Illumina测序基础知识

第一个要给大家讲的，是它这个flowcell。Flowcell翻成中文，就叫“流动池”。我们来看这个图片。图片当中，我们看到一个象载玻片大小的芯片。这个芯片里面，是做了8条通道。在这个通道的内表面，是做了专门的化学修饰。它的化学修饰，主要是用2种DNA 引物，把它（2种DNA引物）种在玻璃表面。

这两种（DNA引物的）序列是和接下来要测序的DNA文库的接头序列相互补的。而且这2种引物是通过共价键，连到Flowcell上去。之所以要用共价键连到Flowcell上去，是因为接下来有大量的液体要流过这个Flowcell，只有有共价键连接的这些DNA，才不会被冲掉。这就是Flowcell。

再接下来，讲一下文库、和文库的制作（过程）

所谓的DNA文库，实际上是许多个DNA片段，在两头接上了特定的DNA接头，型成的DNA混合物。

文库有2个特点，第1个特点，是当中这一段插入的DNA，它的序列是各种各样的。第2个特点，它的两头的接头序列，是已知的，而且是人工特地加上去的。要做这个文库，首先是把基因组DNA，用超声波打断。然后打断之后，两头用酶把它补平，再用Klenow酶在3’端加上一个A碱基。然后，再用连接酶把这个接头给连上去。

连好了接头的DNA混合物，我们就称为一个“文库”。英文也称作“library”。

做好了Library之后，就要做桥式PCR了。桥式PCR，实际上是把文库种到芯片上去，然后进行扩增，这样的一个过程。

这个过程，首先是把文库加入到芯片上，因为文库两头的DNA序列，和芯片上引物是互补的，所以，就会产生互补杂交。

杂交完了之后，我们在这里面加入dNP和聚合酶。聚合酶会从引物开始，延着模板合成出一条全新的DNA链来。

新的这条链，和原来的序列是完全互补的。

接下来，我们再加入NaOH碱溶液。DNA双链在NaOH碱溶液存在下，就解

链了。而且被液流一冲，原来的那个（模板）链，也就是没有和芯片共价连接的链，就被冲走了。而和芯片共价连接的链，就被保留下来。

然后，我们再在液流池里加入中性液体，主要是为了中和这个碱液，在加入中和液之后，整个环境变成中性了。这时侯，DNA链上的另外一端，就会和玻璃板上的第二种引物，发生互补杂交。

接下来，我们加入酶和dNTP，聚合酶就延着第二个引物，合成出一条新链来；然后，我们再加碱，把2条链解链解开；然后，我们再加中和液，这时侯，DNA 链会和新的引物杂交。再加酶，再加dNTP，又从新引物合成出新的链来。

连续重复这一过程，DNA链的数量，就会以指数方式增长。

在桥式PCR完成之后，接下来要做的工作，就是要把合成的双链，变成可以测

序的单链。

办法是通过一个化学反应，把其中一个引物上的一个特定的基团给切断掉。

然后，再用碱溶液来洗这个芯片。这时侯，碱让DNA的双链解链，那根被切断了根的DNA链就被水冲掉了。留下那根共价键连在（芯片）上面的链。

接下来，再加入中性溶液，然后在这个中性溶液里面加入测序引物。

好，接下来正式的测序工作就开始了。

那么，在测序的时侯，加入进去的，最主要是2个东西：一个是带荧光标记的dNTP。而这个dNTP，它还有一个特点，它的3’末端是被一个叠氮基堵住的。然后，再加一个聚合酶，聚合酶就会选择：哪一个dNTP是和原来位置上的那个碱基是互补的，根据互补性原理，把这个dNTP合成到新的这个DNA链上去。

因为这个dNTP的3’端是被一个叠氮基团堵住了，所以，它一个循环只能延长

一个碱基。然后，它就停在那儿了。

合成完了之后，就用水把多余的dNTP和酶给冲掉。

冲掉之后，就放到显微镜下，去进行激光扫描。根据发出来的荧光来判断它是哪个碱基。

因为4种dNTP，它每一种dNTP上面标的荧光素都不一样，根据红、黄、蓝、

绿，它出来的哪种颜色，那么，就可以倒过来推出来，这个新合成上去的碱基，是哪种碱基。

因为新合成的碱基，是和原来位置（的碱基）是互补的，所以，又推出模板上那个碱基是哪个。

这一个循环完成之后，就加入一些化学试剂，把叠氮基团和旁边标记的荧光基团切掉。切完了之后，3’端的羟基就暴露出来。

再接下来，加入新的dNTP和新的酶，然后，又延长一个碱基。新延长完一个碱基之后，把多余的酶和dNTP冲掉，再进行一轮显微的激光扫描，再读一下

这个碱基是什么。

不断重复这个过程，可以重复上百次，到几百次，就可以把上百个碱基，甚至更多碱基的序列读出来。

那么，什么是Index哪？是因为Illumina的评委会个测序量很大，往往一个样

本，用不了那么几亿条DNA。所以，科学家就想了一个办法。在文库的接头上

做了一些标记，每一个样本，它有一个特定的接头，每个接头里面，它有一段特定的序列。

这段特定的序列，我们就称为Index。也有人把它叫做Barcode，反正，表达的是一个意思：这么一段特定的序列，标记了样本的来源。

那么，要读这个Index的序列，先用碱把上面这根测完“Read 1”的序列，把

上面这根DNA链给解链掉。

解链掉之后，再加入中性液，然后，加入“Read 2”这个测序引物。Read 2测序引物结合的位点，正好，就在这个Index序列的旁边。

接下来，就进行第2轮测序，一般来说，是读6到8个碱基。把这6到8个碱基读下来，我们就可以知道，这某一个具体的一段DNA，它来自于原始的哪个样本。

这是Illumina的最核心的另外一个技术，就是双端测序。

那么双端测序，就是说，一根DNA链，除了从正向读一遍，还可以从DNA的负向，再读一遍。

这一下子就把Illumina测序的有效长度加了一倍。这是非常有实际用途的。

那么这个倒链的过程，是这样，先让这个DNA先合成，合成出来这根互补链。

有了这个互补链之后，用一个化学试剂，在原来这根链的根上切一下。切一下，原来这根模板链就掉了，剩下那根互补链。

再接下来，就进行第2端的测序。第2端的测序原理，和第一端的测序原理是一样的。

加上了“Read 3”的这个引物，依次往下，一个一个碱基地往下读。

那么最重要的事情是什么呢？一个点，经过几百个循环，就读出了几百个碱基。但实际上，这个芯片上可以有上亿个点，上亿个“cluster”，也就是“簇”。那么上亿个“cluster”，每个循环，它都可以读出地么多序列，这是Illumina

测序非常强大的原因。因为是成千上万，准确说是上亿上链都在合成，这个就得到了很大的一个测序数据量。