显微镜的应用
共聚焦显微镜的应用共聚焦显微镜是一种常见且广泛应用于生物学、材料科学和其他领域的先进显微镜技术。
它通过使用一种特殊的激光光束和精确的光学系统，可以获取高分辨率和高对比度的显微图像。
共聚焦显微镜的原理是利用聚焦在样本上的激光光束与样本中的荧光信号进行交互，然后通过成像系统收集并转换这些信号为可视化的图像。
共聚焦显微镜的应用范围非常广泛。
下面，我将从多个角度讨论共聚焦显微镜在不同领域的应用。
1. 生物学中的应用：共聚焦显微镜在生物学研究中具有重要作用。
它可以提供高分辨率的细胞和组织结构图像。
在细胞生物学中，共聚焦显微镜可以用于观察细胞内蛋白质、细胞器和细胞核等结构的分布和运动。
共聚焦显微镜还可以用于观察细胞分裂过程、细胞内信号传导和细胞凋亡等关键生物学过程。
2. 材料科学中的应用：在材料科学领域，共聚焦显微镜被广泛应用于材料的表征和分析。
它可以提供高分辨率的表面形貌和内部结构信息。
在材料表面缺陷分析中，共聚焦显微镜能够观察到微观缺陷的形貌和位置。
共聚焦显微镜还可用于材料的化学成分分析和荧光标记探针的检测。
3. 医学领域中的应用：在医学领域，共聚焦显微镜可用于细胞和组织的诊断和研究。
在癌症研究中，共聚焦显微镜可以观察到癌细胞的形貌和分布，从而帮助医生确定病情和制定治疗方案。
共聚焦显微镜还可以用于血液和生物标本的显微观察，以及对药物在体内的分布和代谢过程的研究。
总结回顾：共聚焦显微镜是一种在生物学、材料科学和医学领域具有广泛应用的先进显微镜技术。
它通过高分辨率和高对比度的显微图像提供了对样本的详细观察。
在生物学中，共聚焦显微镜可以用于观察细胞结构、蛋白质分布和细胞内过程。
在材料科学中，共聚焦显微镜广泛应用于材料的表征和分析。
在医学领域，共聚焦显微镜对癌症诊断和研究具有重要意义。
通过综合利用共聚焦显微镜的特点和功能，我们可以更深入地理解和研究生物、材料和医学等领域的重要问题。
观点和理解：共聚焦显微镜作为一项先进的显微镜技术，为我们提供了探索微观世界的窗口。
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。
把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。
1 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）的原理从基本原理上讲,共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜,它对普通光镜从技术上作了以下几点改进:1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。
1．2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板,将焦平面以外的杂散光挡住,消除了球差;并进一步消除了色差1．3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。
而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。
这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。
1．4用计算机采集和处理光信号,并利用光电倍增管放大信号图在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。
而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号放大,灵敏度大大提高。
由于综合利用了以上技术。
可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。
2 ＬＳＣＭ在生物医学研究中的应用目前,一台配置完备的ＬＳＣＭ在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜,它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合,如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ＰＨ)、微分干涉差显微镜(ＤＩＣ)等,因此被称为万能显微镜,通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。
激光共聚焦显微镜技术
Cell culture, 3D shadow projection showing tight junctions (red) and cytoskeleton structures (green)
Mitose - Tubulin (FITC), DNA (PJ)
细胞内钙离子PH值和其它离子的 动态分析
细胞定量荧光测定
显微荧光光度计由于显微镜和激发光源的限制成象模糊，只能测定细胞内的 荧光总量，有一定的误差。LSCM以激光为光源，对细胞分层扫描，单独测定，经 积分后能得到细胞荧光的准确定量，重复性极佳。它适于活细胞的定量分析，可 测定细胞内溶酶体、线粒体、DNA含量、RNA含量、酶和结构性蛋白质等物质含量 和分布，常用于原位分子杂交，肿瘤细胞识别，单个活细胞水平的DNA损伤及修 复的定量分析。它适于快速高灵敏度测量，减少光粹灭的影响，在定量免疫荧光 测定方面应用广泛，如作各种肿瘤组织切片抗原表达的定量分析，监测肿瘤相关 抗原表达的定位定量信息，监测药物对肌体免疫功能的作用，监测自身免疫性疾 病的多种抗原及药物对肌体免疫功能的作用，监测细胞结合和杀伤的形态特征并 作定量分析等。细胞定量荧光测定可选用单荧光、双荧光和三荧光方式，能自动 测定细胞面积，平均荧光强度，积分荧光强度及形状因子等多种参数。
LSCM的结构特点
激光光源
LSCM使用的激光光源有单激光和多激光系统。氪氩离子激光器是可见光范围 内使用的多光谱激光，发射波长488nm、568nm和647nm分别为蓝光、绿光和红 光，大功率氩离子激光器是紫外和可见光混合激光器，发射波长为351－364nm、 488nm和514nm分别为紫外光、蓝光和绿光，单个激光优点是安装方便，光路简 单，但价格较贵并存在不同激光之间的光谱竞争和色差校正问题。多激光器系统 在可见光范围使用氩离子激光器，发射波长为 488nm和514nm的蓝绿光，氦氖激 光器发射波长为633nm的红光，紫外光选用氩离子激光器，波长为351－364nm。 其优点是各谱线激光单独发射，不存在谱线竞争的干扰，调节方便。
激光共聚焦显微镜的原理和应用讲解
激光共聚焦显微镜的原理和应用李楠王黎明杨军关键词激光; 显微镜; 原理和作用中国图书资料分类法分类号R 318. 51激光共聚焦显微镜是80年代发展起来的一项划时代意义的高科技新产品, 它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置, 利用计算机进行图象处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象, 在亚细胞水平上观察诸如Ca 2+、pH 值, , 成为形态学, , , 学, 1994, 了目前世界次最高, 功能最全的美国M eridian 公司的产品:A cas 系列U lti m a 型和扫描速度最快的In sigh t 型两台激光共聚焦仪。
仪器自1995年5月份到货安装以来, 已为我院7个科室的10个课题所应用, 目前主要开展的研究内容有:(1 细胞内游离钙的实时监测; (2 细胞通讯的研究; (3 细胞形态学的研究。
1基本原理和功能1. 1基本原理传统的光学显微镜使用的是场光源, 标本上每一点的图象都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰; 激光共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描, 标本上的被照射点, 在探测针孔处成像, 由探测针孔后的光电倍增管(PM T 或冷电耦器件(cCCD 逐点或逐线接收, 迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图象。
照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭作者单位解放军总医院实验仪器中心, 北京100853的, 焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔, 焦平面以外的点不会在探测针孔处成像, 这样得到的共聚焦图象是标本的光学横断面, 克服了普通显微镜图象模糊的缺点。
在显微镜的载物台上加一个微量步进马达, 可使载物台上下步进移动, 最小步进距离为的0. 1Λm , 能清楚地显示, 实现了的目的, 这就是21. . CT ”功能通过狭缝扫描技术将我们对细胞的研究由多层迭加影像推进到真正的平面影像水平, 使图像更加清晰, 从而为分子细胞生物学的深入研究拓宽了视野。
激光共聚焦扫描显微镜用途
激光共聚焦扫描显微镜用途激光共聚焦扫描显微镜（Laser Scanning Confocal Microscopy, LSCM）是一种高分辨率的成像技术，主要用于对细胞、组织和材料进行非破坏性的三维成像和分析。
它通过使用激光束扫描样品，获取高质量的荧光图像，并通过计算机处理和重建，实现对样品的横向和纵向解剖结构的可视化。
1.生物医学研究：激光共聚焦显微镜可用于观察活细胞的形态、结构和功能。
通过标记细胞的一些结构或分子，可以观察细胞器官的形态与位置、蛋白质的表达和分布、细胞的生理活动等。
同时，LSCM还可以进行细胞动力学研究，包括细胞迁移、分裂和凋亡等生物学过程。
2.神经科学研究：LSCM可以帮助神经科学家观察和研究神经元的形态和连接。
通过标记神经元的轴突和树突，可以实现对神经网络的全面观察和分析，从而揭示神经系统的组织构建和功能运作机制，并对神经退行性疾病和神经变性疾病的发生、发展和治疗提供重要参考。
3.组织学研究：激光共聚焦显微镜提供了对组织样本的高分辨率成像，在组织学研究中具有重要的应用前景。
可以观察和分析组织的细胞组织结构、器官形态、局部代谢情况等，进而探究组织发育、器官功能和疾病发展等问题。
4.生物材料分析：LSCM可用于研究生物材料的形态、结构和功能。
可以观察和分析材料的粒子分布、孔隙结构、表面性质、生物相容性等特征，从而用于材料的设计、制备和性能优化。
5.药物研究和药物筛选：激光共聚焦显微镜在药物研究和药物筛选中具有重要作用。
可以观察和分析药物的靶位结合情况、药物的进入细胞和细胞内分布、药物代谢等，从而揭示药物的作用机制和效应，对药物研发和药物筛选提供有力支持。
总之，激光共聚焦显微镜作为高分辨率的成像技术，在生命科学、材料科学和医学研究领域具有广泛应用前景。
通过对样本的高效成像和分析，可以揭示细胞和组织的细微结构和功能，进而促进研究人员对生命科学和材料科学的深入理解和应用发展。
激光共聚焦显微镜的用途
激光共聚焦显微镜的用途激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM）是一种高分辨率、高对比度的显微镜技术。
通过激光光源的激发和扫描，LSCM可以快速获取高质量的荧光图像，具有出色的三维成像能力。
下面将详细介绍LSCM的用途。
1.生物医学研究LSCM广泛应用于生物医学研究领域。
它可以对活体组织、细胞、蛋白质等进行实时观察和成像。
利用荧光探针标记的细胞、分子等在LSCM 下，可以观察到细胞器的结构和功能，探索细胞的生物学、病理学等方面的问题。
此外，LSCM还可以用于研究神经科学、免疫学和细菌学等领域，为相关疾病的诊断和治疗提供依据。
2.材料科学LSCM在材料科学研究中具有重要的应用价值。
它可以观察材料的微观结构、表面形貌和内部构造。
通过荧光染料标记或利用材料本身的荧光特性，可以研究材料的纳米结构、晶格缺陷、材料界面等特性。
LSCM还可以配合其他技术如拉曼光谱、傅里叶变换红外光谱等，进一步对材料进行分析和表征。
3.植物生物学LSCM在植物生物学研究中也起到关键作用。
通过激光共聚焦显微镜，可以观察到植物细胞的结构和功能，如叶片、根部、维管束等。
利用荧光标记技术，可以观察到植物的细胞器的分布和数量、蛋白质的表达和转运等。
此外，LSCM还可以用于研究植物的光合作用、生长发育等机制。
4.纳米科学LSCM在纳米科学领域也具有广泛应用。
它可以观察纳米材料的形貌、表面结构、聚集状态等。
利用纳米材料的特殊荧光性质，可以研究纳米颗粒的生长、聚集与分散、表面修饰等过程。
此外，LSCM还可以利用近场光学技术对纳米结构进行高分辨率成像，为纳米材料的设计与合成提供支持。
总之，激光共聚焦显微镜是一种用于观察微观结构和功能的强大工具。
在生物医学研究、材料科学、植物生物学和纳米科学等领域，LSCM发挥着重要的作用，为科学研究和技术应用提供了强有力的支持。
随着技术的不断进步，LSCM在未来的应用前景将更加广阔。
激光共聚焦显微镜
❖ 激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope）用激光作扫描光源，逐 点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧
光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的
聚焦点，也是瞬时成像的物点。由于激光束的波
长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有 较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。 系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。
❖ 4·孵化膜形成前,示卵子皮层中的两种皮层囊泡,一种内含致 密颗粒(CG1),另一种内含颗粒稀少(CG fore hatching envelope was formed, showing two kinds of cortical vesicles, one contained high-density granules
物学、胚胎学的活体研究及生理生化成份的动态变 化的研究中已有很大的1994; Jaffeet al.,1994;Lindsayetal.,1992;Malindaet
al.,1994; Sardetet al.,1992; Strickeret al.,1992; Shenet al.,1993),而其在甲壳动物研究中的应用相
❖ 线粒体(mitochondria) Y:卵黄颗粒(yolk granule) CG:皮层 颗粒(cortical granule)×4 800
❖ 3·孵化膜正在形成,显示刚形成的孵化膜(HE)、两种皮层颗粒 (CG1、CG2)、卵黄颗粒(Y) [Hatching was forming, showing hatching envelope (HE) as just formed with two kinds of cortical granules (CG1、CG2) granule (Y)]×4 800
激光共聚焦扫描显微镜及其在生物学上的应用
激光共聚焦扫描显微镜及其在生物研究中的应用一.激光共聚焦扫描显微镜（以下简称LSM）：1.利用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察分析对象进行数字图象处理的一套观察和分析系统。
2.主要系统组成：激光源、共聚焦显微镜（正置、倒置、透射、落射、荧光、微分干涉）、探测器（光电倍增管）、计算机以及数字图象输出设备（显示器、彩色打印机和照片幻灯片制作设备）。
二.LSM技术、原理和特点：对于一个在传统显微镜下观察的生物样品来说，其结构往往是非常复杂的，而且又互相重叠，给观察带来很大困难。
特别是在荧光显微镜观察中，由于荧光标记物质和自发荧光结构重叠，紧密合在一起，而传统落射荧光显微镜物镜不但收集来自焦平面的光线，而且还收集焦平面上下的散射光线，因此影响了光分辨率。
共聚焦成像仅检测反射自焦平面的光线部分，从而解决上述问题。
光源通过一个针孔使在焦平面上形成一个小而精细的光点，从焦平面上发射出的光线通过物镜收集，光束通过光束分离器，沿着光路返回，进入探测器，同样在进入探测器前也要通过一个针孔。
这种焦平面的几何共轭设计使来自焦平面的光点正好进入针孔会聚，而焦平面外的光束会聚于针孔板前或后，被阻挡不能通过针孔进入探测器。
探测到的就是来自焦平面的。
共聚焦显微镜的光分辨率以及Z轴上的光切厚度不但取决于光的波长，而且也决定于物镜的数值孔径和针孔的直径。
其中针孔孔径的大小与分辨率成反比。
通过精细平面光切，形成生物样品不同平面的精细图象，同时将一个连续的光切图象Z轴重叠就可形成一个三维图象。
另外，在同一平面上随时间进行连续扫描，就可分析细胞结构、内含、和标记等的动力学变化。
另外，为了适应目前生物医学研究技术的飞速发展，特别是各种荧光染料的运用，以及各种荧光蛋白家属标记的运用，多重荧光标记的生物样品观察。
现在最先进的激光共聚焦显微镜已经能够同时扫描这些多重标记的荧光标记，并加以精确的区分，同时也可以观察随时间变化，这些荧光标记由于各种生物学因素而产生的波长改变（具体见下述META技术简解），从而研究到组织和细胞内分子间的相互作用关系。
激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用
激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用一、激光扫描共聚焦显微镜的原理传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。
分光器将荧光直接送到探测器。
光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。
照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。
原理图二、激光扫描共聚焦显微镜组成特点LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。
显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。
通常有倒置和正置两种形式，前者在切片、活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。
三、激光扫描共聚焦显微镜的应用（一）细胞的三维重建普通荧光显微镜分辨率低，显示的图像结构为多层面的图像叠加，结构不够清晰。
LSCM能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A/D转换后作为二维数组贮存。
这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色或双色图像处理，组合成细胞真实的三维结构。
旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可从不同的断面观察细胞内部结构，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。
通过模拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。
通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。
LSCM的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。
激光共焦显微技术在生物学中的应用
激光共焦显微技术在生物学中的应用生物学研究是一门复杂的学科，需要运用到各种物理、化学、生物学的知识。
其中，显微镜技术作为一种非常重要的工具在生物学领域中得到了广泛的应用。
而激光共焦显微技术作为一种非常先进的显微技术，其在生物学中的应用也越来越广泛。
激光共焦显微技术是目前最先进的生物学显微技术之一，它可以在非常短的时间内对生物样本进行高分辨率成像，从而获取高质量的生物学图像。
与传统的荧光显微镜技术相比，激光共焦显微技术使用的激光光源呈现了更高的光亮度和更窄的光谱带宽，因此，它能够更精确地探测生物样本中的分子信号，从而获得更高的成像质量。
在生物学中，激光共焦显微技术的应用非常广泛，尤其是在生命科学研究中，它被广泛地运用于细胞和组织成像、功能成像、分子成像等多个方面。
在细胞成像方面，激光共焦显微技术可以非常清晰地观察到细胞内的结构和细胞器，如细胞核、高尔基体、线粒体等。
同时，激光共焦显微技术还可以提供三维立体成像，使得研究者们可以更好地观察细胞内的结构和过程，从而更好地理解细胞的功能和疾病发生的机理。
在肿瘤研究中，激光共焦显微技术还可以观察到肿瘤细胞和正常细胞的形态学和功能上的差异，从而对肿瘤疾病的研究提供了更深入的了解。
在功能成像方面，激光共焦显微技术可以观察到细胞内某些特定的功能及其相互作用，如细胞内的信号传递、代谢和分子交互，还可以检测到细胞内的离子浓度、膜电位等参数的变化，从而为生命科学研究提供了非常有价值的信息。
在分子成像方面，激光共焦显微技术可以通过结合各种荧光染料和钙指示剂等方法，实现对生物分子的表达定位和活动状态的记录。
这些信息可以用来了解某些信号通路的机理，如高尔基体中的转运机制、传递到细胞核中的信号通路等。
综上所述，激光共焦显微技术在生物学中的应用非常广泛，对于生命科学研究的发展起到了非常积极的作用。
随着技术的不断进步和发展，相信这种技术将会在生物学领域中发挥更加重要的作用，为我们更好地理解生命体系的本质和机制提供更多有价值的信息和数据。
附激光共聚焦扫描显微镜在生物领域的应用范围.
附：激光共聚焦扫描显微镜在生物领域的应用范围激光共聚焦扫描显微镜在生物领域的应用激光共聚焦显微镜的特点以及在生物领域的应用传统光学显微镜相比，激光共聚焦显微镜具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图象等优点。
所以它问世以来在生物学的研究领域中得到了广泛应用。
激光共聚焦显微镜的应用领域多重荧光影像 ( Multi-Color Fluorescence Imaging )3D 立体影像重建 ( 3D Reconstruction )3D 动态影像获取与分析 ( Dynamic 3D imaging )神经立体分布影像 ( 3D Neuron imaging )形态与动态分析 ( Morphology )次微米单晶荧光影像技术 ( Nano-crystal )多重荧光蛋白影像技术 ( Multi-Color GFP Imaging )荧光共振能量转移 ( FRET or FLIM, FRAP ) )细胞离子流定量分析 ( Cellular Ion Concentration and Ratio Imaging )长时间影像记录 ( Time-Lapse Recording )Z轴扫描与测量 ( Z-section and measurement )基因影像分析 ( Genetic FISH imaging and quantification )染色体多重荧光原色表現 ( Chromosome spectral analysis )活体胚胎研究 ( Embryo, Zebrafish / Drosophila embryo )穿透光影像 / 反射光影像材料表面分析 ( Surface and roughness analysis )材料显微硬度分析 ( Micro-Hardness analysis )晶园分析 ( Wafer analysis )薄膜分析 ( Thin layer analysis )在对生物样品的观察中，激光共聚焦显微镜有如下优越性：1．对活细胞和组织或细胞切片进行连续扫描，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。
激光共聚焦显微镜原理和应用
激光共聚焦显微镜原理和应用共聚焦显微镜的发展历史1955年，Marvin Minsky利用共焦原理搭建了一台共焦显微镜，用来在体观察大脑的神经元网络。
1957年，Marvin Minsky申请了共聚焦显微镜的专利。
1970年，第一台单光束共聚焦激光扫描显微镜问世。
1985年，多个实验室的多篇报道显示共聚焦显微镜可以消除焦点模糊，得到非常清晰的图像。
1987年，BIO-RAD公司推出了第一台商业化的共聚焦显微镜。
共聚焦显微镜最大的优点就是可以只检测一个聚焦平面的信号。
样品聚焦平面和检测器（光电倍增管）之前均有一个针孔，针孔的设置可以有效地滤除非聚焦平面的信号，增加显微镜的信噪比。
激光扫描显微镜能够逐点和诸行对样品进行扫描，最终根据象素信息形成一个高对比度和高分辨率的图像。
通过逐层对样品扫描并把每一层的图像组合成一个整体，激光扫描显微镜能够对样品进行三维分析，非常适合于超厚样品的检测。
传统显微镜是一次性照明整个视野中的样品，因此可以用眼睛直接观察或者用CCD获取图像，没有时间延迟；而共聚焦显微镜是逐点成像，无法用眼睛成像，也无法用CCD获取图像，只能用探测器收集每个象素点的信号，再通过软件重构图象，有一定的时间延迟。
How a Confocal Image is FormedCondenser Lens Pinhole 1Pinhole 2Objective LensSpecimen DetectorWide Microscopy and Confocal MicoscopyWide Field Confocal Field Wide Field Confocal FieldConfocal Principle630 nm BandPass FilterTransmitted LightWhite Light Source620 -640 nm LightTransmitted LightLight Source520 nm Long Pass Filter>520 nm LightTransmitted Light Light Source575 nm Short Pass Filter<575 nm Light Standard Short Pass FiltersOptical FiltersDichroic Filter/Mirror at 45 degReflected light Transmitted Light Light Source 510 LP dichroic Mirror生命科学院的激光共聚焦显微镜Beam Path of Zeiss CLSM 510 METAThe unique scanning module is thecore of the LSM 510 META. It containsmotorized collimators, scanning mirrors,individually adjustable and positionablepinholes, and highly sensitive detectorsincluding the META detector. All thesecomponents are arranged to ensureoptimum specimen illumination andefficient collection of reflected oremitted light. A highly efficient opticalgrating provides an innovative way ofseparating the fluorescence emissions inthe META detector. The gratingprojects the entire fluorescencespectrum onto the 32 channels of theMETA detector. Thus, the spectralsignature is acquired for each pixel ofthe scanned image and subsequently canbe used for the digital separation intocomponent dyes.Focus ConeSpecimen X/Y ImageXYTo get an 2 D image, the excitation spot has to be moved over the specimen3 D information is acquired by moving the excitation focus not only in XY direction but also in Z direction. The result is a 3 D data stack consisting of number of XY images representing different optical sections from the specimenX/Y/Z StackZ-Driveoptical slice共聚焦显微镜的三维信息采集zxy# z sections =#imagesA confocal data set is similar to a book. A book has many pages, and Each page shows information only available if you move down to that page and ready it. Reading a page in a book, is just like scanning with a confocal microscope –you remove all of the other pages!z xy zyy The advantage of confocal microscopy is that you can visualize frames from a 3D object even in planes that you don’t image directly. This is called “slicing” an object and is an important component of confocal imaging.三维数据重构建荧光共振能量转移荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）作为一种高效的光学“分子标尺”，在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等方面有广泛的应用。
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。
把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。
1 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）的原理从基本原理上讲,共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜,它对普通光镜从技术上作了以下几点改进:1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。
1．2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板,将焦平面以外的杂散光挡住,消除了球差;并进一步消除了色差1．3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。
而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。
这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。
1．4用计算机采集和处理光信号,并利用光电倍增管放大信号图在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。
而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号放大,灵敏度大大提高。
由于综合利用了以上技术。
可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。
2 ＬＳＣＭ在生物医学研究中的应用目前,一台配置完备的ＬＳＣＭ在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜,它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合,如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ＰＨ)、微分干涉差显微镜(ＤＩＣ)等,因此被称为万能显微镜,通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围讲解
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围讲解激光共聚焦显微镜的原理与应用范围激光扫描共焦显微镜是在传统光学显微镜的基础上，利用激光作为光源，采用共轭聚焦原理和装置，通过计算机对被观察物体进行数字图像处理的一套观察、分析和输出系统。
光学成像的分辨率提高了30%～40%。
荧光探针被紫外线或可见光激发，以获得细胞或组织内部微观结构的荧光图像。
在亚细胞水平上观察生理信号和细胞形态的变化。
它已成为形态学、分子生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域的新一代研究工具。
1激光扫描共聚焦显微镜（lscm）的原理就基本原理而言，共焦显微镜是一种现代光学显微镜。
对普通光学显微镜进行了以下技术改进：1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。
1.2利用共焦技术，在物镜的焦平面上放置一个带小孔的挡板，以阻挡焦平面外的杂散光，消除球差；并进一步消除色差1．3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。
而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。
这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。
1.4用计算机采集和处理光信号，用光电倍增管放大信号图在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。
而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号放大,灵敏度大大提高。
由于综合利用了以上技术。
可以说ｌｓｃｍ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。
2lscm在生物医学研究中的应用目前,一台配置完备的ｌｓｃｍ在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜,它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合,如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ｐｈ、微分干涉差显微镜(ｄｉｃ等,因此被称为万能显微镜,通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。
激光共聚焦显微镜原理及应用
场式照明（范围大）
载玻片 激发光束
点扫描（范围小）
场式显微镜的照明范围和照明深度都很大，而共聚焦显微 镜的照明则集中到焦平面的一个精确的焦点上。 标本的共聚焦图像是一种重建的图像，是从PMT采集的荧 光光子信号到电子装置之间的点到点的成像系统，而不是 从显微镜目镜直接观察到的实际图像。
可以对厚荧光标本（可以达到50μm或以上）进行精细的光
学切片，切片的厚度约为0.5到1.5 μm。 采集足够的光学切片，就能通过软件对其进行三维重建。
可以同时获取和显示多标记荧光。而且共聚焦显微镜可以
通过扫描单元内的滤光片转轮，采用不同程度的带通滤光 片，尽量减少多色荧光之间的波段叠加，（新型的共聚焦
传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像 都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光共聚焦显微 镜利用激光扫描束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面 上的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像， 由探测针孔后的光电倍增管（PMT)，迅速在计算机监视器 屏幕上形成荧光图像。
共聚焦显微镜的优势
显微镜采用光栅加狭缝的方法可以随意调节发射荧光的波
段和带宽，因而可以更好的避免波段叠加），同时在激发 过程中可以采取顺序扫描方式，这样又避免了激发光对不 同荧光染料的交叉激发。
还可以在不改变物镜的情况下对标本进行放大扫描。
Confocal fluorescence images of a hacat cell (1 mm depth spacing)
PMT
检测器共焦针孔 离焦光线 发射荧光吸 收滤光片 聚焦光线 分光镜 物镜
激发滤光片
激光激 发光源
激发光线 光源共焦针孔 标本焦平面 标本
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激光扫描共焦显微镜应用
荧光探针 FLuo3-AM, K+, dextran Fluo4 激发波长 506nm 506nm 发射波长 525nm 525nm Kd 390nM
Calcium Green-1
Calcium Green-2 Fura red Oregon Green 488
507nm
507nm 420/480nm 494nm
激光扫描共焦显微镜技术
• • • • 样品要求 原理 功能 在生物医学中的应用
激光扫描共焦显微镜技术
人眼分辨率： 0.2mm
光学显微镜分辨率：0.25mm 电子显微镜分辨率：0.2nm 共焦显微镜分辨率：0.18mm
激光扫描共焦显微镜技术
二、 原理
激光扫描共焦显微镜技术
原理小结:
Confocal 利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测 器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照 明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发 射的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何发射光均被探 测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来 说是共轭的，因此被探测点即共焦点，被探测点所在的平面 即共焦平面。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机 屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在 样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载 物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平 面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移 动，就可得到样品不同层面连续的光切图像 。
激光扫描共焦显微镜应用
一、定位、定量 • 免疫荧光标记（单标、双标或三 标）的定位、 定量：如：细胞膜受体或抗原的分布， 微丝、微管的分布、 两种或三种蛋 白的共存与共定位、蛋白与细胞器的 共定位、核转录因子转位和干细胞的 增值、分化 • 细胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI 末端原位杂交-fitc + PI • 荧光原位杂交： 染色体基因定位
激光扫描共焦显微镜应用
3. GFP 绿色荧光蛋白
GFP的的发现：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一 种水母发光蛋白(aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产 生蓝色荧光。然而水母整体几提取的颗粒都呈绿色，后经证实 在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白 GFP, 后 经研究表明，在水母体内Ca2+和肠腔素与水母发光蛋白结合后， 水母发光蛋白产生蓝色荧光，GFP在蓝光的激发下，产生绿色 荧光 。 将外源基因与GFP DNA 相连, GFP可作为外源基因的报告基 因实时监测外源基因的表达.
6464 128128 512512 10241024 20482048
激光扫描共焦显微镜 技术的应用
The application of Confocal Laser Scanning Microscopy
激光扫描共焦显微镜应用
功能.
1.多荧光标记样品的高清晰度、高分辨率图像采集 2.无损伤、连续光学切片，显微“CT” 3.真正的三维重组 4.假三维图的显示 5.可沿Z轴（xy平面）和Y轴（xz平面）方向进行光切 6.定量分析 7.时间序列扫描: xyt 、xyzt 和 xt 扫描 8.图像处理 9. 旋转扫描 10.感兴趣区域扫描 11.光谱扫描
NBD C6-ceramie 466/536, 可染活或死细胞
激光扫描共焦显微镜应用
细胞器的单克隆抗体 5)细胞核
PI propidium iodide 536/617 DNA/\RNA 死细胞 碘化丙啶 EB ethidium bromide 518/617 DNA/RNA 死细胞 Hochest 33342 352/461 DNA A-T 活细胞 Hochest 33258 352/461 DNA A-T 活细胞 DAPI 358/461 DNA A-T 半通透细胞 Chromomycin A3 450/470 DNA G-C AO 500/526 DNA 活细胞 560/650 RNA TOTO-1 514/533 DNA 死细胞 SYTO11~16 20~24 488/ 520 活细胞 SYTO11~16 20~24 521/ 556 活细胞 SYTO 17 621/634 活细胞
F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)
Ca2+浓度绝对测量
1）单波长公式法
Fluo3: 530nm Kd=450nM [Ca2+]I =Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)
Fmin: 细胞内无钙时的荧光强度( MnCl2) Fmax：细胞内钙饱和时的荧光强度(A23187)
GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,就能显 示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞器 的结构及病理过程 可用于观察分子的运动（FRAP）
• 蛋白之间的相互作用（FRET）
激光扫描共焦显微镜应用
三.动态测量
• Physiology:细胞内离子动态变化测量 1).游离Ca2+测量
检测游离Ca2+变化荧光探针的原理：这类探针多为Ca2+螯合剂，不与 Ca2+结合时不发荧光，通常也不能进入细胞膜，只有与乙酰甲酯AM相 连方可进入细胞内，被细胞内酯酶水解后并与胞内游离钙结合后发出荧 光。Kd值为Ca2+解离常数，表明检测Ca2+浓度的范围:0.1xKd-10xkd, Kd 和很多因素有关，如pH、 Mg2+、与蛋白的结合、温度等。细胞内生理 Ca2+浓度值(10-100n M)，细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍 左右）
BODIPY FL
503/512
BODIPY TR 592/618
激光扫描共焦显微镜应用
1)细胞表面抗原、胞内某种蛋白
免役荧光标记： 与抗体耦联, 直标: 一抗+荧光探针 间标: 二抗+荧光探针 如: 微管蛋白tublin ( 抗 tublin抗体+荧光探针) 肌动蛋白actin ( Palloidine+荧光探针)
2)细胞膜表面受体
配体+荧光探针 如: nAchR、mAchR、多巴胺受体(D1,D2) 标记 Gm1: 霍乱毒素受体 霍乱毒素+FITC
激光扫描共焦显微镜应用
2.标记细胞器荧光探针
1)线粒体 Mitochondria Rodamin 123 505/534 ，可染活细胞，阳离子, 可检 测线粒体膜电位, 且在多数细胞中停留 时间短 JC1 线粒体膜电位低时为单体 490/527 发绿光 线粒体膜电位高时为多聚体 490/590 发红光 可标记活细胞线粒体，且为检测线粒体膜电位最 佳探针 Mitotracker Green FM 490/516, 染活细胞或固定细胞 , 稳定不漏出 Mitotracker Orange CMTMRos 551/576, (氧化型) Mitotracker Orange 还原型, 只能染活细胞
激光扫描共焦显微镜技术
5. 四个荧光通道, 一个透射光通道
即除了可同时采集多标记荧光图像外 还可以同时采集透射光图像,但透射光 图像为非共焦图像。
激光扫描共焦显微镜技术
6.扫描速度: slow 220lines/s 512512 2-3秒 slow2 440lines/s（2：双向扫描） medium 450lines/s 512512 1.7秒 medium2 900lines/s fast 1000lines/s 512512 0.7秒 128128 0.2秒 fast2 2000lines/s 7. 扫描密度:
激光扫描共焦显微镜技术
激光扫描共焦显微镜技术
激光扫描共焦显微镜技术
• 共焦显微镜与传统显微镜的区别
1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像
激光扫描共焦显微镜技术
• 共焦显微镜与传统显微镜的区别
2. 具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片
confocal
conventional
激光扫描共焦显微镜技术
激光扫描共焦显微镜技术
• 技术指标（Leica TCS SP2) :
1. xy分辨率比传统显微镜小1.4x 传统显微镜: Rxy=0.61/NA （0.25 mm ) Confocal: Rxy=0.4/NA（0.18 mm ) 2. 样品的最大厚度: 取决于: 物镜的NA、物镜的工作距离 激光的穿透力、样品的透明度 Z轴的最大移动范围(166mm、Z-wide) 3. 样品的最小光切厚度: (载物台最小移动距离为40nm） 取决于: 物镜的NA、针孔大小 Z轴的最小移动步距: 40nm Z轴的分辨率: 0.35 mm
530nm
535nm 637nm 520nm
190nM
550nM 140nM 20,000nM
Calcium Crimson
Indo-1 Fura-2
583nm
356nm 340/380
602nm
405/458nm 476nm
328nM
230nM 145nM
激光扫描共焦显微镜应用
•程序化测量：用timelapse中的编程按钮可进行不同时间序列的扫描测 量。
激光扫描共焦显微镜应用
GFP主要应用: • 对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察 可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中 或外界刺激因子的作用下的时空表达, 如某种转录因子的核 转位、蛋白激酶C的膜转位等。
•
• •
GFP基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞, 可动态观察 该分泌蛋白分泌到细胞外的过程
激光扫描共焦显微镜应用
应用
• 定位、定量 • 三维重组 • 动态测量 活细胞或组织内游离Ca2+分布和浓度的变化 测量 (Mg2+ 、Zn+ 、Na+ 、K+) 自由基的检测 药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量 蛋白质的转位