实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠p38的变化及益肾达络饮的影响_尚晓玲

实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠p38的变化及益肾达络饮的影响尚晓玲1,高 颖2,王硕仁2,尹 岭3,张笑明3(11长春中医药大学基础医学院中医基础教研室,吉林长春130117;21北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部重点实验室,北京100700;31解放军总医院神经信息中心,北京100853)摘 要:目的:研究中药复方益肾达络饮对PLP139-151诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中枢神经系统内p38的影响,探讨益肾达络饮在神经系统炎性脱髓鞘疾病中的作用机制。

方法:采用免疫组化技术,测定各组小鼠中枢神经组织中p38蛋白含量。

结果:p38表达正常组与模型组、激素组、中药组比较均有极显著性差异(P 值均<0101);与模型组比较,激素组有显著性差异(P <0105),中药组有极显著性差异(P <0101);激素组与中药组比较,有显著性差异(P <0105)。

结论:EAE 小鼠p38表达升高,提示EAE 病变过程中可能激活p38MA PK 信号转导通路。

醋酸泼尼松、益肾达络饮均能降低EAE 小鼠中枢神经组织内p38的表达,且益肾达络饮优于醋酸泼尼松。

益肾达络饮对自身免疫性脑脊髓炎小鼠保护作用可能通过下调p38,抑制p38M APK 活化,从而改善机体免疫紊乱。

关键词:自身免疫性脑脊髓炎;多发性硬化;益肾达络饮;p38中图分类号:R 28515 文献标识码:A 文章编号:1000-1719(2009)03-0478-04Effect of Y i nshendaluo Decoction on p 38in t h eM ice of Experi m ental Au t oi m m une Encephalo m yelitisS H AN G X iao -li ng 1,GAO Y ing 2,W AN G Shuo -ren 2,YI N L ing 3,Z H AN G X iao-m ing 3(1.D epart m ent of Basic Theory of T rad itional ChineseM ed icine ,P recli nicalM e d ici ne Colle g e ,Changchun Un i vers it y of Ch i nese M edicine ,Changchun 130117,J ili n 13117;2.K e y Lab of N linistry of Education on InternalM edicine of TC M,D eng Zhi men H es p it al ,Beijin g Uni versity of Chi neseM e d icine ,B eijing 100700,Chi na ;3.N eural Information C enter,GeneralH osp it al of Peop le 's Liberation A rmy,Beijing 100853,China)Abstrac t :O bjective :T o i nvesti gate t he e ffect o f Y ishenda l uo decocti on on p38,one k i nd of m itogen acti vated pro te i n ki nase(MA PK ),i n cen tra l nervous syste m of the m ice w ith PLP139-151-i nduced experi m ental auto i m mune encepha l omye liti s and to explore the m echanis m of Y ishenda l uo decocti on on t he i n fla mma t o ry de m ye li nati ng d i seases i n the nervous sy stem .M ethods :Fe -m ale m ice were evenly random ized i nto no r ma ,l m ode,l contro l and treat m ent groups .T he contents o f p38prote i n i n the four g roups abov e w ere detected w it h i m m unoh i stochem icalm ethod .Results :The contents of p38i n mode ,l contro l and trea t m ent groups we re all si gnificantl y higher than those in nor m al group(P <0101,0101and 0101respecti ve l y).Co mpared w ith m odel g roup ,t he aug m enta -ti on contents of p38i n centra l nervous syste m w ere reduced si gn ificantl y i n both contro l and treat ment groups (P <0105and P <0101respectively),and itw as sho wn statisticall y sign ifi can t differences bet ween the t wo g roups above(P <0105).Conclusion :T he resu lts o f presen t study i ndica te t hat Y i shenda l uo decocti on can protect the mouse fro m t he experi m enta l autoi m mune encephalo mye -liti s by attenuati ng the content o f p38,i nh i biti ng the acti vati on of p38MA PK and i m prov i ng i m munologic derange m ent .K ey word s :A uto i m mune encepha lo m yeliti s ;M ultiple sc leros i s ;Y i shendaluo deco cti on ;p38收稿日期:2008-07-01基金项目:国家自然科学基金资助(30672692)作者简介:尚晓玲(1975-),女,主要从事中医治疗神经免疫性疾病的研究。

通讯作者:高颖(1963-),女,教授,博士生导师,主要从事中医药防治急性脑血管病、多发性硬化的临床与基础研究。

E -ma i :lC hen-t ang @实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE )是由同种型、同种异型、异种型神经组织诱导的,局限于C NS 白质内的免疫炎性脱髓鞘性疾病,是研究多发性硬化(M S)的经典动物模型。

笔者先前的研究表明[1-3],益肾达络饮能够减少EAE 的炎症介质产生,减轻炎症反应对机体的损伤,但其中的中间环节尚不清楚。

p38是哺乳动物细胞中被发现的第3种丝裂原活化蛋白激酶(MAPK ),主要被炎症因子及细胞应激(如紫外线、细胞外高渗、热休克等)激活[4],产生大量炎性因子,加重机体炎症反应。

为进一步进行E AE 发病机制及中药复方对机体免疫调节的节点研究,本实验采用免疫组化方法,通过从蛋白水平研究E AE 中枢神经组织内p38MAP K 活化的影响,揭示益肾达络饮是否通过p38MAP K 起作用,而改善机体免疫紊乱。

1 材料与方法111 实验动物 8~12周龄的SJ L /J 雌性小鼠36只由美国Jackson 实验室提供。

112 实验环境 SJ L /J 小鼠饲养和部分实验在解放军总医院实验二级动物中心饲养室内进行,室温为20e ~25e ,相对湿度40%~60%,自然光照。

合格证号:sxrxk(军)2002-004。

SJ L /J 小鼠在实验前清洁饮水,自由饮食。

113 主要药物与试剂来源 抗原PLP139-151(H S L -GKWLGHPDKF)多肽购自北京赛百盛生物工程公司,纯度85%以上;百日咳杆菌购自北京生物制品研究所。

完全福氏免疫佐剂购自美国sig m a 公司。

M CP -1免疫组化、原位杂交试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司;醋酸泼尼松购自天津力生制药股份有限公司(批号0407018),醋酸泼尼松经研钵粉碎后以双蒸水溶解,充分混匀,配成01039%浓度。

4e保存,使用前混摇均匀。

益肾达络饮(由熟地、鹿角胶、栀子、石菖蒲、生甘草等组成)饮片购自北京中医药大学东直门医院药房,中药饮片煎煮前40e~60e温水浸泡60m i n。

急火煮沸,再用小火、慢火慢慢煎熬,保持微沸状态即可,煎30~60m i n。

用过滤器去渣倒出后的药汁,继续浓缩制成2g生药/mL的水提物,分装灭菌后4e保存备用;p38免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

114动物模型制备用PLP139-151抗原免疫小鼠:将100L l PLP139-151水溶液(含PLP139-151 150L g)与100L L完全福(氏)免疫佐剂(含结核杆菌H37RA400L g)混合,充分乳化制成油包水的抗原配剂。

第1天给予SJ L/J小鼠上腹部皮下注射012mL的抗原配剂,第1天和第3天给予静脉注射011m L(含016@106个百日咳杆菌)百日咳杆菌液。

115分组及给药实验小鼠共随机分为4组:正常组(N or m a l)、模型组(M ode l)、激素组(C ontr o l)、中药组(T reat m ent),每组9只。

正常组不作任何处理,模型组造模后7天开始每天给予生理盐水012mL灌胃14天,中药组造模后7天开始每天按每公斤体重2g生药量给予益肾达络饮012mL灌胃14天,激素组造模后7天开始每天按每公斤体重01078m g药量给予012mL 醋酸泼尼松灌胃14天。

116神经功能评价免疫后所有动物每天称体重并进行神经功能评价,动物发病程度的判断根据Kono 等[2]提出的标准:0分,不发病;1分,尾部张力降低或轻度步态笨拙;2分,尾部无张力,和/或中度步态异常,和/或姿态维持缺乏;3分,肢体力弱;4分,肢体麻痹;5分,濒死状态。