多克隆抗体制备
多克隆抗体的制备方法
多克隆抗体的制备方法多克隆抗体是由多个不同的免疫细胞（多克隆）产生的抗体混合物，可以识别并结合到目标生物标志物上。
多克隆抗体在科学研究、临床诊断和治疗中具有重要的应用价值。
制备多克隆抗体需要经过一系列复杂的实验流程，下面将详细介绍多克隆抗体的制备方法。
一、抗原的选择在制备多克隆抗体时，首先需要选择一个合适的抗原。
抗原通常是目标生物标志物的蛋白质或多肽片段。
选择抗原的关键因素包括其表达水平、稳定性和纯度。
抗原的选择直接影响到最终多克隆抗体的亲和力和特异性。
二、免疫小动物免疫小动物通常是用于制备多克隆抗体的主要实验动物，例如小鼠、兔子、大鼠等。
在免疫前需要确保小动物健康，并对其进行相应的预处理，如注射驱虫药物、进行适当的接种。
还需要根据具体实验要求决定预免疫、免疫计划以及免疫方案的制定。
三、免疫过程免疫过程是制备多克隆抗体的核心环节。
首先需将抗原与适当的佐剂混合，增强免疫原性，然后用于免疫小动物。
在免疫过程中需要控制免疫剂量和免疫间隔时间，以及监测动物的免疫应答情况。
免疫后还需要定期采集血清样本，监测抗体滴度的动态变化。
四、细胞融合与筛选经过一段时间的免疫后，需要从免疫动物的脾脏或骨髓中收集免疫细胞，然后与肿瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
随后采用限稀稀释法将杂交瘤细胞进行单克隆化分，筛选出高亲和力的多克隆抗体细胞株。
五、生产与纯化经过筛选的多克隆抗体细胞株需要进行扩大培养，生产足够数量的多克隆抗体。
之后通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等手段，从细胞培养上清液中纯化出多克隆抗体。
六、性质鉴定与应用纯化后的多克隆抗体需进行性质鉴定，包括亲和力、特异性、稳定性等方面的测试。
最后经过滤菌毒处理后，多克隆抗体可应用于科学研究、临床诊断、生物药物研发等领域。
多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，需要科学合理地选择抗原、合理设计免疫方案、熟练掌握细胞融合和筛选技术，以及对多克隆抗体进行严格的生产和性质鉴定。
多克隆抗体制备的基本过程
多克隆抗体制备的基本过程
多克隆抗体制备的基本过程包括以下步骤：
1. 免疫原的选择：选择合适的免疫原，可以是蛋白质、多肽、细胞表面抗原等。
2. 免疫动物的选择：选择适合的免疫动物，常见的包括小鼠、兔子等。
3. 免疫动物的免疫：将免疫原注射到免疫动物体内，刺激其免疫系统产生特异性抗体。
4. 收集免疫动物的血清：在免疫动物免疫一段时间后，收集其血清，其中含有特异性抗体。
5. 分离特异性抗体：通过多种方法如沉淀、层析等技术，将特异性抗体从血清中分离出来。
6. 筛选特异性抗体：对分离出的抗体进行筛选，通常采用ELISA、免疫组化等方法，筛选出特异性较好的抗体。
7. 克隆特异性抗体：将特异性较好的抗体细胞与骨髓瘤细胞（如SP2/0）融合，形成杂交瘤细胞。
8. 杂交瘤细胞的筛选：通过培养基中添加抗代谢毒物质如氨甲酰青霉素（HAT），筛选出只含杂交瘤细胞的细胞。
9. 单克隆抗体的扩增：将筛选出的单克隆细胞进行培养和扩增，得到大量的单克隆抗体。
10. 纯化和鉴定：对单克隆抗体进行纯化和鉴定，确保其纯度和特异性。
11. 应用：获得的多克隆抗体可以应用于免疫组化、免疫沉淀、免疫印迹、免疫荧光等实验和应用中。
需要注意的是，多克隆抗体制备的过程可能因具体实验目的、免疫动物的选择等因素而有所差异。
以上是一般的基本步骤，具体实验过程中还需根据实际情况进行调整和优化。
多克隆抗体单克隆抗体的制备流程
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17多克隆抗体制备——动物免疫
多克隆抗体制备多抗制备通常用抗原免疫动物，激发动物机体免疫系统产生抗体，最后通过获取动物高免血清获得抗体；获得的高免血清大部分可以直接使用，用于普通免疫学实验，有些则需要机一部纯化修饰才可以使用。
一、动物免疫动物的免疫是制备抗体最为重要的环节之一，物种选择上最好选择与抗原物种远亲缘动物为宜。
下表列出常规抗原在不同动物上的使用剂量和免疫程序。
程序和剂量：以蛋白类抗原为例（一般免疫间隔为3周，如果比较急，也可间隔2周免疫一次）天数佐剂类型免疫程序剂量（质量/体积）兔子小鼠大鼠豚鼠山羊鸡0 完全佐剂预取血（血清背景检测）首次免疫100μg/500μl40μg/50μl100～500μg/200μl100～500μg/200μl1000μg/1000μl300～500μg/300μl20 不完全佐剂第一次加强免疫100μg/500μl40μg/50μl100～500μg/200μl100～500μg/200μl1000μg/1000μl300～500μg/300μl40 不完全佐剂第二次加强免疫100μg/500μl40μg/50μl100～500μg/200μl100～500μg/200μl1000μg/1000μl300～500μg/300μl60 不加佐剂第三次加强免疫(静脉)100μg/500μl40μg/50μl100～500μg100～500μg/200μl1000μg/1000μl300～500μg/300μl70 终放血1.动物的准备及背景测试选取健康符合实验动物标准的动物，免疫前需要静养一周，免疫前采血进行背景测试。
1.2 兔耳静脉取血方法耳静脉取2ml血，如果耳静脉不明朗，可擦拭二甲苯，一般来说取1ml以上是足够做背景测试用的。
1.2.1 将兔子固定在固定盒内，轻轻抚摸背部使其安静下来；1.2.2 用75%酒精棉擦拭兔耳朵，使其耳静脉可见，必要时可用刮刀刮净兔耳上的毛，如果血管依然不明显可用二甲苯擦拭，使其血管膨胀。
多克隆抗体制备免疫小鼠 (2)
多克隆抗体制备免疫小鼠简介多克隆抗体制备是一种常用的实验技术，用于获得特定蛋白质及其表位的抗体。
免疫小鼠是多克隆抗体制备的常见动物模型之一。
本文将介绍多克隆抗体制备免疫小鼠的一般流程和关键步骤。
流程多克隆抗体制备免疫小鼠的流程主要包括以下几个步骤：1.抗原制备：准备目标蛋白质作为免疫小鼠的抗原，可以是纯化的蛋白质、重组蛋白质或合成的多肽。
2.免疫小鼠：将抗原与适当的佐剂混合，注射到小鼠体内，观察免疫反应情况。
3.收集抗体：采集小鼠的血液样本，离心分离血清，获得抗体。
4.抗体筛选：使用各种筛选方法（如酶联免疫吸附试验、免疫组织化学染色等）筛选出特异性较好的抗体。
5.抗体纯化：通过亲和层析、离子交换层析等技术，对抗体进行纯化，得到高纯度的抗体。
关键步骤抗原制备抗原制备是多克隆抗体制备的关键步骤之一。
抗原质量的好坏直接影响免疫小鼠及最终制备的抗体的质量。
以下是一些常见的抗原制备方法：•纯化蛋白质：通过基于亲和层析、离子交换层析等技术，从含有目标蛋白质的来源中纯化目标蛋白质。
•重组蛋白质：利用基因工程技术在大肠杆菌或其他表达系统中表达目标蛋白质，然后通过亲和层析或其他纯化方法纯化目标蛋白质。
•合成多肽：合成目标蛋白质的特定片段或多肽，用于免疫小鼠。
适当的佐剂适当的佐剂对于免疫小鼠产生良好的免疫响应非常重要。
佐剂的作用是增强抗原的免疫原性和稳定性，促进免疫细胞的活化。
常用的佐剂包括完全佐剂（如完全弗氏佐剂）和不完全佐剂（如不完全弗氏佐剂）。
免疫小鼠免疫将抗原与适当的佐剂混合后，通过皮下注射、腹腔注射等方式将抗原注射到小鼠体内。
注射后，可以观察小鼠的免疫反应情况，如产生抗原特异性抗体。
血液采集和抗体收集一段时间后，如一般在免疫小鼠体内产生可检测到的抗体，可以采用静脉采血的方式采集小鼠的血液。
血液离心后，就可以获得含有抗体的血清。
抗体筛选和纯化获得含有抗体的血清后，可以使用各种筛选方法对抗体进行筛选，如酶联免疫吸附试验（ELISA），免疫组织化学染色等。
多克隆抗体的制备过程及原理
多克隆抗体的制备过程及原理
多克隆抗体是一种由多个不同的B细胞克隆所产生的抗体，能够识别并结合多个抗原表位。
其制备过程主要包括以下几个步骤：
1. 免疫原的选择：选择目标抗原，可以是蛋白质、多肽、细胞表面蛋白等。
2. 免疫动物的选择：根据抗原的物种来源，选择合适的免疫动物，如小鼠、兔子、山羊等。
3. 免疫动物的免疫：将免疫原注射到免疫动物体内，激发免疫反应。
通常采用多次免疫，间隔一定时间进行。
4. 细胞融合：从免疫动物体内提取免疫细胞，通常采用脾细胞或骨髓细胞。
与骨髓或脾细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
5. 杂交瘤细胞筛选：采用筛选培养基，筛选出杂交瘤细胞，一般是通过对杂交瘤细胞进行限稀稀释培养，进行单克隆细胞的筛选。
6. 克隆抗体的生产：将单克隆细胞进行扩增，并进行细胞培养，使其产生大量的抗体。
多克隆抗体制备的原理是利用免疫动物的免疫系统产生多个克隆的抗体。
当免疫
原进入免疫动物体内时，会激发免疫细胞产生对应的免疫反应，形成多个不同的克隆细胞。
这些克隆细胞会产生具有不同的抗体结构的抗体分子。
通过细胞融合和杂交瘤筛选的步骤，可以筛选出产生目标抗原特异性抗体的单克隆细胞，并进行大规模生产。
这样就获得了能够结合多个抗原表位的多克隆抗体。
抗体的制备
抗体的制备为了研究抗体的理化性质、分子结构与功能，以及应用抗体于临床疾病的诊断、治疗及预防都需要人工制备抗体。
目前，根据制备的原理和方法可分为多克隆抗体、单克隆抗体及基因工程抗体三类。
一、多克隆抗体大多数抗原是由大分子蛋白质组成，但只是抗原上有限部位的特殊分子结构能与其相应抗体结合，称此部位为抗原决定簇（antigenic determinant）或表位(epitope)。
一种天然抗原性物质（如细菌或其分泌的外毒素以及各种组织成分等）往往具有多种不同的抗原决定簇，而每一决定簇都可刺激机体一种抗体形成细胞产生一种特异性抗体。
在机体淋巴组织内可存在千百种抗体形成细胞（即B细胞），每种抗体形成细胞只识别其相应的抗原决定簇，当受抗原刺激后可增殖分化为一种细胞群，这种由单一细胞增殖形成的细胞群体可称之为细胞克隆（clone）。
同一克隆的细胞可合成和分泌在理化性质、分子结构、遗传标记以及生物学特性等方面都是完全相同的均一性抗体，亦可称之为单克隆抗体。
在早期传统的抗体制备方法是将一种天然抗原经各种途径免疫动物，由于抗原性物质具有多种抗原决定簇，故可刺激产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇抗体分泌到血清或体液中，故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物，称这种用体内免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体，也是第一代抗体。
由于这种抗体是不均一的，无论是对抗体分子结构与功能的研究或是临床应用都受到很大限制，因此如何能获得均一性抗体成为关注的问题。
二、单克隆抗体体内免疫法很难获得单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）。
如能将所需要的抗体形成细胞选出并能在体外进行培养即可获得已知特异的单克隆抗体。
1975年德国学者Kohler 和英国学者Milstein将小鼠骨髓瘤细胞和经绵羊红细胞（sheep rue blood cell），SRBC）免疫的小鼠脾细胞在体外进行两种细胞融合，结果发现部分形成的杂交细胞既能继续在体外培养条件下生长繁殖又能分泌抗SRBC抗体，称这种杂交细胞系为杂交瘤（hybridoma）。
多克隆抗体
传统的抗体制备方法是将一种天然抗原经不同途径免疫动物，由于抗原性物质具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇的抗体，故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物，所以称这种免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体（polyclonal antibody ，PcAb）。
多克隆抗体的亲和力较一般单克隆抗体高。
多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为制备高效价和高特异性的多克隆抗体，必须要有理想的免疫原、适宜的动物及切实可行的免疫方法。
本章主要介绍多克隆抗体的制备及相关技术。
第一节动物选择实验动物是生物医学中的重要组成部分。
目前常用于生物医学科学研究的实验动物种类很多，主要包括有两栖纲的青蛙、蟾蜍，鸟纲的鸡、鸭、鸽等，哺乳纲啮齿目的小鼠、大鼠、豚鼠等，兔形目的家兔，食肉目的猫、狗，有蹄目的羊、猪和灵长目的恒河猴、猩猩、绒猴等。
其中最常用和用量最大的是哺乳纲啮齿目动物，其次是兔形目和食肉目等。
一、实验动物的生物学特性实验动物选择得当与否是实验研究成败关键之一。
掌握实验动物的生物学特性，则能以最佳的设计选择实验动物，进行科学实验，从而获得预期的实验结果。
1. 小鼠小鼠是啮齿目中体型较小的动物。
新生小鼠 1.5g 左右，21 天断乳时12～15g，至 2 月龄体重达20g 以上，可供实验使用。
成年雌小鼠体重18~35g，成年雄鼠体重20~40g。
小鼠性情温顺，易于捕捉，对外来刺激敏感，喜群居于阴暗环境。
2 ．兔草食性动物，性情温顺，胆小易惊，喜居安静、清洁、干燥、凉爽、空气新鲜的环境，耐冷不耐热，耐于不耐湿。
兔耳大，表面分布有清晰的血管。
有特殊的血清型和唾液型，血清型分为α ' 、β ' 、α'β'和O型四种。
α ' 、α' β'型易产生人A型抗体，β ' 、O型易产生人B型抗体。
唾液型分两种：排出型与非排出型。
排出型易获得人血细胞 A 型物质，非排出型不易获得，这种A型物质与A型抗体产生能力有关。
单克隆及多克隆抗体制备
单克隆抗体制备
七、抗体纯化
• 硫酸铵沉淀法：简易价廉、浓度高，但纯度不高 • 辛酸沉淀法：纯化IgG类抗体，价廉，但纯度不高 • DEAE柱层析法：起始抗体PH只高于抗体等电点，抗体与 DEAE结合，用离子强度逐渐增强的缓冲液洗脱。 • 蛋白A、蛋白G柱纯化抗体免疫亲和层析：从多克隆血清 中纯化特异性抗体方法
• 免疫亲和层析法：
（1）用抗原免疫亲和柱纯化：对多克隆血清，纯化特异性
抗体唯一方法 （2）用抗Ig免疫亲和柱纯化抗体：分离大鼠单克隆抗体
八、抗体的保存
• 血清、组织或培养上清、腹水保存：0.02%NaN3;分装保 存
• 纯化抗体保存：PH值调整，PBS或其他等渗溶液，浓度 不宜过低，如果不用于标记可在低浓度抗体中加1%BSA 以提高蛋白浓度，加NaN3;分装冻存。
抗体制备
多克隆抗体制备 一、免疫动物
• 动物选择：种类多。哺乳类或禽类。选择适龄、健壮的动
物
• 原则：需要血清量、抗原从何种种属动物分离获得，需要 单抗时，有多少抗原可使用。 • 常用种类：兔、小鼠、大鼠、豚鼠、中国仓鼠 • 商品用动物：猪、马、牛、羊 • 多抗制备常用兔（得到500ml血清！）
动物选择
• 小鼠：首次50-100ug/次；大鼠：100ug-1mg/次，兔0.51mg/次 • 加强免疫的剂量为首次剂量的1/5-2/5 • 高度特异性抗血清：策略为低剂量抗原短程免疫法 • 高效价的抗血清：策略为大剂量抗原长程免疫法。
三、佐剂的应用
• 颗粒性抗原或全细胞抗原不需要佐剂 • 可溶性抗原须用佐剂，以增强抗原的免疫原性或改变免疫 反应的类型，刺激机体产生较强的免疫应答 • 佐剂种类：弗氏（Freund’s）佐剂、脂质体佐剂、氢氧化 铝佐剂，SAF-1和RAS • IFA：羊毛脂1份，石蜡油5份，每毫升IFA中加入1-20mg 卡介苗即为CFA。
多克隆抗体的制备,纯化及检测
实验九 多克隆抗体的制备，纯化及免疫电泳【实验目的】⒈ 加深对抗体基本知识的了解。
⒉ 了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。
⒊ 了解免疫电泳的基本过程和实验依据。
一、多克隆抗体的制备【实验原理】当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。
多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。
将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。
如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。
通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。
首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。
但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。
免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。
三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。
通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。
【实验材料】⒈ 实验动物初次抗原注射后的周次0 1 2 3 4 5 6 7初次免疫 二次免疫血清中抗体的水平成年兔。
⒉实验器材特制兔盒；刀片；25G针头；1ml注射器；20 ml 血液收集管；药铲；离心机以及塑料离心管；加样器及加样管；烧杯。
⒊实验试剂⑴抗原；乙醇；20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。
⑵福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂：【实验方法】⒈抗原的制备抗原制备的主要目的在于在免疫动物体内产生最强、最适当的抗体。
由于纯化的抗原适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、亚细胞分离等进行抗原的分离和纯化。
多克隆抗体名词解释
多克隆抗体名词解释多克隆抗体是指由多个B细胞克隆所产生的抗体，能够针对同一种抗原的多个不同的位点进行识别和结合。
与单克隆抗体相比，多克隆抗体具有更高的亲和力和更广泛的抗原识别能力。
多克隆抗体因其独特的特性被广泛应用于生物医学研究、临床诊断和生物工程等领域。
多克隆抗体的制备过程通常包括以下几个步骤：首先，通过免疫动物（如小鼠、兔子等）免疫目标抗原，以激发其免疫系统产生抗体。
接着，从免疫动物体内采集血清，其中包含了众多的B细胞克隆所产生的不同抗体。
再经过一系列的加工和处理，如离心、加热灭活等，最终得到多克隆抗体产品。
多克隆抗体具有以下几个优点：首先，多克隆抗体能够识别和结合抗原的不同位点，从而提高抗原的检测敏感性和特异性。
其次，多克隆抗体可用于大规模和复杂多样的抗原检测，覆盖范围广，适用性强。
此外，多克隆抗体的制备工艺相对简单，成本较低。
然而，多克隆抗体也存在一些局限性。
首先，多克隆抗体的制备过程中可能会产生一些非特异性的抗体，从而降低了其特异性和纯度。
其次，多克隆抗体在不同免疫动物体内可能会产生批次差异，导致其品质和稳定性存在一定的波动。
此外，多克隆抗体由于来源于免疫动物，可能存在个体差异和免疫相容性问题。
为了克服多克隆抗体的局限性，科学家们也不断努力进行研究和改进。
例如，通过筛选和优化制备过程，可以提高多克隆抗体的特异性和纯度。
此外，还可以利用单克隆抗体技术将多克隆抗体中特异性较高的成分筛选出来，以获得更具特异性和统一性的抗体产品。
综上所述，多克隆抗体是一种能够针对同一种抗原的多个不同位点进行识别和结合的抗体。
多克隆抗体具有广泛的应用价值，但也存在一些局限性。
通过不断的研究和改进，科学家们正在努力提高多克隆抗体的质量和稳定性。
多克隆抗体的制备ppt课件
引起或增强迟发性超敏反应。
多克隆抗体的制备
佐剂的作用机制
佐剂的作用机制归纳起来主要有如下几种：
可增强抗原的表面积和改变抗原活性基团构型，从而增强 抗原的免疫原性。
佐剂与抗原混合一起注入机体，可改变抗原的物理性状， 形成抗原储存库，延长抗原在局部组织的滞留时间，有利于 抗原的缓慢释放。
多克隆抗体的制备
细胞性抗原制备： 绵羊红细胞（SRBC）- 溶血素； 细菌- 抗菌抗体（动物免疫血清）。
可溶性抗原制备： 指蛋白质、多糖和脂类等。
多克隆抗体的制备
• 反复冻融法
细胞破碎
• 超声破碎法
• 自溶法
• 酶处理法
• 表面活性剂处理法
多克隆抗体的制备
粗分离
超速离心分离：
是一种根据分离物质的比重特点，通过差速或梯度 密 度离心，将分子大小不同的抗原颗粒分开的方法， 只 适宜少数大分子物质的分离。
多克隆抗体的制备
机理
多克隆抗体的制备
亲和层析的作用
颈动脉分离图
多克隆抗体的制备
ELISA技术路线
多克隆抗体的制备
该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快 速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。
多克隆抗体的制备
特异性鉴定：抗体特异性鉴定常用双向免疫扩散法、免疫电泳法。
纯度鉴定： 抗体纯度的鉴定可采用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、 双向扩散试验、免疫电泳等方法。 IgG含有重链和轻链，纯IgG的SDS-PAGE结果应有两条蛋白电泳 带（分子量约53kD和22kD），若出现多条电泳带则表明制备的抗 体混有杂蛋白，需进一步纯化。
2、多克隆抗体（polyclonal antibody, pAb）：用一种包含多 种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克 隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清 实际上是含有多种抗体的混合物，即多克隆抗体。
SOP——多克隆抗体的制备
多克隆抗体的制备1.蛋白纯化：重组蛋白表达形式为包涵体时，可通过切胶进行蛋白纯化。
表达重组蛋白的细菌（200ml菌液为例）4500r/min离心20min，菌体沉淀用15ml PBS 悬起，4500r/min离心15min，共清洗3次。
沉淀用4ml PBS悬起，通过超声处理进行裂解。
超声条件为超声时间3s，间隔3s，全程时间为30min，4℃（置于冰水混合物中），功率为400W。
超声后10000r/min离心5min，沉淀用500µl PBS悬起，后加入400µl 2×SDS凝胶加样缓冲液、100µl DTT混合，立即加入沸水中煮10min。
将500µl 处理后样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（每块凝胶加入500µl 样品）。
凝胶用H2O、PBS清洗后，将凝胶放入预冷的0.25M KCl中显色（或低温显色）30s左右，可见不同位置出现白色的蛋白条带。
将目的蛋白位置的凝胶条切下（尽量避免同时切下其他蛋白条带），PBS（预冷）清洗后，将胶条碾碎放入EP管中（大约占1/2），加入PBS 浸没胶粒（PBS加入量控制在可使胶粒完全溶于其中，上下颠倒可缓慢流动）。
反复冻融3次，10000r/min离心3min，吸取的上清即为纯化后蛋白（可多次离心后小心吸取上清，避免吸到胶粒）。
取纯化后蛋白进行SDS-PAGE电泳，鉴定蛋白的纯化度并测定其浓度。
纯化蛋白置于4℃短暂保存。
2.蛋白复性将纯化蛋白置于已处理的透析袋中（透析袋于2% NaHCO3中煮沸10min，H2O冲洗后于1mM EDTA中煮沸10min，可于4℃1mM EDTA保存），放入复性液（配方：20mM Tris-HCl pH 8.0；0.1mM氧化型谷胱甘肽；0.9mM还原型谷胱甘肽）中，4℃作用1h。
更换复性液，4℃作用2h。
再放入TE缓冲液（配方：10mM Tris-HCl；1mM EDTA pH8.0）中，4℃作用2h或过夜。
多克隆抗体
多克隆抗体传统的抗体制备方法是将一种天然抗原经不同途径免疫动物，由于抗原性物质具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇的抗体，故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物，所以称这种免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体（polyclonal antibody ，PcAb）。
多克隆抗体的亲和力较一般单克隆抗体高。
多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为制备高效价和高特异性的多克隆抗体，必须要有理想的免疫原、适宜的动物及切实可行的免疫方法。
本章主要介绍多克隆抗体的制备及相关技术。
第一节动物选择实验动物是生物医学中的重要组成部分。
目前常用于生物医学科学研究的实验动物种类很多，主要包括有两栖纲的青蛙、蟾蜍，鸟纲的鸡、鸭、鸽等，哺乳纲啮齿目的小鼠、大鼠、豚鼠等，兔形目的家兔，食肉目的猫、狗，有蹄目的羊、猪和灵长目的恒河猴、猩猩、绒猴等。
其中最常用和用量最大的是哺乳纲啮齿目动物，其次是兔形目和食肉目等。
一、实验动物的生物学特性实验动物选择得当与否是实验研究成败关键之一。
掌握实验动物的生物学特性，则能以最佳的设计选择实验动物，进行科学实验，从而获得预期的实验结果。
1. 小鼠小鼠是啮齿目中体型较小的动物。
新生小鼠 1.5g 左右，21 天断乳时12～15g，至 2 月龄体重达20g 以上，可供实验使用。
成年雌小鼠体重18~35g，成年雄鼠体重20~40g。
小鼠性情温顺，易于捕捉，对外来刺激敏感，喜群居于阴暗环境。
2 ．兔草食性动物，性情温顺，胆小易惊，喜居安静、清洁、干燥、凉爽、空气新鲜的环境，耐冷不耐热，耐于不耐湿。
兔耳大，表面分布有清晰的血管。
有特殊的血清型和唾液型，血清型分为α ' 、β ' 、α'β'和O型四种。
α ' 、α' β'型易产生人A型抗体，β ' 、O型易产生人B型抗体。
唾液型分两种：排出型与非排出型。
多克隆抗体的制备技术
多克隆抗体的制备技术
多克隆抗体的制备技术是一种利用多个B细胞克隆的方法，用于生产特定抗原的抗体。
具体步骤如下：
1. 抗原制备：首先，需要制备抗原。
抗原可以是蛋白质、病原体、多肽或其他分子，可以通过基因工程技术在大肠杆菌等表达系统中表达、纯化或合成。
2. 免疫小动物：将制备好的抗原注射到小动物体内（如小鼠、兔子或大鼠）作为免疫原。
这样做可以激发动物的免疫系统产生抗原特异性的抗体。
3. 收集抗体：收集免疫小动物产生的抗原特异性抗体。
一般情况下，可以通过静脉采血或收集腹水来获得抗体。
4. 抗体纯化：对采集到的抗体进行纯化，可以使用亲和层析或离子交换层析等技术进行精确的纯化。
5. 克隆：将纯化的抗体进行多次稀释，然后分别稀释至单个细胞级别。
接下来，将单个细胞分别种植在含有培养液的孔中，使其形成克隆。
6. 验证：对每个克隆进行酶联免疫吸附测定（ELISA）或其他检测方法验证抗体的特异性和亲和力。
7. 扩大培养：对验证合格的克隆进行扩大培养，使其产生大量的抗体。
通过以上步骤，可以制备出多个来自不同克隆的抗体，这些抗体可以与同一抗原结合，用于生物学研究、诊断和治疗等领域。
多克隆抗体实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习多克隆抗体的制备方法；2. 掌握多克隆抗体的纯化、鉴定及效价检测技术；3. 熟悉多克隆抗体的应用。
二、实验原理多克隆抗体是由多个B细胞克隆产生的抗体，具有特异性强、亲和力高、产量高等特点。
多克隆抗体制备过程主要包括抗原免疫、抗体提取、纯化、鉴定及效价检测等步骤。
三、实验材料1. 实验动物：小鼠（6周龄）；2. 抗原：目的蛋白；3. 试剂：免疫球蛋白G（IgG）亲和层析柱、蛋白纯化试剂盒、SDS-PAGE凝胶、Western Blot试剂盒、酶标仪、凝胶成像系统等；4. 仪器：离心机、PCR仪、电泳仪、Western Blot仪、酶标仪等。
四、实验方法1. 抗原免疫（1）取抗原溶液，加入等体积的福氏完全佐剂，混匀；（2）将混合液注射入小鼠腹腔，免疫剂量根据抗原量和小鼠体重确定；（3）免疫后第2周，重复注射抗原和福氏不完全佐剂，加强免疫；（4）免疫后第3周，采集小鼠血清，进行抗体效价检测。
2. 抗体提取（1）将小鼠血清与蛋白提取缓冲液（pH 7.4）按1:4比例混合；（2）4℃条件下，以15000 rpm离心30分钟，收集上清液；（3）上清液经0.22μm滤膜过滤，得到抗体溶液。
3. 抗体纯化（1）将抗体溶液加入IgG亲和层析柱；（2）用蛋白纯化试剂盒进行梯度洗脱，收集抗体峰；（3）将抗体峰浓缩至适当体积，得到纯化抗体。
4. 抗体鉴定（1）SDS-PAGE电泳：将纯化抗体样品与标准蛋白进行SDS-PAGE电泳，比较分子量；（2）Western Blot：将纯化抗体样品与目的蛋白进行Western Blot检测，观察抗体特异性。
5. 抗体效价检测（1）将抗原溶液与纯化抗体溶液按一定比例混合；（2）加入底物溶液，酶标仪检测吸光度值；（3）根据吸光度值，计算抗体效价。
五、实验结果1. 抗原免疫：小鼠在免疫后第3周，血清抗体效价达到最高值。
2. 抗体提取：纯化抗体溶液经SDS-PAGE电泳，分子量与目的蛋白一致。
多克隆抗体制备免疫小鼠
多克隆抗体制备免疫小鼠多克隆抗体制备免疫小鼠是一种常用的制备多克隆抗体的方法。
下面是具体的步骤：1. 选择抗原：首先需要确定所需要制备抗体的抗原。
抗原可以是蛋白质、多肽、多糖等。
2. 免疫小鼠：将所选抗原注射到小鼠体内，以诱导其产生特异性抗体。
通常，抗原会和佐剂（如完全弗氏佐剂）混合，以增强免疫响应。
3. 免疫程序：将抗原注射到小鼠体内，通常分为初次免疫和加强免疫两个阶段。
初次免疫后，会进行一定的间隔时间（通常是2-4周）再次注射抗原，以增强免疫效果。
4. 细胞融合：在小鼠免疫后，从其脾脏中采集免疫细胞（通常是脾细胞），与骨髓瘤细胞（如SP2/0或NS1等）进行细胞融合。
5. 筛选和培养：将融合细胞进行稀释后，接种到培养基中，以培养成杂交瘤细胞。
培养基中通常会添加相应的选择剂，以选择出杂交瘤细胞。
6. 克隆筛选：将培养出的杂交瘤细胞进行单克隆化，即分离成单个克隆细胞。
这可以通过稀释法或细胞限 dilution法来进行。
7. 抗体鉴定：对筛选出的单克隆细胞进行抗体鉴定，通常采用酶联免疫吸附试验（ELISA）或免疫组化技术来检测抗体的特异性和亲和力。
8. 抗体生产：经过抗体鉴定后，将选出的单克隆细胞培养扩大，并进行大规模的培养和抗体生产。
多克隆抗体制备免疫小鼠的主要优点是可以获得多种不同的抗体，具有较高的灵敏性和多样性。
然而，由于免疫小鼠需要一定的时间来产生抗体，需要一定的动物资源和成本支出，而且制备的抗体可能存在一定的批次变异。
因此，每个实验室需要根据自己的需求和实际情况来选择适合自己的抗体制备方法。
多克隆抗体的制备方法1
抗体的制备方法与原理一、抗血清的制备有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。
（一）用于免疫的动物作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。
动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。
若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。
（二）免疫途径免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。
途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。
（三）佐剂由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。
佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg卡介苗就成为完全佐剂。
配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。
免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。
多克隆抗体的名词解释
多克隆抗体的名词解释多克隆抗体（Polyclonal Antibodies）指的是由多个免疫细胞分泌的抗体所组成的混合群集。
它们的产生源于免疫系统对外来抗原的免疫应答过程。
多克隆抗体的形成包括多个B细胞克隆繁殖和分化，每个克隆细胞产生的抗体略有不同，因此呈现多样性。
多克隆抗体的制备可通过动物免疫或体外方法获得。
动物免疫法是最常用的制备多克隆抗体的方法之一。
在此方法中，动物（如小鼠、兔子等）被注射具有抗原性的物质，刺激免疫系统产生抗体。
随着时间的推移，免疫系统会生成多个B细胞克隆，每个克隆都会产生特定的抗体。
继而，从动物体内采集血清以获得多克隆抗体。
体外方法也能制备多克隆抗体，它通过将抗原添加到体外培养的免疫细胞中，例如淋巴细胞或骨髓细胞。
这些免疫细胞与抗原接触后，会分泌出一系列具有不同特异性的抗体。
多克隆抗体在科学研究和诊断应用中具有广泛的用途。
首先，多克隆抗体能够同时识别多个抗原表位，因为通过免疫原处理产生的抗体是由多个克隆细胞所分泌，因此对目标抗原具有多个抗体的覆盖，增加了检测的灵敏性和特异性。
此外，多克隆抗体还具有在不同实验条件下鲁棒的可重复性，使其成为许多实验室中常用的工具。
在疾病诊断中，多克隆抗体也发挥着重要的作用。
通过制备针对特定疾病标记物的多克隆抗体，可以进行准确、敏感的疾病检测。
例如，在癌症早期筛查中，通过使用针对特定癌细胞标志物的多克隆抗体，可以帮助识别早期癌症病例。
多克隆抗体还广泛应用于生物医药研究中，在药物研发、蛋白质识别和定量分析等领域发挥着重要角色。
然而，多克隆抗体也存在一些局限性。
由于多克隆抗体是由免疫细胞分泌的抗体混合物，其中可能存在非特异性抗体，这些抗体无法区分目标抗原。
此外，多克隆抗体的制备涉及动物实验，存在动物福利和伦理问题，因此在科研界推动开发替代方法以避免或减少动物免疫的使用。
总的来说，多克隆抗体是一类由多个克隆B细胞分泌的抗体所组成的抗体混合物。
多克隆抗体广泛应用于科学研究和诊断应用中，具有多样性和灵敏性优势，为疾病检测和药物研发提供了有力的工具。
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多克隆抗体制备
多抗一般制备流程：完全抗原的准备→兔子的免疫→效价检测和终放→抗体亲和纯化→抗体的浓缩和保存。
【晶莱生物】
具体实验步骤如下：
1.兔子的准备
挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只（约2Kg），使其适应新的生活环境，至少稳定几天再进行首次取血.
预采血（作阴性参照用）
1.1 将兔子小心的放入固定的架中,使兔子平静；
1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见(也可不剃)；
1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位,使血管膨胀；
1.4用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(约5ml血清)；
1.5小心抽出针头,适当按压伤口以免流血,然后用酒精棉球消毒伤口；
1.6将收集的血液置于37`C灭活30min,最后置于4`C过夜使其凝结释放血清；
1.7将凝结好的血液在10000r／min离心10min； h.收集上清，即为血清。
2. 兔子的免疫
2.1注射两只兔子的抗原为1ml,抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂.每只兔子初次免疫400ug抗原比较适合,也可适当减少以获得更好的结果，后续免疫每次为100ug即可。
2.2 将1ml的佛氏完全佐剂与准备好的1ml抗原充分混匀,呈乳白色；
2.3 小心从笼中取出兔子，每只兔子免疫4个部位(背部和大腿根部均可),每个部位250ul,针头呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留数秒以防止抗原外流。
2.4 免疫周期为20天,免疫完后7-10天取血(包括中途测试取血和最终放血),总共免疫4-5次。
3.效价检测
3.1 2个参照:阴性参照为预取血血清，均以1抗起始浓度稀释(封闭稀释液);阳性参照为以前阳性血清
3.2 于96孔板中每孔滴加100ul，1ug/ml抗原，于4℃过夜，也可以37℃孵育2小时。
3.3倒掉抗原溶液，每孔加入200ul的封闭液，4℃过夜或者37℃孵育2小时。
3.4倒去封闭液，在吸水纸上拍打尽量吸干残留液体,用洗涤液洗板三次,每次尽量拍干残留液体,若要放置一段时间, 37℃烘干并用封口袋封好于-20℃存放。
3.5取包被好的96孔板，第一孔加入阴性参照液100ul，第二孔加入阳性参照液100ul，第三孔加入1:500的待测抗血清，后续各孔在此基础上倍比稀释，于37℃孵育1 小时。
3.6倒掉液体，用洗涤液洗板三次，拍干。
每孔加入100ul的HRP标记的小鼠抗兔IgG（1：2000稀释），于37℃孵育45分钟。
3.7倒掉液体，用洗涤液洗板三次，拍干。
每孔加入100ul的TMB底物（Sigma 单组份TMB ）37℃孵育5—20分钟(根据颜色深浅来决定显色的时间)。
3.8每孔加入50ul的终止液（2N H2SO4），在酶标仪上读取波长450nm处的吸光值。
抗体效价检测达到100万以上后可以对兔子进行终放血。
抗体的纯化
4.抗体的亲和---亲和柱的制备
4.1称取1mg CNBr-Sepherose 4B的琼脂糖凝胶加入2mmol／L的盐酸中，4`C过夜使其充分溶涨，可获得3ml溶涨胶。
4.2 将凝胶转移入纯化柱中，用约20ml 2mmol／L的盐酸洗介质3次。
4.3 用偶联缓冲液洗介质一次，因为活化基团在偶联缓冲液PH值下易水解，所以此步骤最好在几分钟内完成。
4.4 将溶解在5ml偶联缓冲液中的5-10mg的抗原加入凝胶中
4.5 室温下轻轻混合摇动2-4小时，或4`C过夜，如需测定结合效率此步骤结束后取少量溶液待测。
用20ml的偶联缓冲液洗介质一次。
4.6 加入15m l 1% BSA 溶液室温下孵育2小时或4`C过夜。
4.7用磷酸盐缓冲液洗涤介质3次以上，每次15ml以上h.
4.8抗原固相化完成，可用于纯化。
4.9若不立即使用或者使用后，用20%的乙醇封存。
5.抗血清的纯化和保存
5.1抗血清用PBS等体积稀释，5000-10000r／min离心15分钟，取上清.
5.2用10倍体积的PBS清洗抗原亲和柱以平衡柱子。
5.3将稀释好的抗血清10ml加入平衡好的柱子中。
5.4室温下轻轻混合摇动2-4小时，或4`C过夜
5.5用10倍体积的PBS清洗抗原柱，以洗去结合在柱子上的杂蛋白
5.6用2倍体积的抗体洗脱液洗涤柱子，以得到特异性抗体
5.7用10倍体积PBS平衡柱子
5.8用20%的酒精封存柱子，4`C保存。
在得到洗脱的抗体后，经蔗糖或聚乙二醇浓缩后于PBS中透析除盐，使用紫外可见分光光度计在波长280nm处测定抗体OD值，所得OD值除以1.35即为所测抗体的浓度，添加40-50%甘油置于-20`C可长期保存。
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