HXY-生物制药学实验范文

实验一碱裂解法小量制备质粒DNA（4学时）

一、实验目的

1. 了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的广泛应用

2. 学习和掌握碱裂解法提取质粒的原理和操作方法

二、实验原理

质粒（plasmid）是细菌细胞内的一种共价闭合环状DNA（简称cccDNA）分子，作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状，能传给子代并在子代细胞中保持一定的拷贝数，也可丢失及在细菌之间转移。现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因，是重组DNA技术中重要的载体，可通过连接外源基因构成重组体。

从宿主菌中提取质粒DNA是DNA重组技术中最基础的实验技能。质粒抽提的方法很多，但原理和操作步骤都大同小异，以碱裂解法最为常用。碱裂解法提取质粒是根据质粒的cccDNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。使用SDS和强碱处理裂解细菌细胞后，在pH值介于12.0～12.5这个范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，然而cccDNA的氢键虽会被断裂，但两条互补链彼此相互缠绕，仍会紧密地结合在一起。当加入乙酸钾溶液将pH值恢复至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，和不稳定的大分子RNA，变性的蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来，从而可以通过离心去除。

三、试剂和器材

试剂

1.LB液体培养基

胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L，调pH至7.0，高压灭菌。

2.LB+Amp培养基

LB液体培养基内加入50μg/mL的氨苄青霉素。注意Amp遇高温分解，待培养基温度低于60℃时加入。

3.溶液Ⅰ（50 mM 葡萄糖,25 mM Tris-HCl, 10mM EDTA,pH8.0）

称取0.3g Tris，0.37g EDTA二钠盐，用适量双蒸水溶解后用HCl调pH至8.0，定容到100mL，再加入0.99g葡萄糖。

4.溶液Ⅱ（0.2 M NaOH, 1% SDS）

称取0.8g NaOH和1g SDS溶于双蒸水，定容至100mL，现配现用。

5.溶液Ⅲ ([K+]=3M, [Acˉ]=5M)

取5 mM KAc溶液60mL，冰醋酸11.5mL，H2O 28.5mL混匀。

6.TE缓冲液（10mM pH8.0 Tris-HCl，1mM EDTA）

称取0.12g Tris，0.037g EDTA二钠盐,加适量双蒸水溶解，用HCl调至pH8.0并定容至100mL，高压湿热灭菌，4℃保存备用。

7.无水乙醇和70%乙醇

8.酚:氯仿:异戊醇（体积比25:24:1）

9.RNase A（10mg/mL）

称取不含DNA酶的RNase A 0.1g，溶于10mL TE中，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。

材料

携带质粒（pET32a质粒）的大肠杆菌

器材

灭菌锅、恒温摇床、离心机、微量移液器、制冰机、三角瓶、Eppendorf管、试管、培养皿、试剂瓶、超净工作台。

四、实验步骤

(一) 细菌的培养

将含有质粒的大肠杆菌接种于LB+Amp液体培养基中，250 r/min，37℃摇床培养过夜。

(二) 质粒提取

1.取1.5 mL培养液加入Eppendorf管中，5000 r/min 离心3 min。弃去上清，保留菌

体沉淀。如菌量不足可再加入培养液，重复离心，手机菌体。

2.将菌体沉淀悬浮于100μL溶液Ⅰ中，盖紧管口，充分振荡混匀，室温放置5-10 min。

3.加入200 μL新鲜配制溶液Ⅱ，盖紧管口，颠倒数次轻柔混匀(勿剧烈震荡)，此

时菌液应该变得清亮，，将离心管放冰上5 min 。

4.加入150 μL冰上预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，温和颠倒数次使混匀，此时出现白色

絮状沉淀。冰上放置5-10 min 。

5.4℃，12000 r/min离心10 min ，将上清转至另一Eppendorf管中。

6.向上清中加入等体积酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），反复混匀，12000 r/min离心10 min，

将上清转移到另一Eppendorf管中。

7.向上清加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后，室温放置15-20min。12000 r/min

离心10 min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干管壁粘附的液体。

8.加入1mL 70%乙醇洗涤沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥，

即得到质粒DNA制品。

9.将DNA溶于30 μL TE（含有20 μg/mL的RNase A）中，-20℃保存，备用。

五、注意事项

1.细菌培养过程中要求无菌操作。枪头、离心管等都需要灭菌。

2.制备质粒的过程中，注意操作缓和，以避免机械剪切力对DNA的损伤。

3.加入溶液III后，可用小玻璃棒轻轻搅开团状沉淀物，防止质粒DNA被包埋在沉淀物内。

4.为充分除去残余的蛋白质，可用酚/氯仿/异戊醇混合液进行多次抽提，直至两相间物蛋白沉淀。

思考题

1.碱裂解法提取质粒的过程中，溶液I、II、III的作用是什么？

2.质粒提取过程中应注意哪些操作？

实验二限制性内切酶切割DNA（4学时）

一、实验目的

1.掌握DNA的酶切技术

2.通过对质粒DNA的酶切，学会根据目的基因合理选择载体与限制性内切酶，设计构

建重组DNA分子

二、实验原理

限制性内切酶是从细菌中分离出来的一中能在特异位点切割DNA分子的核酸内切酶，已有400余种，每种酶有其特定的核苷酸序列识别特异性，酶的活性需Mg2+来激活。不同的酶也有许多差别：有些酶除需Mg2+外，还需A TP 等其他辅助因子的激活；切割位点和识别序列间的距离不同；有的内切酶同时具有甲基化作用。根据这些差别，可将限制性内切酶分为I、II和III类型。II 型限制性内切酶只需要Mg2+的激活，酶在其识别序列内切割双链DNA，产生的各种DNA片段具有相同的末端结构，而且大多数的II 型酶可提供粘性未端，有利于片段再连接，大部分II 型酶所识别的序列具有反向对称的结构，或称之回文结构。例如EcoRI 和HindIII 的识别和切口分别为：

限制性内切酶对环状质粒DNA产生的酶切片段数与切口数一致。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切口的数目；从片段迁移率可判断酶切片段大小。用已知分子量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子大小。

质粒在细胞内有三种构型：①共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；②如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫作开环DNA；③双链线状DNA由于两条链的切口在同一部位被切断，不能成环，完全开放成线状，简称线性DNA。三种构型的质粒DNA 在电泳时的泳动速度为：共价闭环DNA>线状DNA >开环DNA。

限制性内切酶作用的温度一般是37℃，反应体系中以Mg2+为唯一的辅助因子，且要求pH值在7.5左右。商品酶都保存在50%甘油溶液中，-20℃保存，活性一般为2-10U/μL.(37℃温度下反应1小时，将1 μg的DNA完全分解的酶量定义为1个活性单位U)

pET32a质粒图谱：