贴壁细胞培养
第二节细胞培养方法及应用实例
配比
分包
疫苗产品
①原始种子——基因重组病毒株 当两种有亲缘关系的不同病毒感染同一宿主细
胞时，它们的遗传物质发生交换，结果产生不同于
亲代的可遗传的子代，称为基因重组。
基因重组病毒有“活病毒基因重组”、“灭活
病毒基因重组”及“死活病毒基因重组”。重组病
毒株原始种子属于死活病毒间的重组。
世卫组织提供的6支甲 型H1N1流感原始毒株
⑷包埋法 包埋就是将细胞包裹在有限空间内，制成固定化细胞。包埋后的细胞
不会扩散到周围介质中去，而底物和产物却能自由扩散。 包埋法仅只是将细胞包埋起来，不与载体发生反应，故包埋法细胞的
活性损失较小。包埋法根据其包埋的形式不同，又可将其分为格子型和微 胶囊型两种。
二、植物细胞培养方法
常见的植物组织细胞培养有愈伤组织培养、原生质体培养、花粉培养
一、动物细胞培养方法
根据动物细胞的生长特点，常见的细胞培养方法有贴壁培养、悬浮培 养及固定化培养等三种方法。
1.贴壁培养
所谓贴壁培养是指细胞贴附在 一定的固相表面（如：培养皿、培 养瓶等）进行的培养。 ⑴生长特性
贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴 壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后 就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。
HGPRT 骨髓瘤细胞
使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞 二者合二为一，得到杂种的骨髓 瘤细胞。这种杂种细胞继承两种
融合
(HAT)培养基
亲代细胞的特性，既具有 B淋巴 细胞合成专一抗体的特性，又有
由于挡板的存在，可有效地减小反应器内液面上的 旋涡。
2.贴壁培养反应器——中空纤维反应器
常见的贴壁培养反应器如：中空纤维反 应器、玻璃珠床反应器、陶质矩形通道蜂窝 状反应器等类型。
贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同培训
贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同培训
首先，在细胞生长形态上，贴壁细胞通常呈现典型的单层或多层附着
细胞的形态，细胞扩张生长速度较慢，细胞形态变化较小。
而悬浮细胞则
以单个细胞或细胞集合体的形式存在于液体培养基中，生长速度较快，细
胞形态较为多样化。
其次，在培养条件上，贴壁细胞需要在培养基中添加黏附分子或包袋
来增加其附着能力，以保持细胞在培养皿底部的黏附和生长。
而悬浮细胞
则需要在培养基中添加抗聚集剂或搅拌设备来避免细胞结块，以保持细胞
的均匀悬浮和生长。
再次，在传代方法上，贴壁细胞传代通常采用单层脱离法或酶消化法。
单层脱离法利用细胞与培养皿表面的非共价键结合进行脱离，可通过物理
刮擦或液体冲击等方法将细胞从培养皿上收集下来。
酶消化法则通过加入
蛋白酶等酶类物质分解黏附细胞与基质之间的胶原纤维等结构，使细胞能
够从培养皿表面脱离。
而悬浮细胞传代则更为简单，通常只需要将培养基
中的细胞离心沉淀后，将上清液中的细胞重新悬浮于新的培养基中即可。
此外，在培养基的选择上，贴壁细胞通常需要使用固体培养基，例如
含有胶原蛋白、明胶或滤纸等的培养基。
而悬浮细胞则需要使用液体培养基，例如含有血清或植物基因表达培养基等。
最后，在细胞应用方面，贴壁细胞通常用于细胞粘附、增殖和分化等
研究领域，如肿瘤细胞、成纤维细胞和内皮细胞等。
而悬浮细胞则常用于
细胞悬浮培养、蛋白质表达和病毒培养等研究领域，如白细胞、骨髓细胞
和病毒感染细胞等。
贴壁细胞传代培养步骤
贴壁细胞传代培养步骤
一、必要预备材料：
1.黏贴培养基；
2.细胞品系；
3.无菌棉签；
4.注射器；
5.脱硫酸盐卤素灯；
6.无菌细胞刀；
7.培养皿；
二、准备培养基:
1. 将黏贴培养基进行解冻，准备好用于细胞传代培养；
2. 用无菌棉签从瓶口处取出50 µl 培养基，用注射器注入培养皿中；
3. 使用脱硫酸盐卤素灯查看培养皿内的培养基，待培养基稳定后，将其置入培养箱中培养。
三、传代培养：
1. 进行一代细胞培养：将100 μl 细胞品系加入培养基，置入培养箱中培养；
2. 收集细胞：在品系培养至90%~100%阶段时，用无菌细胞刀将培养基连同其中的细胞一起取出；
3. 再生细胞：将细胞回收液均匀分散于新培养皿中，培养至细胞分裂
成熟；
4. 用冷冻融解法进行传代：将细胞悬液的容量加入超净水稀释，冷冻至-80℃后融解，充分混匀均匀后加入培养基中，开始进行传代培养。
四、最终传代注意事项：
1. 使用消毒过的相关器具，保证细胞不受污染；
2. 使用玻璃制品，避免细胞停滞或污染；
3. 确保培养箱的清洁，以免细胞污染；
4. 要保证培养条件的稳定,合理检查、温度、湿度及其他有效细胞培养条件；
5. 按时调整培养液、细胞活力，确保细胞传代培养质量。
贴壁细胞传代培养步骤
贴壁细胞传代培养步骤贴壁细胞传代培养是一项细胞学技术，用于繁殖选定细胞，其目的是在同一种细胞中完成繁殖。
此技术对于基础研究、比较生物学和临床诊断都具有重要意义。
在贴壁细胞传代培养过程中，可以形成一系列细胞系供后续的研究使用，因此这一技术在细胞学研究中扮演着至关重要的角色。
贴壁细胞传代培养具体步骤如下：第一步：首先，将细胞从初始培养基中分离出来，用活细胞物镜观察，查看细胞形态是否正常，结果显示细胞有正常分裂。
第二步：将第一步中分离出的细胞悬浮液转移到饱和细胞悬浮液中，一般采用0.25%的胨酶，将细胞细胞壁分裂，使细胞形成悬浮状态，这一步称为“贴壁”。
第三步：将贴壁后的细胞悬浮液转移到新培养皿中，一般采用Trypsin EDTA抑制剂，使悬浮的细胞不能再分裂，形成不可见的“细胞溶液”，这一步称为“传代”。
第四步：缓慢地用微量移液器将细胞溶液倒入新培养皿中，当液体分散成一液一固时，加入培养基，使细胞随培养基逐渐沉淀，这一步称为“培养”。
第五步：此时，细胞受到培养环境的刺激，开始新一轮的分裂，细胞学习到细胞性质的分化，然后细胞会沉淀在培养皿底部，细胞分裂结束后，就形成了新一代的细胞，从而完成了一次贴壁细胞传代培养实验。
以上就是贴壁细胞传代培养的具体操作步骤，要想做好这项实验，必须按照上述步骤进行操作，只有这样，才能确保实验数据的准确性。
同时，必须注意实验中的环境条件，确保培养基的新鲜，避免菌类污染，进而确保实验的准确性和稳定性。
贴壁细胞传代培养技术正逐步得到应用，目前，它已经运用于很多细胞学领域，尤其是在细胞分化和细胞系的建立中发挥了重要作用。
贴壁细胞传代培养技术更加方便、成本更低，并且能够解决传统细胞培养技术中遗传变异现象导致的假阳性，新增细胞不能够稳定传代等问题，所以受到越来越多的关注。
最后，应该提醒大家，在实验中一定要遵守实验安全规范，做好实验前预防措施，以保障实验安全、获得准确有效的实验结果。
总之，贴壁细胞传代培养技术由于其便捷性、稳定性、节约开销等优点，在细胞学领域具有重要的应用价值，未来将会发挥更大的作用。
贴壁细胞培养步骤及注意事项
贴壁细胞培养步骤一、复苏1.把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。
液体都融化后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里。
2.把上述细胞悬液吸到装有10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟。
3.把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。
吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。
4.标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。
5.3天换一次培养基（具体看细胞生长状态及培养液情况）。
二、传代1.培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。
2.把原有培养基吸掉。
3.加入2毫升PBs洗两遍，最后吸净培养皿中的PBS4.加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化（消化时长看情况而定）。
5.当看到细胞开始脱离培养皿时倒掉酶液，加入2毫升左右含血清的培养基终止消化。
6.用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。
7.把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。
8.倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。
9.根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。
一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个，继续培养。
10.若是只培养一皿，只需吹散后倒剩1/4左右，重新加入培养液继续培养。
三、冻存1.把原有培养基吸掉。
2.加入2毫升PBs洗两遍，最后吸净培养皿中的PBS3.加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化（消化时长看情况而定）。
4.去掉酶液，加入2毫升左右含血清的培养基终止消化。
5.吹落后把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。
6.加入1毫升冻存液悬浮细胞，装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期。
7.4℃30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。
配制溶液一、培养基配制（1）（DEME培养基）89%基础培养基+10%血清（FBS）+1%双抗45毫升培养基+5毫升血清+0.5毫升双抗（2）（1640培养基）89%基础1640培养基+10%血清（FBS）+1%双抗45毫升培养基+5毫升血清+0.5毫升双抗二、冻存液90%血清+10%DMSO；DMSO要慢慢滴加，边滴边摇三、消毒液75%的酒精注意事项（1）进入细胞间必须严格按照下列步骤操作①确定所有的细胞操作用的溶液和耗材都已经消毒并检测没有问题，不确定的溶液和耗材请勿使用，除非特殊情况，不要借用别人的溶液。
大规模培养常用方法(贴壁培养、悬浮培养与固定化培养)-1
大规模培养常用方法（贴壁培养、悬浮培养与固定化培养）-1根据动物细胞的类型，可采用贴壁培养、悬浮培养和固定化培养等三种培养方法进行大规模培养。
一、动物细胞生长特性及培养温度1. 细胞生长缓慢，易污染，培养需用抗生素2.细胞大，无细胞壁，机械强度低，环境适应性差3.需氧少，不耐受强力通风与搅拌4. 群体生长效应，贴壁生长（锚地依赖性）5.培养过程产品分布细胞内外，成本高6.原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡依据在体外培养时对生长基质依赖性差异，动物细胞可分为两类：●贴壁依赖型细胞：需要附着于带适量电荷的固体或半固体表面才能生长，大多数动物细胞，包括非淋巴组织细胞和许多异倍体细胞均属于这一类。
●非贴壁依赖型细胞：无需附着于固相表面即可生长，包括血液、淋巴组织细胞、许多肿瘤细胞及某些转化细胞。
培养细胞的最适温度相当于各种细胞或组织取材机体的正常温度。
人和哺乳动物细胞培养的最适温度为35~37℃。
偏离这一温度，细胞正常的代谢和生长将会受到影响，甚至死亡。
总的来说，培养细胞对低温的耐力比高温高。
温度不超过39℃时，细胞代谢强度与温度成正比；细胞培养置于39~40℃环境中1h，即受到一定损伤，但仍能恢复；当温度达43℃以上时，许多细胞将死亡。
当温度下降到30~20℃时，细胞代谢降低，因而与培养基之间物质交换减少。
首先看到的是细胞形态学的改变以及细胞从基质上脱落下来。
当培养物恢复到初始的培养温度时，它们原有的形态和代谢也随之恢复到原有水平。
二、贴壁培养（attachment culture）是指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。
1. 生长特性：贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。
一般数天后就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。
2.贴壁培养的优点：●容易更换培养液；细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。
细胞贴壁生长实验报告
1. 掌握动物细胞培养的基本技术，特别是细胞贴壁生长的过程。
2. 观察细胞在体外培养中的生长和形态变化。
3. 学习细胞传代培养的方法和注意事项。
二、实验原理细胞贴壁生长是指动物细胞在体外培养过程中，细胞会附着在培养皿或瓶壁上，形成单层细胞层。
这一过程依赖于细胞表面的粘附分子与培养皿表面的相互作用。
细胞贴壁生长是动物细胞培养的基础，也是进行细胞生物学研究、药物筛选和基因治疗等实验的前提。
三、实验材料与仪器1. 材料：- 小鼠成纤维细胞（或其它动物细胞）- 培养基（DMEM或RPMI-1640）- 10%胎牛血清- 0.25%胰蛋白酶- 灭菌的细胞培养皿- 灭菌的移液器- 灭菌的移液管- 培养箱- 显微镜2. 仪器：- 超净工作台- 离心机- 恒温水浴锅1. 细胞复苏：将冻存的细胞取出，在37℃水浴中快速解冻，然后加入适量的培养基，用移液器吹打均匀，使细胞分散。
2. 制备细胞悬液：将细胞悬液用移液器吹打均匀，确保细胞均匀分布。
3. 接种细胞：将制备好的细胞悬液加入培养皿中，每皿约1×10^5个细胞。
4. 培养：将培养皿放入37℃、5%CO2的培养箱中培养，每隔24小时更换一次培养基。
5. 观察细胞生长：在显微镜下观察细胞的生长和形态变化，记录细胞贴壁、生长和分裂情况。
6. 细胞传代：当细胞长满培养皿底部时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，收集细胞，按照1:10的比例进行传代培养。
五、实验结果1. 细胞在培养皿中迅速贴壁，形成单层细胞层。
2. 细胞呈梭形、多边形或不规则形，细胞之间紧密连接。
3. 细胞不断增殖，形成致密的细胞层。
4. 经过多次传代培养，细胞生长状况良好。
六、实验讨论1. 细胞贴壁生长是动物细胞培养的基础，对于细胞生物学研究、药物筛选和基因治疗等实验具有重要意义。
2. 细胞贴壁生长过程受到多种因素的影响，如细胞种类、培养基成分、温度、CO2浓度等。
3. 在实验过程中，应严格控制实验条件，确保细胞正常生长。
贴壁细胞培养
***细胞培养：指从体内组织取出细胞在体外模拟体内环境下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。
细胞培养基本条件1、合适的细胞培养基合成培养基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素及其它辅助物质。
氨基酸是组成蛋白质的基本单位。
不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。
其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。
因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。
但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。
已含谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2 周以上时，还应重新加入原来量的谷氨酰胺。
碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。
主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。
无机盐，培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。
此外，通过提供钠，钾和钙离子，帮助细胞调节细胞膜功能。
培养液的渗透压是一个非常重要的因素, 细胞通常可耐受260mOsm/kg −320 mOsm/kg。
标准培养液的渗透压在此范围内波动。
特别注意：向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压，特别是溶于强酸或强碱中的物质。
向培养液中添加HEPES 时需按以下方法调节钠离子浓度。
缓冲系统大多数细胞所需pH 在7.2 - 7.4。
但是，细胞培养最适pH 值随培养的细胞种类不同而不同。
成纤维细胞喜欢较高pH (7.4 - 7.7), 而传代转化细胞系则需要偏酸pH (7.0 - 7.4)。
由于多数培养液靠碳酸氢钠（NaHCO3）与CO2 体系进行缓冲，因此，气相中的CO2浓度应与培养液中碳酸氢钠浓度相平衡。
细胞培养瓶盖不应拧得太紧，以保证气体交换。
pH调整液:常用的有HEPES液和NaHCO3溶液。
1）NaHCO3溶液：NaHCO3是培养基中必须添加的成分，一般情况下按说明书的要求准确添加，以保证培养基在5%CO2的环境下pH达到设计标准。
贴壁细胞培养
贴壁细胞培养一、克隆形成抑制试验原理：克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆（集落），这时的每个克隆可含50个以上的细胞，大小在0.3-1.0 mm之间。
通过克隆形成实验，可对单个细胞的增殖潜力做出作定量分析，了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性。
这种方法常用于抗癌药物敏感性实验、肿瘤放射生物学实验等。
常见的有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。
本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的肿瘤细胞和正常细胞。
材料与方法（一）用品：含15%新生牛血清的RPMI-1640培养液、含10%新生牛血清的RPMI-1640、培养液PBS、0.25%胰酶、细胞染色液（刘氏染液）、相机、12孔板、EP管。
5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），用无菌生理盐水配制成100 μg/ mL溶液，使用前稀释至所需浓度。
（二）操作：①. 制备细胞悬液：取对数生长期结肠癌SW620细胞，用0.25%胰酶消化并吹打成单个细胞，含10%血清的RPMI-1640培养液倍比稀释到所需的体积，使细胞密2个/mL，接种于12孔板，1000 μL/孔。
度为3×10PBS过一遍，加1ml消化液，弃消化液，10%培养液2ml冲洗细胞，再用枪吸出0.5ml至另一小瓶，3ml 10%培养液，混合（摇15次，吹15次），取100μl到EP管混合，取10μl细胞计数倍比稀释（吸出1ml，加2ml培养液。
Mix。
）吸出1ml，弃剩余液体，将1ml液体倒回小瓶，加2ml培养液。
重复。
直到需要的细胞数。
12600个细胞/3ml，或8400个细胞/2ml。
种板：12孔板，加0.9ml培液，加1ml细胞，不用摇。
②. 待细胞贴壁后加入药物，终体积为2000 μL，设6组0，0.33， 0.66 ，1.33 ，2.66，3.994.66 μg/ml药物组，每组2复孔，转染后置37℃，5％CO，饱2和湿度条件培养箱内孵育7天。
贴壁培养与悬浮培养的区别
悬浮培养 初期的棉 花细胞
继代4次后的 文冠果细胞
分裂旺盛的胡萝卜 细胞
6 生长过程
潜伏期：悬浮,胞质回缩, 全部细胞 变为圆球形。贴附底物。有运动活 动,基本无增殖, 少见分裂相。 指数增长期：是细胞增生最活跃、 活力最旺盛的阶段培养物中细胞数 量呈指数增长,细胞群体均一。 停滞期：细胞数量达饱和密度后， 细胞遂停止增殖，进入停滞期。
可连续收获产物，用于细胞学研究等多 可批量收获产物，用于蛋白质的大量生
种研究领域
产及多种研究领域
细胞生长受表面积限制
细胞生长受培养基中浓度的限制
香花槐愈伤组织及悬浮培养的细胞
1胡海英，赵亚美，阎晓磊，王华芳。香花槐愈伤组织及细胞悬浮培养技术。北京林业大学 学报，2007,29（5）:26-30
4 培养条件
贴壁细胞培养
悬浮细胞培养
容器
需要使用经过组织培养处理的容 使用未经过组织培养处理的容器，但
器
需搅拌或摇晃
设备
温度
贴壁细胞培养
悬浮细胞培养
肌 细
状，并不紧靠连成片，细胞—细
胞
胞接触易断开而单独行动，游离
的单独的成纤维样细胞，常有几
个伸长的细胞突起。
上皮细胞型
名称：仅形态上似体内，实际上 不完全相同。 来源：来源于外胚层、内胚层细 胞, 如：皮肤及其衍生物,消化道， 乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤。 形态：类似体内的上皮细胞扁平， 不规则多角形，中有圆形核。 生长特点：易相连成片，相靠— 紧密相连—成薄层—铺石状 生长时呈膜状移动，很少脱离细 胞群而单个活动。
成纤维细胞型
人
绒
毛
名称：凡在培养中形态与成纤维
间
细胞类似的。
OPTIMEM进行贴壁细胞培养的实验方法
OPTIMEM进行贴壁细胞培养的实验方法贴壁细胞培养是一种常用的细胞培养方法，其中OPTIMEM是一种用于培养特定类型细胞的培养基。
下面将详细介绍使用OPTIMEM进行贴壁细胞培养的实验方法。
实验材料和仪器：1.贴壁细胞系：例如，HEK293细胞或NIH/3T3细胞等。
2. 细胞培养培养基：例如，Dulbecco修改的Eagle培养基（DMEM）或Roswell Park Memorial Institute 1640培养基（RPMI 1640）。
3.OPTIMEM培养基。
4.烧杯和离心管。
5.无菌培养皿。
6.无菌培养壶。
7.显微镜。
8.离心机。
9.生物安全柜。
10.细胞移液器和离心管。
11.无菌培养室。
实验步骤：1.贴壁细胞的准备a.预先处理细胞培养器皿，将其在生物安全柜中用70％乙醇消毒，并用无菌PBS洗涤2次。
b.从细胞培养器皿中收集细胞，可以使用三文鱼糖蛋白酶或胰蛋白酶来消化细胞。
将细胞悬浮在培养基中，并利用细胞计数板在显微镜下计数细胞数。
c.获得所需数量的细胞，通常为1×106细胞/毫升。
d.用无菌PBS洗涤细胞2次并将其重悬于OPTIMEM培养基中，使细胞的最终浓度为1×105细胞/毫升。
e.获取无菌培养皿，将细胞悬浮液转移到培养皿中。
f.将培养皿放入无菌培养室，并将其放入培养箱中进行培养。
2.细胞培养和观察a.将培养皿放入培养箱中，在37℃，5%CO2的恒温培养箱中培养细胞。
b.每天观察细胞的生长情况和形态学特征。
使用显微镜定期检查细胞的形态和密度。
c.检查细胞的污染和部分剥离，如果有必要，及时更换培养基。
3.细胞传代a.当细胞达到80-90％的密度时，用无菌PBS洗涤培养皿。
用胰蛋白酶消化细胞。
注意避免过度消化引起细胞死亡。
b.离心细胞悬浮液，去除上清液。
c.用新的OPTIMEM培养基将细胞悬浮，将细胞转移至新的无菌培养皿中。
d.将培养皿放入培养箱中进行培养。
贴壁细胞传代培养操作步骤
贴壁细胞传代培养操作步骤作文一：给初学者的贴壁细胞传代培养操作指南亲爱的小伙伴们，今天咱们来聊聊贴壁细胞传代培养那些事儿。
想象一下，细胞就像一个个小小的居民，住在培养皿这个“小区”里。
时间长了，“小区”变得拥挤，它们就需要搬家啦，这就是传代培养。
咱们得准备好工具，就像搬家要准备好箱子一样。
要有干净的培养皿、移液器、胰酶等等。
然后，把培养皿从培养箱里拿出来，在超净台里操作，可不能让细菌和灰尘这些“小捣蛋鬼”跑进去。
再加入胰酶，让细胞和培养皿分开，就像把粘在墙上的贴纸轻轻撕下来。
等细胞变圆了，赶紧加新的培养液终止胰酶的作用，不然细胞会受伤的哦。
用移液器把细胞吸出来，平均分到新的培养皿里，给它们新的“家”。
怎么样，是不是没有那么难？多练习几次，你就能熟练掌握啦！作文二：贴壁细胞传代培养，其实很简单朋友们，今天来和大家分享贴壁细胞传代培养的步骤，别害怕，一点都不难！比如说，我之前在实验室第一次做这个的时候，心里也直打鼓。
但做着做着就发现，真的没那么复杂。
咱们开始吧！先把要用的东西都准备好，像培养皿、移液器、胰酶，一个都不能少，这就好比做饭前要把食材和工具都摆好。
接着，把培养皿轻轻拿出来，动作要轻，不然细胞会被吓到的。
然后把里面的培养液吸掉，这就像给花浇水后把多余的水倒掉。
之后加入胰酶，等一会儿，你会看到细胞慢慢变圆，就好像它们在伸懒腰准备搬家。
这时，加新的培养液停止胰酶的作用，再把细胞吸出来，分到新的培养皿里，就大功告成啦！多试几次，你会发现自己越来越熟练，细胞在你的照顾下也会茁壮成长的！作文三：贴壁细胞传代培养，轻松上手小伙伴们，细胞传代培养听起来是不是很高深？其实很简单，跟我来！假设细胞是一群可爱的小朋友，在一个小小的教室里待久了，就得换个大点儿的教室，这就是传代培养。
第一步，把所有的“装备”都准备齐全，像新的培养皿、移液器，还有胰酶，这就像给小朋友们准备新的书包和文具。
第二步，把装着细胞的培养皿从“小房子”（培养箱）里拿出来，放在干净的“桌子”（超净台）上。
贴壁细胞培养流程
贴壁细胞培养流程1.将自己的细胞取出来，观察密度。
（细胞密度大于等于80%就可以处理了）2.准备传代需要的实验器材及试剂（5ml、1ml枪头，PBS,培养基，废液缸）3.将培养瓶中培养液倒出（培养瓶举高一点，不要太靠近废液缸，以免污染）4.每次加3ml左右PBS洗细胞，洗两次（注意不要将细胞吹打下来。
用PBS洗的目的：传代细胞所用的培养基一般含有血清，而血清能影响胰酶的活性，使其失效，因此一般在加胰酶之前会用PBS洗一下，避免胰酶活性降低）5.加入1ml胰酶，前后摇匀，在显微镜下观察其形态（为什么用胰酶消化：细胞外含有多种胞外蛋白,如胶原蛋白。
这些蛋白使细胞间或细胞与培养瓶内壁粘连起来。
用胰蛋白酶分解这些蛋白质后它们就分开了。
胰酶消化过度：消化过度，一方面会对细胞本身造成伤害，另一方面，造成细胞流失，也就是吸取消化液时，由于消化过度，其中大量溶在消化液中的细胞被吸走，导致细胞数量减少）6.等到细胞变圆，没有连成一片且开始慢慢脱落下来的时候就可以终止消化了（如果想加速消化，就把细胞放回培养箱）7.终止消化：加入5ml左右培养基，并将细胞吹打下来。
吹打完后在显微镜下观察吹打情况。
（注意四个角落的细胞是否吹打下来）8.把细胞吸到离心管中，离心5分钟1000转。
9.离心完后取出离心管，离心管底部有一团白色的细胞。
10.倒出培养液，加入2ml左右培养基并吹散细胞。
11.取出一个培养瓶，加入7ml左右培养基。
12.吸取左右细胞加入培养瓶，混匀培养瓶中细胞并前后摇匀。
做好标记，放入培养箱。
（吸取前先混匀离心管中细胞。
）。
贴壁培养实验报告
一、实验目的1. 掌握动物细胞贴壁培养的基本方法。
2. 观察细胞贴壁、生长、增殖过程。
3. 了解细胞培养技术的基本原理和应用。
二、实验原理动物细胞贴壁培养是一种常见的细胞培养方法，适用于大多数动物细胞。
该方法将细胞悬浮于含有营养物质的培养液中，使其附着于培养皿底部或盖玻片上，形成单层或多层细胞。
在适宜的培养条件下，细胞可进行增殖、分化等生物学活动。
三、实验材料1. 细胞：小鼠成纤维细胞2. 培养基：DMEM培养基3. 试剂：10%胎牛血清、青霉素-链霉素混合液、0.25%胰蛋白酶4. 仪器：超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、移液器、培养皿、盖玻片等四、实验方法1. 细胞复苏：将冷冻保存的细胞取出，用预热的DMEM培养基溶解，37℃水浴箱中复温至37℃，加入10%胎牛血清、青霉素-链霉素混合液，制成细胞悬液。
2. 细胞接种：将细胞悬液用移液器吸取，接种于培养皿中，每孔加入2ml细胞悬液，置于CO2培养箱中培养。
3. 细胞传代：待细胞生长至80%左右融合时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，制成细胞悬液。
按照1:3的比例传代培养。
4. 观察细胞贴壁、生长、增殖过程：每隔一定时间，观察细胞在培养皿中的生长状态，包括细胞形态、数量、融合程度等。
五、实验结果1. 细胞复苏：冷冻细胞在37℃水浴箱中复温后，逐渐恢复活力，出现典型的细胞形态。
2. 细胞接种：细胞接种后，约24小时开始贴壁，约48小时形成单层细胞。
3. 细胞传代：细胞传代后，生长状态良好，形态、数量、融合程度与原代细胞相似。
4. 细胞生长曲线：观察细胞生长过程，绘制细胞生长曲线，显示细胞呈指数增长。
六、实验讨论1. 本实验成功实现了动物细胞贴壁培养，观察了细胞贴壁、生长、增殖过程。
2. 细胞贴壁培养过程中，温度、CO2浓度、pH值等环境因素对细胞生长具有重要影响。
本实验中，CO2培养箱的温度设置为37℃，CO2浓度为5%，pH值稳定在7.2-7.4。
细胞贴壁原理
细胞贴壁原理
细胞贴壁原理是指在细胞培养的过程中，细胞在培养皿的底部或侧壁紧密贴附的现象。
通过这种贴壁原理，细胞可以获得足够的接触面积和养分供应，从而维持其正常的生理功能。
细胞贴壁原理的实质是靠细胞表面的黏附分子与培养基或基质表面的黏附分子之间的相互作用来实现的。
黏附分子可以是细胞膜上的蛋白质或糖类，而培养基或基质表面的黏附分子则可以是胶原蛋白、纤维蛋白等。
细胞贴壁原理的关键在于选择适合特定细胞黏附的培养基或基质，以及提供合适的培养条件。
一般来说，细胞需要在适当的温度、湿度和氧气浓度条件下进行培养。
此外，细胞贴壁还受到细胞形态、细胞密度以及培养皿的表面特性等因素的影响。
细胞贴壁原理在细胞培养和组织工程等领域具有重要的应用价值。
通过优化培养条件和培养基的配方，可以促进细胞的贴壁和增殖。
此外，研究人员还可以根据细胞贴壁原理，设计和制造具有特定表面性质的材料，以促进细胞黏附和生长，从而实现组织修复和再生。
贴壁细胞培养
北京索莱宝科技有限公司
贴壁细胞培养
细胞名称：293T，人胎肾细胞
生长特性：贴壁生长
培养条件：DMEM-H(4.5g/L Glucose）+10%FBS
传代方法：1:3～1:4传代，一周2~3次
冻存条件：细胞冻存液
细胞处理方法：
1.细胞在培养瓶中培养至状态良好后灌满培养基运输，获得细胞后用酒精棉球擦拭瓶口消毒，然后在超
净台中操作。
2.如细胞生长至70%-80%，将瓶中的培养基移入无菌瓶中留作培养使用，保留5-8mL培养基在37℃、5%
的CO2的温箱中继续培养。
细胞培养至90%-100%后，按要求消化传代。
3.弃去培养基，用无菌PBS或者其他缓冲液清洗细胞2次，加入适量胰蛋白酶消化（EDTA胰酶），待细胞
完全脱壁且细胞连接松散时再吹打，将细胞分离成单个后，加培养基混匀，分瓶培养。
特别注意：（如使用公共实验室或初次接触细胞培养，建议添加双抗培养）
1.我们使用自产培养基及进口血清培养细胞，在您拿回细胞后，如想更换其它品牌培养基，请依照逐次替换的原则，先保留培养瓶中的培养基，多日多次代逐步更换，以减轻对细胞的刺激。
2.如签收时出现培养瓶壁破裂，漏液等情况请及时拍照并联系售后。
3.细胞任何售后问题，均需拍照存档并在2周之内及时联系客服。
第1页，共1页。
贴壁细胞培养步骤及注意事项
贴壁细胞培养步骤及注意事项第一步：准备工作1.1清洁实验台面和培养器具在开始培养之前，应先清洁培养器具和实验台面，以确保无菌环境。
1.2准备培养基根据不同实验的要求，准备需要的培养基，并确保其无菌。
1.3预热培养基和器械将培养基和器械置于37℃的培养箱中，使其达到需要的温度。
第二步：细胞分离2.1收集细胞使用无菌技术，收集需要培养的细胞，最好使用处于快速生长期的细胞。
2.2细胞计数使用显微镜和计数板计数细胞数目，以便确定接种的细胞数量。
2.3离心细胞将细胞离心，去除上清液。
第三步：贴壁培养3.1接种细胞将细胞重新悬浮在预热的培养基中，并根据需要的细胞浓度接种到培养器皿中（例如培养皿、培养瓶等）。
3.2倾斜培养器具倾斜培养器具，以确保细胞均匀分布并黏附于底部。
3.3培养器出现倒置的小液滴密封培养器，以防止培养基蒸发和外界污染。
第四步：培养条件4.1恒温条件将培养器放在恒温箱中，维持适当温度（通常为37℃）和湿度。
4.2CO2条件对于一些细胞，需要提供CO2环境以保持合适的pH值。
可以通过加入CO2气体或培养箱添加CO2控制器来实现。
4.3培养时间根据细胞类型和所需实验目的，确定合适的培养时间。
第五步：观察和维护细胞5.1细胞观察使用显微镜定期观察细胞的形态和增长情况。
注意检查细胞的黏附性和细胞层的均一性。
5.2细胞维护根据需要，定期更换培养基，以保持细胞的正常生长和功能。
5.3细胞传代根据细胞生长状态，当细胞层达到一定的密度时，可进行细胞的传代，以保持细胞的活性和健康。
注意事项：1.确保所有用于细胞培养的器具和培养基都是无菌的，以防止细胞受到外界污染。
2.严格遵循无菌技术，避免任何可能导致细菌和真菌污染的操作。
3.细胞培养过程中，保持实验室卫生，定期清洗工作台和设备。
4.在细胞培养中，要注意避免细胞的过度处理和操作。
5.对于一些特殊类型的细胞，如原代细胞，可能需要特殊的培养条件和技术，需要进行额外的注意和维护。
细胞贴壁实验报告
一、实验目的1. 掌握细胞贴壁生长的基本原理和方法。
2. 了解细胞培养过程中细胞贴壁生长的重要性。
3. 观察细胞在不同条件下的贴壁生长情况，分析影响细胞贴壁生长的因素。
二、实验原理细胞贴壁生长是细胞在体外培养过程中的一种重要生长方式。
细胞在培养皿表面贴附，通过细胞与培养皿表面的相互作用，细胞逐渐伸展、增殖。
细胞贴壁生长对于细胞培养、细胞实验和药物筛选等具有重要意义。
三、实验材料1. 细胞：小鼠心肌细胞（HL-1细胞）2. 培养基：DMEM培养基、胎牛血清3. 培养工具：培养皿、移液枪、吸球、无菌操作台、显微镜、盖玻片、载玻片4. 实验试剂：0.5%多聚赖氨酸、PBS缓冲液、胰蛋白酶四、实验步骤1. 预处理：将细胞从培养瓶中取出，用胰蛋白酶消化后，用PBS缓冲液清洗细胞，收集细胞悬液。
2. 细胞贴壁：将细胞悬液加入培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
3. 贴壁条件优化：1）将盖玻片在0.5%多聚赖氨酸溶液中浸泡5-10分钟，自然晾干后，将其放置于培养皿底部。
2）将细胞悬液加入盖玻片上，使其均匀铺展。
3）将培养皿置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
4. 观察与记录：1）每隔一定时间（如1小时、2小时、4小时等），在显微镜下观察细胞贴壁生长情况。
2）记录细胞贴壁生长速度、细胞形态、细胞数量等指标。
5. 数据分析：1）根据观察结果，绘制细胞贴壁生长曲线。
2）分析影响细胞贴壁生长的因素，如培养时间、细胞密度、培养条件等。
五、实验结果与分析1. 细胞贴壁生长曲线：细胞在培养皿中贴壁生长，随着时间的推移，细胞数量逐渐增加，细胞形态逐渐伸展。
2. 影响细胞贴壁生长的因素：1）培养时间：细胞贴壁生长速度随培养时间的延长而增加，但过长的培养时间会导致细胞密度过大，影响细胞生长。
2）细胞密度：细胞密度越高，细胞贴壁生长速度越快，但过高的细胞密度会导致细胞相互挤压，影响细胞生长。
3）培养条件：适当的温度、pH值、气体环境等有利于细胞贴壁生长。
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贴壁细胞培养
一、克隆形成抑制试验
原理：克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆（集落），这时的每个克隆可含50个以上的细胞，大小在0.3-1.0 mm之间。
通过克隆形成实验，可对单个细胞的增殖潜力做出作定量分析，了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性。
这种方法常用于抗癌药物敏感性实验、肿瘤放射生物学实验等。
常见的有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。
本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的肿瘤细胞和正常细胞。
材料与方法
（一）用品：
含15%新生牛血清的RPMI-1640培养液、含10%新生牛血清的RPMI-1640、培养液PBS、0.25%胰酶、细胞染色液（刘氏染液）、相机、12孔板、EP 管。
5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），用无菌生理盐水配制成100 μg/ mL溶液，使用前稀释至所需
浓度。
（二）操作：
①. 制备细胞悬液：取对数生长期结肠癌SW620细胞，用0.25%胰酶消化并吹打成单个细胞，含10%血清的RPMI-1640培养液倍比稀释到所需的体积，使细胞密度为3×102个/mL，接种于12孔板，1000 μL/孔。
PBS过一遍，加1ml消化液，弃消化液，10%培养液2ml冲洗细胞，再用枪吸出0.5ml至另一小瓶，3ml 10%培养液，混合（摇15次，吹15次），取100μl到EP管混合，取10μl细胞计数
倍比稀释（吸出1ml，加2ml培养液。
Mix。
）
吸出1ml，弃剩余液体，将1ml液体倒回小瓶，加2ml培养液。
重复。
直到需要的细胞数。
12600个细胞/3ml，或8400个细胞/2ml。
种板：12孔板，加0.9ml培液，加1ml细胞，不用摇。
②. 待细胞贴壁后加入药物，终体积为2000 μL，设6组0，0.33， 0.66 ，1.33 ，
，饱2.66， 3.99 4.66 μg/ml药物组，每组2复孔，转染后置37℃，5％CO
2
和湿度条件培养箱内孵育7天。
计数：
满体积2000ul 其中药物浓度100ug/ml 100ul
NS: 0 100 N=2
0.33 μg/ml *2000ul =100ug/ml * X X =6.6ul + NS 93.4ul N=2
0.66 μg/ml *2000ul =100ug/ml * X X =13.2ul + NS 86.8 ul N=2
1.33 μg/ml *2000ul =100ug/ml * X X = 26.6ul + NS 73.4ul N=2
2.66 μg/ml *2000ul = 100ug/ml * X X =5
3.2ul + NS 46.8 ul N=2
3.99 μg/ml *2000ul =100ug/ml * X X =79.8 ul + NS 20.2 ul N=1
4.66μg/ml *2000ul =100ug/ml * X X =93.2 ul + NS 6.8 ul
N=1
eg:5-FU 6.6 * 3 + NS 93.4 * 3 mix 在EP管中。
等待加药。
N=2
③. 吸去培养液，加入PBS洗涤后，染色,干燥：
刘氏染色法
加Liu A Solution 0.5 ml染色30 s。
滴加Liu B Solution 1ml于A液上面,轻吹使其充分混合,染色1 min。
水洗, 干燥、拍照
二、细胞传代
原理：培养细胞生长一定时间后，需分离再培养，否则细胞因生存空间不够，细
胞密度过大，致营养不足而引起细胞衰老、停止生长甚至死亡。
为了维持细胞的
存活和生长，必须进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养
瓶内继续扩大培养。
材料与方法
（一）用品：
含10%新生牛血清的RPMI-1640、培养液PBS、0.25%胰酶、EP管，细胞培
养瓶。
（二）操作：
①制备细胞悬液：取对数生长期结肠癌SW620细胞，PBS过一遍，加1ml0.25%
胰酶消化并吹打成单个细胞，弃消化液，10%培养液2ml冲洗细胞，再用枪吸出0.5ml至另一小瓶，3ml 10%培养液，混合（摇15次，吹15次），取100μl到EP管混合，取10μl细胞计数用。
②细胞传代：在之前制备的细胞悬液2.5ml中，用滴管吸取1/3滴管至细胞培养瓶，后用滴管吸取3滴管含10%新生牛血清的RPMI-1640至细胞培养瓶，关紧瓶
盖用酒精棉球搽拭后，放入37℃5%CO
培养箱中孵育。
2
三、MTT比色法
原理：MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法。
实验所用的显色剂是一种能接受氢原子的染料。
化学名3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐。
商品名噻唑蓝，MTT。
活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的兰紫色结晶物，并沉积在细胞中。
而死细胞无此功能。
二甲基亚砜DMSO能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其吸光值，可间接反应活细胞数量，在一定的范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。
与其他检测方法如细胞计数法，3H掺入法，LDH法有良好的相关性。
材料与方法
（一）用品：
1 MTT液：称取250mgMTT，放入小烧杯内，加50ml PBS（0.01M， pH7.4）在电
磁力搅拌仪上搅拌30min。
用0.22 um的微孔滤器除菌，分装4度保存，2周内有效。
2. 10%新生牛血清的RPMI-1640， 0.25%胰酶，DMSO（分析纯）
3. 5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），
用无菌生理盐水配制成100 μg/ mL溶液，使用前稀释至所需浓度。
（二）步骤
1. 接种细胞，用0.25%的胰酶消化细胞，1min,弃胰酶。
2. 用10%小牛血清的1640培养液配成单个细胞，取100μl到EP管中，吹打，
计数。
3. 配5000个细胞/120ul。
用96孔板，设0， 2， 4， 8， 16，24 μg/ml
组每空加入120μl细胞。
培养。
4. 第二天，加入药物40μl。
5，培养48h。
每孔加入MTT（5mg/ml）20μl，继续培养4h。
小心吸弃孔内的上清液。
6. 每孔加入150μl的DMSO，震荡10min，570nm 测吸光值。
满体积160ul 其中药物40μl 药物浓度100ug/ml(对照组加40μlNS)
2μg/ml *160ul = 100ug/ml * X X = 3.2 ul + NS 36.8 ul
4μg/ml *160ul = 100ug/ml * X X = 6.4ul + NS 33.6 ul
8μg/ml *160ul = 100ug/ml * X X = 12.8ul + NS 27.2 ul
16μg/ml *160ul = 100ug/ml * X X =25.6 ul + NS 14.4 ul
24μg/ml *160ul = 100ug/ml * X X =38.4 ul + NS 1.6 ul
5-FU 3.2 * 4 + NS 36.8 * 4 mix 在EP管中。
等待加药。
CCK-8法步骤
1. 接种细胞，用0.25%的胰酶消化细胞，1min,弃胰酶。
2. 用10%小牛血清的1640培养液配成单个细胞，取100μl到EP管中，吹打，
计数。
3. 配5000个细胞/120ul。
用96孔板，设0， 2， 4， 8， 16，24 μg/ml
组每空加入120μl细胞。
培养。
4. 第二天，加入药物40μl。
5，培养48h。
每孔加入CCK-8溶液10μl，继续培养30—90min。
6. 震荡10min，450nm 测吸光值。