宣威火腿中生物胺的HPLC测定

宣威火腿中生物胺的HPLC测定
廖国周;王桂瑛;曹锦轩;程志斌
【摘要】Biogenic amines content was investigated in Xuanwei
ham.Samples were extracted with 0.4 mol/L HClO4,and then derived with dansyl chloride.Separation was achieved using ZORBAX XDB-C18 column and identification,and a quantitative analysis of biogenic amines fraction was carried out using a HPLC system with DAD.Results showed that the linear ranges were 0.5~20 μg/mL,the limit of detection was 0.05~0.1
μg/mL,the recoveries were 81.58%~95.58% and the relative standard deviation were 2.48%~5.85% for eight biogenic amines.Six biogenic amines were detected in Xuanwei ham,the content of β-phenylethylamine,putrescine,cadaverine,tyramine,spermidine and spermine were 0.56 mg/100g,1.45 mg/100g,0.37 mg/100g,3.62
mg/100g,1.26 mg/100g and 4.28 mg/100g,respectively.%以宣威火腿为对象分析其中8种生物胺含量,样品通过0.4 mol/L高氯酸提取后以丹磺酰氯柱前衍生,经ZORBAX XDB-C18柱分离以配备二极管阵列检测器的HPLC对生物胺进行测定。

结果表明,该方法中8种生物胺的线性范围为0.5～20μg/mL,检测限为0.05～0.1μg/mL,回收率为81.58%～95.58%,相对标准偏差为2.48%～5.85%,该方法线性范围广,灵敏度和准确度高,可满足定量分析的要求。

在宣威火腿中检测出6种生物胺,其中苯乙胺0.56 mg/100g,腐胺1.45 mg/100g,尸胺0.37 mg/100g,酪胺3.62 mg/100g,亚精胺1.26 mg/100g,精胺4.28 mg/100g。

【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2011(037)012
【总页数】3页(P130-132)
【关键词】生物胺;宣威火腿;高效液相色谱
【作者】廖国周;王桂瑛;曹锦轩;程志斌
【作者单位】云南农业大学食品科技学院,云南昆明650201;云南农业职业技术学院畜牧兽医系,云南昆明650201;宁波大学生命科学与生物工程学院,浙江宁波315211;云南农业大学动物科技学院,云南昆明650201
【正文语种】中文
【中图分类】TS245.9
生物胺是游离氨基酸在肌肉内源酶和微生物产生的外源酶催化作用下发生脱羧反应产生的一类低分子量有机碱，主要包括酪胺、组胺、腐胺、尸胺、苯乙胺、色胺、精胺和亚精胺等多种物质［1］。

适量的生物胺对人体健康有益，但当机体摄入高浓度的生物胺后，会产生一系列应激反应，引起头痛、呼吸紊乱、心悸、血压变化等不良症状，严重情况下可引起大脑出血，甚至死亡［2］。

由于其具有潜在的毒性，目前对食品中生物胺的研究已成为热点。

宣威火腿是云南省传统名特优产品，2001年获得国家原产地域保护，它是由在原产地域内饲养的含有乌金猪血统的鲜猪后腿在原产地域经过修割定形、腌制、堆码翻压、洗晒整形、上挂风干、发酵制作而成［3］。

长时间的腌制加工和发酵成熟过程使肌肉蛋白质和脂肪发生复杂的生物化学变化，形成干腌火腿的特征风味，同时也可能形成生物胺等副产物［4］。

本研究旨在通过柱前衍生-HPLC方法测定宣
威火腿中生物胺的种类与含量，为进一步评价宣威火腿的安全性提供基本依据。

1 材料与方法
1.1 试验样品
供试的成品宣威火腿购于昆明当地超市。

样品采集后于－20℃贮存待用。

1.2 主要仪器
Agilent 1100高效液相色谱仪，配置四元泵、真空在线脱气机、自动进样器、二极管阵列检测器、Agilent化学工作站，美国 Agilent公司;色谱柱:ZORBAX XDB －C18(4.6 mm ×250mm，5μm)，美国 Agilent公司;Allegra 64R冷冻离心机，美国Beckman公司;Ultra-Turrax T 25 basic分散器，德国IKA公司;超纯水仪，美国Millipole公司。

1.3 试剂
色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺标准品与丹磺酰氯均购自Sigma公司;乙腈、丙酮均为色谱纯;氨水、高氯酸、NaOH、NaHCO3等均为分析纯。

1.4 测定方法
1.4.1 样品前处理
取5 g宣威火腿样品加入20 mL的0.4 mol/L高氯酸，以分散器彻底匀浆后在冷冻离心机中(4℃，3 000 r/min)离心10 min，收集上清液，沉淀物按上述方法再提取1次。

将2次收集的上清液用0.4 mol/L高氯酸定容至50 mL。

取1 mL定容后的样品溶液，加入200 μL的2 mol/L NaOH，然后加入300 μL的饱和NaHCO3溶液进行缓冲，接着加入2 mL的丹磺酰氯衍生剂(浓度为10 mg/mL，溶剂为丙酮)，并在室温黑暗中反应处理30 min，反应结束后加入100 μL的氨水以终止反应。

最后以乙腈定容至5 mL。

经衍生处理的样品液用0.45 μm的有机滤膜过滤后即可上机测定。

1.4.2 色谱条件
釆用二元流动相体系:A为水，B为乙腈，其梯度洗脱程序见表1。

紫外检测波长为254nm，流速为1 mL/min，进样量为20 μL，柱温为40℃。

1.4.3 标准曲线
50 mg各种生物胺标准品分别溶于0.4 mol/L高氯酸中，并定容至50 mL，得1 mg/mL各种生物胺的标准储备液。

分别取各种生物胺的标准储备液，用0.4
mol/L高氯酸配制成终浓度分别为0.5、1.0、2.5、5.0、10、20 μg/mL 的混合
标准溶液。

取 1 mL的生物胺标准混合溶液，按上述方法进行衍生化，并上机分析，检测结果以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标建立标准曲线。

表1 梯度洗脱程序洗脱时间/min 流动相A/% 流动相B/%0.0 40.0 60.0 5.0 35.0 65.0 20.0 0.0 100.0 24.0 0.0 100.0 25.0 40.0 60.0 30.0 40.0 60.0 1.4.4 回收率、精密度和检测限
准确称取相同的宣威火腿肉样4份，每份5 g，其中3份分别加入质量浓度为500 μg/mL的8种生物胺混合标准液100、500、1000 μL，添加水平分别为1
mg/100 g、5 mg/100 g、10 mg/100 g，另 1 份不加，然后再进行前处理及高效液相色谱分析(n=6)，扣除样品中空白试验生物胺的含量，计算回收率和精密度。

根据国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)的定义，本法的检测限定义为产生相应于
3倍背景噪音的标准偏差分析信号的浓度值。

2 结果与讨论
2.1 标准曲线的回归方程、决定系数及方法的检测限
以标准样品浓度为X，以HPLC测得相应的峰面积为Y绘制标准曲线，得各生物
胺标准曲线的回归方程，见表2。

结果表明，各标准曲线的决定系数均大于0.99，各组分在0.5～20 μg/mL内线性良好。

据检测限定义可知，亚精胺与精胺的检测限为0.05 μg/mL，其余6种生物胺的检测限均为0.1 μg/mL，可以满足定量分析
的需要。

表2 标准曲线的回归方程、决定系数及方法的检出限生物胺回归方程决定系数
R2 检测限/(μg·mL－1)色胺 Y=28.92X－22.67 0.996 5 0.05－16.24 0.998 2 0.10苯乙胺 Y=30.58X－12.52 0.997 6 0.10腐胺 Y=78.57X+4.68 0.998 7 0.10尸胺 Y=58.41X－17.53 0.994 7 0.10组胺 Y=56.86X－24.12 0.998 1 0.10酪胺 Y=49.79X－19.78 0.997 8 0.10亚精胺 Y=84.51X－28.48 0.998 9 0.05精胺 Y=73.45X
2.2 方法的回收率与精密度
按回收率方法项操作，得到样品中添加低、中、高3个浓度水平生物胺混合标准
液的回收率和精密度，见表3。

结果可知，8种生物胺的加标回收率的变异范围为81.58%～95.58%，相对标准偏差为2.48% ～5.85%。

表明各浓度水平的加标回
收率和精密度均能达到检测要求，说明本方法具有较高的准确性和可靠性。

表3 方法的回收率和精密度(n=6)添加水平生物胺/%色胺1mg/100g回收率/%
相对标准偏差/%5mg/100g回收率/% 相对标准偏差/%10mg/100g回收率/% 相对标准偏差82.86 4.75 85.49 5.50 88.65 5.85苯乙胺 83.74 3.56 87.45 2.68 85.32 2.60腐胺 81.58 2.53 84.25 3.65 82.42 2.95尸胺 84.36 3.72 85.63 4.25 82.68 2.85组胺 85.27 2.52 87.65 3.54 86.73 3.26酪胺 84.78 3.42 86.42 2.43 87.52 3.48亚精胺 86.51 2.57 87.47 3.50 85.97 3.52精
胺89.48 4.38 92.37 3.76 95.58 3.56
2.3 宣威火腿中生物胺的种类与含量
图1和图2分别为生物胺标准品与宣威火腿样品的紫外检测色谱图。

由图1可知，本检测方法能有效地分离鉴定8种生物胺，且各组分峰尖锐、峰形对称，20 min
左右生物胺可被全部洗脱。

图2显示，在与生物胺标准品相同的保留时间里只出
现6个峰，分别为苯乙胺，腐胺，尸胺，酪胺，亚精胺与精胺。

由表4可知，在宣威火腿样品中并未检测出色胺与组胺，只发现苯乙胺，腐胺，
尸胺，酪胺，亚精胺与精胺6种生物胺，含量在0.37～4.28 mg/100 g，其中精
胺含量最高，酪胺次之。

目前对于干腌火腿中生物胺的分析报道较少，Wei等［4］在如皋火腿样品中检测出7种生物胺，分别是酪胺、苯乙胺、腐胺、精胺、色胺、尸胺和亚精胺，其中精胺含量最高，达2.65 mg/100 g。

Virgili等［5］对意大利干腌火腿中生物胺的测定结果稍有不同，其中酪胺含量最大，其次是精胺，表明加工条件与前体物含量对干腌火腿中生物胺的种类与含量有重要影响。

生物胺的毒性取决于个体的特性及其他胺的存在情况，如腐胺本身没有毒性，但可作为酪胺与组胺毒性的增效剂［6］。

Eerola 等［7］认为，血管活性生物胺(色胺、苯乙胺、组胺与酪胺)的总量低于20 mg/100 g是发酵肉制品具有较高品质的指标之一。

本
研究釆用柱前衍生-HPLC方法首次对宣威火腿中生物胺含量进行检测，发现生物
胺总量为11.56 mg/100 g，其中血管活性生物胺的含量远低于20 mg/100 g。

该结果为进一步研究加工过程中生物胺的消长规律奠定基础，并为评价宣威火腿的安全性提供依据。

图1 生物胺标准品的紫外检测色谱图
图2 宣威火腿中生物胺的紫外检测色谱图
表4 宣威火腿中生物胺的种类与含量(n=3)mg/100 g平均含量苯乙胺生物胺样
品1 样品2 样品3 0.67±0.01 0.53±0.01 0.49±0.02 0.56±0.09腐胺
1.42±0.02 1.70±0.02 1.24±0.04 1.45±0.23尸胺0.31±0.01 0.43±0.03
0.37±0.01 0.37±0.06酪胺3.27±0.06 3.64±0.02 3.96±0.01 3.62±0.34亚精胺1.06±0.03 1.46±0.02 1.27±0.02 1.26±0.20精胺3.93±0.06 4.65±0.05 4.27±0.02 4.28±0.36生物胺总量10.66±0.10 12.42±0.08 11.60±0.02
11.56±0.88
参考文献
［1］ Hernandez J T，Izquierdo P M，et al．Biogenic amine and polyamine contents in meat and meat products［J］．Journal of Agricultural and Food Chemistry，1997，45，(6):2 098－2 102.
［2］ Bardo'cz S．Polyamines in food and their consequences for food quality and human health［J］．Trends in Food Science and Technology，1995，6(10)“341－346.
［3］乔发东．宣威火腿标准化生产与品质改良技术研究［D］．北京:中国农业大学，2004:48－58.
［4］ Wei F S，Xu X L，Zhou G H，et al．Irradiated Chinese Rugao ham Changes in volatile N-nitrosamine，biogenic amine and residual nitrite during ripening and post ripening［J］．Meat Science，2009，81:451－455.
［5］ Virgili R，Saccani G，Gabba L，et al．Change of free amino acids and biogenic amines during extended ageing of I-talian dry-cured ham ［J］．LWT，2007，40(5):871 －878.
［6］ Hui J Y，Taylor S L．Inhibition of in vivo histamine metabolism in rats by foodborne and pharmacologic inibitors of diamine oxidase，histamine N-metyl transferase and monoamino oxidase［J］．Toxicology and Applied Pharmacology，1985，8:241－249.
［7］ Eerola S，Roig-Saguèz A X，Hirvi T K．Biogenic amines in Finnish dry sausages［J］．Journal of Food Safety，1998，18(2):127－138.。