猪卵巢颗粒细胞中SIRT1基因表达量对卵泡闭锁的影响

原种场提供，采集新鲜健康的猪卵巢，置于 37 ℃ 生理盐水 （ 添加青霉素和链霉素） 中，2 h 内带回实验室。 1． 1． 2 主要仪器和试剂 动物切片石蜡（ 熔点 60 ～ 62 ℃ ） 购自上海标本模型厂，Trizol 试剂盒为 Invitrogen 公司产品， RNase Inhibitor、dNTP Mixture、Buffer、SYBR Premix Ex TaqTM 为 TaKaRa 公司产品，Sirtl、β － actin 兔源多克隆抗体购自 Santa Cruz 公司。主要仪器设备有： Bio － Rad Iq5 型荧光定量 PCR 仪、SZ － 51 连 续变 倍体 视 显微镜、Leica 倒置荧光显微镜及 BIO － RAD 电泳凝胶成像系统。 1． 2 方法 1． 2． 1 卵泡的分离与分类 选直径为 3 ～ 5 mm 的卵泡，在 体视镜下观察卵泡外形特征，根据卵泡内颗粒细胞的连续性、 卵泡液的清澈程度等将卵泡分为健康、早期闭锁、晚期闭锁 3 组。 1． 2． 2 免疫组织化学方法的检测 采集新鲜母猪卵巢，用 PBS 清洗后放 入 4% 多 聚 甲 醛 中，6 h 后 修 块 1 次，共 固 定 24 h。用 100% 二甲苯脱蜡 3 次，每次处理时间为 6 min； 水 化、抗原热修复，用 3% 甲醇处理 1 h，消除内源性过氧化物 酶； 加抗 SIRT1（ 1 ∶ 150 ） 的抗体，室温过夜； 加二抗，湿盒内 37 ℃ 反应 1 h； 加 1 ∶ 50 ABC 复合物，37 ℃ 作用时间 30 min； 显色 2 ～ 15 min； 流水冲洗 2 min 后用苏木精复染，于显微镜 下观察，根据染色情况终止染色； 切片重新脱水； 用中性树胶 封片； 在显微镜下观察表达情况。棕褐色指示阳性表达，染色 的深浅程度指示蛋白表达的强弱。 1． 2． 3 qRT － PCR 方法的检测 根据 GenBank 已公布的猪 SIRT1 基因序列设计 1 对引物，其上游引物为： 5' － ATTCTTGTGAAAGTGATGAGGATG － 3'，下 游 引 物 为： 5' － ATTGTTCGAGGATCTGTGCC － 3'； 扩增目的片段长度为 130 bp。还 设计 1 对 管 家 基 因 GAPDH 引 物，其 上 游 引 物 为： 5' － TGAAGGTCGGAGTGAACGGAT － 3'，下 游 引 物 为： 5' － TGGGTGGAATCATACTGGAAC － 3'，扩 增 目 的 片 段 长 度 为 148 bp。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合 成。利用 Trizol 法提取不同发育阶段卵泡中的总 RNA，利用 紫外分光光度计检测 RNA 质量和浓度。1% 琼脂糖凝胶电泳 鉴定提取 RNA 的完整性。将 RNA 进行反转录，所得的 cDNA
2． 2 不同闭锁阶段卵泡中 SIRT1 表达量 用荧光定量检测不同闭锁阶段卵泡中 SIRT1 mRNA 水平
的变化，结果见图 2，发现在晚期闭锁卵泡中 SIRT1 mRNA 表 达量高于早期闭锁卵泡和健康卵泡，差异达到极显著水平，早 期闭锁卵泡中 SIRT1 表 达 量 高 于 健 康 卵 泡，差 异 达 到 显 著 水平。
综上所述，本研究从 mRNA 和蛋白水平，分析 SIRT1 基 因在不同闭锁阶段的卵泡中的表达规律性，两者表达趋势一 致，其中晚期闭锁卵泡最高，健康卵泡最低，说明 SIRT1 基因 在猪卵泡闭锁中发挥重要作用。
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江苏农业科学 2013 年第 41 卷第 3 期
范 颖，张继瑜，周绪正，等． 木豆叶提取物对小白鼠的急性毒性试验［J］． 江苏农业科学，2013，41（ 3） ： 170 － 171．
3 讨论 SIRT1 是一种二氢尿嘧啶脱氢酶（ NAD） 依赖的具有去乙
酰化酶活性的多功能转录调节因子，广泛参与调控哺乳动物 脂肪代谢、糖代谢、胰岛素分泌等多条信号代谢通路，调节基 因转录、能量代谢及细胞衰老［6 － 8］。近年来，在小鼠中研究发 现，SIRT1 基因与卵巢功能存在相关性。对雌性小鼠双侧卵 巢切除模型研究发现，在卵巢、心脏、主动脉和骨骼肌等多种 组织中 SIRT1 表达量明显减少，同时发现，SIRT1 敲除雌性小 鼠卵巢颗粒细胞分泌 雌 激 素 水 平 显 著 升 高［9 － 10］。但 SIRT1 基因对猪卵巢功能影响的研究尚未见报道，本研究分析了不 同闭锁程度的卵泡颗粒细胞中 SIRT1 基因的表达规律性。
（ 1． 扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009； 2． 江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏南京 210014）
摘要： SIRT1 是一种二氢尿嘧啶脱氢酶（ NAD） 依赖的具有去乙酰化酶活性的多功能转录调节因子。本研究分析 不同闭锁阶段卵泡颗粒细胞中 SIRT1 基因表达规律性，探讨 SIRT1 基因表达量与卵泡发育的关系。采用免疫组织化 学方法分析 SIRT1 蛋白表达定位，qRT － PCR 方法分析 SIRT1 mRNA 表达量。结果表明，SIRT1 蛋白在晚期闭锁卵泡 中最高，健康卵泡中最低，SIRT1 mRNA 表达规律性与 SIRT1 蛋白表达规律性一致。综合分析，颗粒细胞中 SIRT1 基因 随着卵泡的闭锁表达量逐渐升高，SIRT1 表达与猪卵巢卵泡发育存在一定相关性。
主要分布于东南亚、印度、缅甸以及我国的云南、四川、江苏、 等［7］。因此木豆叶提取物在人类医学及兽类医学的临床应
1 材料与方法
1． 1 材料 1． 1． 1 试验样品 试验猪由江苏省农业科学院六合苏钟猪
收稿日期： 2013 － 01 － 05 基金项目： 江苏省自然科学基金（ 编号： BK2010466 ） ； 国家生猪现代
产业技术体系建设专项（ 编号： CARS － 36 ） ； 江苏省农业种质资源 库项目。 作者简介： 李碧侠（ 1979—） ，女，江苏泗阳人，博士研究生，副研究员， 主 要 从 事 动 物 遗 传 育 种 研 究。 Tel： （ 025 ） 84391941； E － mail： bxli790@ sina． com。 通信作者： 王金玉，教授，博士生导师，主要从事动物遗传育种研究。 Tel： （ 0514） 87979075； E － mail： jywang@ yzu． edu． cn。
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江苏农业科学 2013 年第 41 卷第 3 期
李碧侠，赵 芳，任守文，等． 猪卵巢颗粒细胞中 SIRT1 基因表达量对卵泡闭锁的影响［J］． 江苏农业科学，2013，41（ 3） ： 168 － 170．
猪卵巢颗粒细胞中 SIRT1 基因表达量对卵泡闭锁的影响
李碧侠1，2 ，赵 芳2 ，任守文2 ，王学敏2 ，方晓敏2 ，付言峰2 ，涂 枫2 ，王金玉1
免疫组织化学和 qRT － PCR 方法分析表明，SIRT1 mRNA 和蛋白在健康卵泡、早期闭锁卵泡和晚期闭锁卵泡中均有表 达，随着卵泡闭锁程度的加剧，SIRT1 mRNA 和蛋白表达量明 显增多。晚期闭锁卵泡中 SIRT1 mRNA 和蛋白表达量极显著 高于健康卵泡和早期闭锁卵泡，健康泡中 SIRT1 mRNA 和 蛋白表达量最低，表明 SIRT1 mRNA 和蛋白在卵泡闭锁过程 中的表达具有规律性，但具体调控机制仍需进一步研究。
关键词： 木豆叶提取物； 急性毒性； 小白鼠； 安全性 中图分类号： S859． 8 文献标志码： A 文章编号： 1002 － 1302（ 2013） 03 － 0170 － 02
木豆（ Cajanus cajan L． ） 是豆科木豆属植物，又名柳豆、豆 素［4］。近年来的 研 究 发 现，木 豆 叶 提 取 物 具 有 多 种 药 理 活 蓉、扭豆，为世界第 6 大食用豆类，也是唯一的木本食用豆类。 性，如抗 骨 质 疏 松［5］、治 疗 高 血 脂［6］、抗 脑 缺 血 缺 氧 损 伤
木豆叶提取物对小白鼠的急性毒性试验
范 颖，张继瑜，周绪正，李 冰，李金善
（ 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 / 农业部兽用药物创制重点实验室 / 甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃兰州 730050）
摘要： 为了评价木豆叶提取物的安全性，对其进行小鼠的急性毒性试验。预试验初步确定给药剂量的范围，正式 试验取 60 只小白鼠灌胃给药，给药后连续观察 7d，记录小白鼠的中毒反应及死亡情况，采用改良寇氏法计算 LD50 及 LD50 的 95% 可信限。结果表明，高剂量给药组小白鼠出现中毒反应并死亡，解剖后检查发现，主要原因是消化系统的 病变，测得木豆叶提取物的 LD50 及 LD50 的 95% 可信限分别为 62． 647 g / kg、53． 488 ～ 73． 528 g / kg，表明木豆叶提取物 可以被认为是无毒物质。
李碧侠等： 猪卵巢颗粒细胞中 SIRT1 基因表达量对卵泡闭锁的影响
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置于 － 20 ℃ 保存。 目的基因、管家基因荧光定量 PCR 程序均设置为： 反应
总体积为 25 μL，包括 SYBR Premix Ex TaqTM 12． 5 μL，上、下 游引物（ 10 μmol / L） 各 0． 5 μL，去离子水 10． 5 μL。设无模板 试剂对照。采用 2 步法，反应条件均设置为： 94 ℃ 预变性 10 s； 然后 94 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，重复 35 个循环。 反应结束后由标准曲线判断目的基因扩增效果与管家基因扩 增效果是否一致。 1． 2． 4 统计分析 每处理试验均重复 3 次，用 SPSS 13． 0 软
件分析不同卵巢颗粒细胞中 SIRT1 表达量的变化规律。
2 结果与分析
2． 1 不同闭锁阶段卵泡中 SIRT1 蛋白表达定位 根据卵泡壁颗粒细胞的形态将卵泡分为健康卵泡、早期
闭锁卵泡、晚期闭锁卵泡 3 类。对免疫组化染色切片进行分 析，发现在猪卵巢早期闭锁卵泡颗粒细胞中 SIRT1 蛋白的表 达 丰 度 高 于 健 康 卵 泡 颗 粒 细 胞，晚 期 闭 锁 卵 泡 颗 粒 细 胞 中 SIRT1 蛋白的表达丰度高于早期闭锁卵泡颗粒细胞（ 图 1） 。