转基因小鼠的鉴定

转基因小鼠的鉴定集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#

转基因小鼠的鉴定

一、剪鼠尾

1.剪鼠尾的时间当新生的小鼠年龄达到两到三周（耳朵已经长开）时剪鼠尾较好，

此时鼠尾剪起来比较容易且小鼠的生命力比较强。

2.分辨小鼠的年龄

a当小鼠整个身体较红且腹部无奶时，此小鼠当天出生或前一晚出生；

b当小鼠腹部有奶（腹部有一小团白色物质），此小鼠出生2~3天；

c当小鼠背部长出皮毛时，此小鼠出生3~4天；

d当小鼠毛长全，但眼未开时，此小鼠出生10天左右；

e当小鼠眼刚开，耳未开时，此小鼠出生12天左右；

f当小鼠耳刚开时，此小鼠出生14天左右。

3.剪鼠尾后对小鼠的标记：打耳孔法

二、从鼠尾中提取DNA

采用鼠尾基因组DNA提取试剂盒（康为世纪：cw2094）提取DNA，操作如下：

1.剪取小鼠长度为的尾巴，放入灭菌后的离心管中，加入180μL Buffer GTT。震荡混

匀。

2.加入20μL proteinase K，涡旋震荡，彻底混匀。

3.置于56℃水浴，直到组织溶液完全清澈，一般需消化6-8h，赋予过程中涡旋震荡，

使样品均匀分离。

注意：

1）如果赋予和涡旋震荡后仍然有胶状物质，必要时过夜消化再加入20μl

proteinase K消化，不会影响后续操作。

2）如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4μl浓度为100mg/μl的RNase A 溶液，震荡混匀，室温放置5-10min。

4.14000rpm 离心 1min，以消除未消化的类似于鼠毛等组织，将上清转移到一个新的灭过菌的离心管中。

5.加入200μl Buffer GL，涡旋震荡，充分混匀，加入200μl 无水乙醇，涡旋振荡，充分混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

注意：

1）加入Buffer GL 和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。

2）如果多个样品一起操作，Buffer GL 和无水乙醇可以等比例混匀后一起加入样品。

3）加入Buffer GL 和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续操作。

6.将步骤5中所得到的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若以此不能加完溶液，可分多次转入。10000rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7.向吸附柱中加入500μl Buffer GW1（使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm 离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

8.向吸附柱中加入500μl Buffer GW2（使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm 离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤8。

9.12000rpm 离心 2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾

干。

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切，PCR等）。

10.将吸附柱置于一个新的灭过菌的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-

200μl Buffer GE或灭菌水，室温放置2-5min，10000rpm 离心 1min，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。

注意：

1）如果下游实验对PH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱，洗脱液的PH值对洗脱效率有很大影响，若用水作洗脱液应保证其PH值在直接，PH值低于时洗脱效率不高。

2）离心前室温孵育5min可增加产量。

3）用另外的50-200μL Buffer GE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。

4）如果需要提高DNA的终浓度，可以将步骤10所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上，重复步骤10；若洗脱体积小于200μL，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。

三、PCR

PCR程序设定：

1＝ 94.0℃ for 5:00

2＝ 94.0℃ for 1:00

3＝ 59.0℃ for 0:50

4＝ 72.0℃ for 1:00

5＝ Goto 2 2times

6＝ 94℃ for0:50

7＝ 58℃ for 0:50

8＝72℃ for 1:00

9＝Goto 6 2times

10＝ 94.0℃ for 0:50

11＝56.0℃ for 0:50

12＝ 72.0℃ for 1:00

13＝ Goto10 32times

14＝ 72.0℃ for 10:00

15＝ 4.0℃ for 5:00

16＝END

目前实验室的双转基因小鼠AD体系采用：

PCR反应的体系（12μl）：APP

Primer APP-1 μl

Primer APP-2 μl

ddH2O 2μl

mix（CW0682） 6μl

DNA 1μl

PCR反应的体系（12μl）：PS1

Primer PS1-1 μl

Primer PS1-2 μl

内参-1 1μl

内参-2 1μl

mix（CW0682）6μl

DNA 1μl

先在的EP管中加入总的体系再平均分装入各个PCR管中（一般多加两小管的量），将移液器调到总量的1/3到1/2体积在EP管中缓慢抽吸若干次（尽量避免产生气泡）以便Taq酶混合均匀，最后再在各PCR管中依次加入DNA样品。