免疫实验学技术

酶联免疫斑点检测技术的应用摘要：酶联免疫斑点检测（Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT）是一种在细胞悬液中定量检测细胞因子生成细胞的分析方法。

本文主要从ELISPOT 的技术原理及技术特点，标准的操作程序进行阐述，并对实验方法进行了介绍,展望了ELISPOT的应用。

关键词:酶联免疫斑点检测；淋巴细胞；细胞培养酶联免疫斑点检测（Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT），它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况，分析经特异抗原活化后分泌细胞因子，如干扰素γ(interferongamma,IFN) 、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α) 等的单个效应细胞的频数, 具有敏感、特异、易于重复的优点[ 1] , 是检测抗原反应性效应细胞的最可靠实验方法之一[ 2] , 目前已成为抗原特异性T 细胞免疫学研究的主流技术。

本文就ELISPOT 技术作如下综述。

1 关于ELISPOT酶联免疫斑点（ enzyme-linked immunosorbent spot， ELISPOT）检测技术是通过两种高亲和力的特异性抗细胞因子抗体来检测淋巴细胞分泌细胞因子情况的一种方法。

淋巴细胞在体内被抗原激活后，或者在体外培养中被培养液中含有的特异性抗原或刺激剂激活后，将这些细胞转入ELISPOT培养板中。

这些活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子，在孵育的过程中可在分泌细胞原位被ELISPOT培养板上包被的特异性细胞因子抗体所捕获。

将细胞和过量的细胞因子洗除后，加入生物素标记的检测抗体，孵育后洗去多余检测抗体。

然后加入酶标记的链亲和素（二抗），孵育后洗去多余酶标链亲和素（二抗）。

最后加入酶的底物，作用后可形成不溶的颜色产物即斑点（SPOT）。

每个斑点是激活的淋巴细胞分泌的细胞因子区域，代表一个活性淋巴细胞。

实验结果可在显微镜下观察或使用酶联免疫斑点自动图象分析仪（BioReader 4000 Pro-X）来进行计数分析。

该方法可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的反应能力及记数特异性抗原刺激下分泌性淋巴细胞产生的情况。

2 ELISPOT技术原理和技术特点ELISPOT结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术，能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。

其技术原理用抗体捕获培养细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来。

ELISPOT的培养板以聚偏二氟乙烯(PVDF)膜等为基质,包被上特异性单克隆抗体,在培养板孔内加入细胞培养基、待检测的细胞及抗原刺激物进行培养。

在特异性抗原或非特异性有丝分裂原的刺激下,T细胞分泌各种细胞因子,细胞因子被膜上的单克隆抗体捕获。

被捕获的细胞因子可以与生物素标记的第二抗体结合,然后用酶标亲和素与生物素进行化学酶联显色,在膜的局部形成一个个圆形斑点[3]该技术检测细胞因子具有三大优点：其一，灵敏度高。

在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。

这是目前为止，最为灵敏的检测技术，灵敏度比传统的的ELISA方法高2-3个数量级。

其二，单细胞水平，活细胞功能检测。

ELISPOT检测的是单个细胞分泌，而非细胞群体的平均分泌。

在检测的过程中，有活细胞培养与抗原刺激阶段，检测的是活细胞的功能，而非死细胞的遗留物。

其三，操作简便经济，可以进行高筒量筛选。

ELISPOT没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，不需要大型的、专门的实验仪器设备。

按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理数百个样品，效率远远高于其它检测方法。

实验设计在96孔培养板上进行，直接以培养板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纤维素膜为基质，包被上特异性的单克隆抗体，用以捕获细胞分泌的细胞因子。

（由于涉及到细胞培养的过程，对单克隆抗体的要求要远高于ELISA中的捕获抗体，该抗体需要无毒，不含内毒素，亲和力高等特点。

）之后，在培养板的孔内加入细胞培养基（现在无血清ELISPOT技术已经成熟，培养基中可以不再含有血清）、待检测的细胞以及抗原刺激物进行培养。

在特异性的抗原或者非特异性的有丝分裂原的刺激下，数小时之内，T细胞就会开始分泌各种细胞因子。

细胞因子当即就被位于细胞下方的膜上的单克隆抗体所捕获。

在洗去细胞之后，被捕获的细胞因子可以与生物素标记的第二抗体结合，然后用酶标亲和素再与生物素结合，进行化学酶联显色，就可以在膜的局部形成一个个圆形的斑点。

每一个斑点就对应了当初一个分泌细胞因子的细胞，这些细胞被称为斑点形成细胞（Spots forming cells SFCs）。

统计膜上的斑点的数目，再除以当初加入孔内的细胞总数，就可以计算出阳性细胞的频率。

3 ELISPOT的方法由于有商品化的试剂盒，ELISPOT操作本身已经大大简化。

目前的ELISPOT 试剂盒按抗体的包被情况分为已包被板的和未包被板的两类。

前者实验操作简单，但是背景较高，且价格较贵，所以应用不如后者广泛。

按照ELISPOT底板材料分，可以分为PVDF膜板和非PVDF膜板。

PVDF板由于疏水性的问题，需要用乙醇预先润湿，在洗涤过程中也更复杂一些。

各个公司的试剂盒使用起来大同小异，我们以荷兰U-Cytech公司的PVDF板IFN-γ试剂盒，列出其操作方法。

3.1 实验的准备工作（1）设备与耗材：超净工作台；5% CO2 37°C 细胞培养箱；Biosys ELISPOT ReaderP10，P200，P1000 微量移液器；P10，P200，P1000 枪头；0.5mL，1.5mL EP管。

P300 8通道微量移液器，P300 12通道微量移液器；多道移液器吸槽；（2）溶液配制PBS：用分析纯试剂，Millipore级别的纯水配制，高压灭菌。

PBST：PBS加入0.05% Tween-20，注意无菌操作。

储存于20-25°C，可存放一个月。

70%乙醇：分析纯乙醇70mL，加入Millipore级别的纯水至100mL。

30%乙醇：分析纯乙醇30mL，加入Millipore级别的纯水至100mL。

包被抗体（coating antibody，Primary antibody）：加入双蒸水溶解。

使用时，用PBS稀释50倍，每孔50μL。

封闭液：用PBS将试剂盒中的封闭存储液（Blocking stock solution R）稀释10倍，每孔200μL。

抗体稀释液：用PBS将试剂盒中的稀释存储液（Dilution buffer R）稀释10倍检测抗体（Biotinylated detector antibody，Secondary antibody）：照U-Cytech 说明书，加入双蒸水溶解。

使用时，用抗体稀释液稀释100倍，每孔100μL。

酶联亲和素（Streptavidin-HRP conjugate）：照U-Cytech说明书，加入双蒸水溶解。

使用时，用抗体稀释液稀释100倍，每孔100μL。

AEC显色液：照U-Cytech说明书，用100mL 30%乙醇溶解底物缓冲液胶囊（Substrate buffer capsule），然后加入3.3mL AEC储存液（AEC stock solution），混合均匀后10mL每支分装，-20oC保存。

使用时，解冻，每孔加入100μL。

PHA刺激物：将储存液（2mg/ml， Murex）分装成20μL/EP管，-20°C长期冻存。

使用时，加入980μL U-Cytech无血清培养基（或者1640基本培养基），成为工作液（40μg/mL，10倍终浓度），每孔加入10μL，终浓度4μg/mL。

U-Cytech无血清培养基：我们推荐无血清ELISPOT技术，它能排除血清的干扰，结果更加稳定可靠，背景也更好。

如果没有，可以用含10%血清的1640培养基代替。

3.2 ELISPOT标准操作程序3.2.1 ELISPOT包被程序设计好试验，把每个孔要加入的内容做成卡片，到时候就会从容很多。

每孔加入15μL 70%的乙醇预湿30秒。

未润湿的PVDF膜是洁白的、不透明的，经过乙醇润湿之后，颜色变暗，变成半透明状，很容易观察二者的区别。

加乙醇的时候，枪头应该靠在孔壁接近孔底的地方，注意枪头不到刺到PVDF膜。

乙醇一旦接触到PVDF膜，就会在表面张力和毛细作用之下迅速浸润整块膜，使得膜的颜色和透明度发生变化。

15μL是经过优化的体积，它能保证刚好完全浸润整块膜，而不会有剩余。

如果加大使用量，乙醇溶液就会透过膜而积存在膜的背面，加深实验的背景。

加入100μL去离子水洗涤三次，尽量减少乙醇的残留。

按照试剂盒的使用说明，将包被抗体储存液稀释在PBS缓冲液中，每孔加入50μL，4°C包被过夜。

（次日）倾倒包被液，用PBS洗涤5次，最后一次，在灭菌的吸水纸上扣干。

加入200μL试剂盒自带的稀释好的封闭液，37°C封闭1小时。

倾倒封闭液，无须洗涤，直接可以进行细胞培养。

（也可以用PBS缓冲液或者纯水洗涤一次，拍干，封口，4°C保存，可以在4°C保存数周。

）3.2.2 铺细胞，加入刺激物，培养整个实验设置一组正对照（PHA刺激），每一个细胞样品（同一个捐献者或者实验动物）要设一个负对照（不加刺激物），整块板还要加一个背景负对照（不含细胞，只加培养基和所有的检测试剂）。

填好实验卡片，用以指导实验的安排和细胞及试剂的添加。

每一个细胞/刺激物的组合设置2-4个孔的重复（想要有统计学的意义，每个细胞/刺激物设4个孔的重复）。

取出封闭好的板，准备加入细胞。

如果是以前做的封闭，可以加入200μL的U-Cytech无血清培养基，室温静置10分钟，倾倒，然后再重复一次。

按照实验卡片的安排，加入不同浓度的细胞，100μL/well，细胞在孔中的分布要尽量均匀（要诀是加入细胞之后，不要再震动或者拍击ELISPOT板。

有人认为拍击板子会让细胞更分散，实际情况刚好相反）。

正对照的细胞浓度为1x105/well，实验组的样品细胞浓度请自行调整。

加入100μL的U-Cytech无血清培养基到背景负对照孔。

正对照孔加入10μL PHA，终浓度4ug/mL，该浓度能有效刺激IFN-γ的分泌。

加入实验者自己的刺激物（配制成10X终浓度，10μL/well）到实验孔。

加完刺激物之后不要再拍击ELISPOT 板。

有人认为拍击板子会让刺激物在孔中混合均匀，实际上，通过扩散，刺激物也会很快混合均匀。

拍击板子会让细胞成圈的分布在孔的外周。

当加完所有的样品之后，盖上板盖，放入二氧化碳培养箱，37°C培养18-24小时。