实验十三细胞凋亡的检测

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细胞凋亡实验详细步骤及说明

细胞凋亡实验详细步骤及说明
细胞凋亡是细胞在正常发育或应激条件下程序性死亡的过程。

为了深入了解细胞凋亡的机制和影响因素，以下是细胞凋亡实验的详细步骤及说明：
步骤一：培养细胞
1. 准备培养皿并涂覆培养基，确保培养基的成分适合所使用的细胞类型。

2. 从培养细胞的主要来源（如细胞培养库）中获取细胞。

3. 将细胞转移到培养皿中并在适当的温度和湿度下孵育。

步骤二：处理实验组
1. 将培养的细胞分为实验组和对照组。

实验组是要进行细胞凋亡诱导的组，而对照组则用于对比分析。

2. 选择适当的方法诱导细胞凋亡，例如化学诱导剂（如某种药物）或物理刺激（如辐射）。

3. 根据实验需要，在指定的时间间隔内观察细胞凋亡的现象和变化。

步骤三：检测细胞凋亡
1. 使用合适的细胞凋亡检测方法，如细胞染色和流式细胞术。

这些方法可用于分析各种细胞凋亡标志物的表达。

2. 准备相应的染色试剂或抗体，并按照说明溶解或稀释。

3. 按照实验需求，将细胞标本与染色试剂或抗体共孵育，并进行相应的分析和读数。

步骤四：数据分析与结果
1. 对实验和对照组的数据进行统计学分析，如均值和标准差计算。

2. 进一步分析和解释实验结果，评估细胞凋亡发生的程度和影响因素。

3. 根据实验结果撰写实验报告，包括方法、结果和结论，并进行讨论和对比分析。

以上是细胞凋亡实验的详细步骤及说明。

通过进行这些实验，
我们可以更好地理解细胞凋亡的机制以及可能对其产生影响的因素。

请根据具体实验的要求和细胞类型的特点，调整实验步骤和方法，
并确保实验过程中的安全性和可重复性。

《细胞实验》13 流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程

流式检测细胞凋亡Annexin V 检测细胞凋亡 (2)实验原理 (2)实验用品 (2)操作步骤 (3)Annexin V Blocking (5)凋亡细胞的DNA 断裂片段分析 (7)实验原理 (7)实验用品 (8)操作步骤 (9)BrdU Flow Kits 检测细胞增殖 (12)实验原理 (12)BrdU Flow Kits 试剂盒 (12)结果分析 (17)流式仪器设置指南 (18)线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22)实验原理 (22)实验用品 (22)样本制备 (23)结果分析 (24)注意事项 (24)Active Caspase-3 检测细胞凋亡 (26)实验原理 (26)实验步骤 (27)结果分析 (28)Annexin V 检测细胞凋亡实验原理Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。

它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。

在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。

Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。

由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。

因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-)与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。

实验用品1. 一次性12×75mm Falcon试管。

2. PBS缓冲液：含0.1%NaN ，过滤后2-8°C保存。

33. 微量加样器和加样头。

4. Annexin V Binding Buffer缓冲液（Cat. No. 66121E）：浓度为10×，使用时，用稀释为1×浓度的应用液。

细胞凋亡实验详细步骤及说明

细胞凋亡实验详细步骤及说明实验概述本实验旨在研究细胞凋亡的过程和机制。

细胞凋亡是一种正常的细胞死亡方式，对于维持组织的稳态具有重要作用。

通过本实验，我们可以了解细胞凋亡的特征和调控通路，以及一些常用的检测方法。

实验材料- 培养皿- 细胞培养基- 不同处理条件下的细胞（例如药物处理、基因敲除等）- Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒- 显微镜实验步骤1. 培养细胞：将细胞按照常规方法培养至适当的细胞数目。

2. 细胞处理：根据实验设计，在细胞培养基中添加不同处理条件下所需的药物。

3. 收集细胞：根据实验设计决定收集细胞的时间点，使用适当的方法将细胞收集到离心管中。

4. 染色试剂处理：根据实验需求，使用 Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒中的染色试剂进行细胞染色，按照试剂盒说明书的操作步骤进行。

5. 检测细胞凋亡：将染色后的细胞标本放置在显微镜下观察，并使用适当的过滤器和荧光镜头进行观察。

6. 数据分析：根据观察结果，统计和分析不同处理条件下细胞凋亡的数量和特征。

实验注意事项- 操作过程中应严格遵守实验室安全规范，确保个人和实验室安全。

- 细胞培养过程中，注意细胞接种密度和培养基条件的控制，以维持细胞的正常生长状态。

- 在染色试剂处理过程中，按照试剂盒说明书的要求进行操作，避免试剂污染和误操作。

- 在显微镜观察过程中，注意调整适当的放大倍数和聚焦，以获得清晰的细胞图像。

实验结果与讨论根据实验结果可以获得不同处理条件下细胞凋亡数量和特征的数据。

结合相关文献和已有知识，可以对细胞凋亡的机制和调控通路进行深入的讨论。

实验结果可以为进一步研究细胞凋亡的相关领域提供有价值的数据基础。

以上是细胞凋亡实验的详细步骤及说明。

希望对你的研究有所帮助！。

细胞凋亡检测步骤

细胞凋亡检测步骤
细胞凋亡检测步骤一般包括以下几个步骤：
1. 收集细胞样品：收集需要检测凋亡的细胞样品，可以是培养细胞、动物组织或人体组织。

样品应保持新鲜和完整。

2. 处理细胞样品：根据实验需要，对细胞样品进行处理，例如给予某种刺激物或药物，或者采用特殊培养条件。

3. 准备细胞悬液：将处理后的细胞样品转移到离心管中，并加入适量的培养基或缓冲液，制备细胞悬液。

悬液中细胞应保持单细胞状态。

4. 染色：根据实验要求，选择适当的染料对细胞进行染色。

常用的凋亡染色方法包括荧光染色和酶标法。

5. 流式细胞仪检测：将染色后的细胞悬液通过流式细胞仪进行检测。

流式细胞仪可以检测和分析细胞中的荧光强度或酶标信号，进而评估细胞凋亡程度。

6. 数据分析：根据流式细胞仪检测到的数据，进行数据分析，计算细胞凋亡率或凋亡指数等参数。

细胞凋亡检测细胞凋亡实验步骤检测方法

细胞凋亡检测，细胞凋亡实验步骤，检测方法一、定性和定量研究只定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜）进行定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA 定量琼脂糖凝胶电泳。

二、区分凋亡和坏死可将二者区分开的方法：琼脂糖凝胶电泳，形态学观察（透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法），Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测，3) Telemerase Detection (端粒酶检测)3、生化检测：1）典型的生化特征：DNA 片段化2）检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记（TUNEL）等3）TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记）4）通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP （多为dUTP）间接或直接接到DNA 片段的3’-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。

可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。

4、LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测)当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。

通过LM-PCR,连上特异性接头，专一性地扩增梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段。

此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。

如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。

上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征，但细胞受到其它损伤（如机械损伤，紫外线等）也会产生这一现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰。

需结合其它的方法来检测细胞凋亡。

)境，这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低，从而使细胞色素C（三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转移到细胞液中，启动凋亡效应器caspase的级联反应。

细胞凋亡(apoptosis)的检测

细胞凋亡（apoptosis）的检测细胞凋亡（apoptosis）是一种由基因控制的细胞自主性死亡方式。

其发生诱因及形态学特征均有别于坏死，与人类免疫系统的发生发展、神经组织发育、器官的形成、肿瘤的发生发展等诸多生物学现象之间有着密切联系，并且是免疫应答过程中免疫细胞的杀伤机制之一。

细胞凋亡的检测技术已成为免疫学检测的一个重要内容。

凋亡细胞具有典型的形态学、生物化学及分子生物学变化，从这些特点出发发展起来的检测方法有形态学鉴定、电泳法、免疫学方法、流式细胞术、原位末端转移酶标记技术、靶细胞DNA片段的定量等。

(一)放线菌酮制备大鼠淋巴细胞凋亡模型【原理及意义】放线菌酮（CHX）是一种蛋白合成抑制剂，可诱导小鼠和大鼠的脾、粘膜免疫系统及淋巴结的淋巴细胞发生凋亡。

此实验旨在体外研究淋巴细胞凋亡的生物学特征。

【材料】１动物：昆明种小白鼠，大鼠。

２试剂：PBS缓冲的4%多聚甲醛或2.5%的戊二醛，放线菌酮（用PBS或生理盐水配成1mg/mL的浓度，除菌过滤，4℃冰箱保存）。

３器材：眼科镊，眼科剪，剪刀，玻片。

【方法】１大鼠用乙醚麻醉后，从腹腔（静脉或皮下）给大鼠注射3mg/kg体重CHX。

２注射2h后，取大鼠脾脏（肠或子宫亦可）等组织，剪成一定大小的组织块，固定于固定液中。

３固定组织经HE染色作光镜检查或电镜检查。

【结果】一般在注射后不久就可在脾及其它粘膜免疫系统出现大量凋亡的淋巴细胞（以Ｂ淋巴细胞为主）。

经HE染色后在光学显微镜下细胞核呈蓝黑色，胞浆呈淡红色。

凋亡细胞在组织中单个散在分布，表现为核染色质致密浓缩，核碎裂等。

坏死组织则呈均质红染的无结构物质，核染色消失。

【注意事项】由于机体内巨噬细胞对凋亡细胞的清除作用，凋亡细胞形成的高峰期在3h左右，在5h后组织内凋亡细胞已经很少，所以取材最好不要超过4h。

另外，放线菌酮的剂量要控制在2～5mg/kg体重。

制备成功的模型一般比较稳定。

(二)活化诱导的淋巴细胞凋亡检测【原理及意义】活化诱导的淋巴细胞凋亡（AICD）是免疫调节的重要途径之一。

细胞凋亡的检测(来自北京大学人类疾病基因研究中心

摘自北京大学人类疾病基因研究中心/news/apoptosis.htm细胞凋亡的检测北京大学人类疾病基因研究中心陈英玉细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。

细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。

一、细胞凋亡的形态学检测根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。

1 光学显微镜和倒置显微镜（1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。

贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。

（2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。

凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。

2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。

常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。

三种染料与 DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DN A的A-T碱基区。

紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。

Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。

DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。

储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。

结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。

3 透射电子显微镜观察结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。

凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

检测细胞凋亡的实验方法

检测细胞凋亡的实验方法一、形态学观察方法1、HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。

2、丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。

凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。

3、台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。

如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。

此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。

4、透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。

二、DNA凝胶电泳（一）、检测原理细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。

但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。

（二）结果判断正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。

三、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。

核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。

（一）检测步骤1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；2、在微定量板上吸附组蛋白体’3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’4、加酶的底物，测光吸收制。

（二）用途该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。

可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。

该法不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。

细胞凋亡流式检测实验方案

细胞凋亡流式检测实验方案掌握细胞凋亡的检测方法，了解细胞凋亡的发生机制。

二、实验原理细胞凋亡是一种程序性的细胞死亡过程，是正常细胞生长、发育和组织维持的重要机制。

细胞凋亡的发生涉及许多生物化学过程，包括蛋白酶的激活、蛋白磷酸化、核酸降解等。

目前，常用的细胞凋亡检测方法有DNA损伤、凋亡相关蛋白（如Caspase）的活性检测、Annexin V染色体外膜表面的磷脂酰胆碱变化等。

三、实验材料1. 细胞培养基、PBS缓冲液；2. Annexin V-PE/7-AAD染色试剂盒；3. 离心管、试管、离心机等。

四、实验步骤1. 将细胞接种于96孔或24孔板中，待细胞生长到适当密度后，按照不同处理方式分为不同组。

2. 处理细胞，如加入药物、病毒等，切换培养基等。

3. 用PBS缓冲液洗涤一次细胞，加入含Annexin V-PE/7-AAD染色试剂的PBS缓冲液，室温下酒暗处理15分钟。

4. 加入PBS缓冲液洗涤一次细胞，加入PBS缓冲液悬浮细胞，用流式细胞仪检测细胞的荧光强度。

五、实验结果分析1. Annexin V染色阳性、7-AAD染色阴性：表明细胞凋亡早期，细胞膜磷脂酰胆碱翻转，但细胞核仍完整无损。

2. Annexin V染色阳性、7-AAD染色阳性：表明细胞凋亡晚期，细胞膜磷脂酰胆碱翻转，细胞核已经破裂，DNA释放。

3. Annexin V染色阴性、7-AAD染色阴性：表明细胞无凋亡现象。

4. Annexin V染色阴性、7-AAD染色阳性：表明细胞处于坏死状态，细胞膜破裂，7-AAD染料可以进入细胞核结合DNA。

六、注意事项1. 实验过程中要注意无菌操作；2. 实验前要将所有实验材料消毒；3. 实验过程中要加强个人防护，穿戴实验室专用实验服、手套、口罩等；4. 实验结果分析时要注意对比组间差异明显性，结果分析应结合其他指标进行综合分析。

细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of Cell Apoptosis)

细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of CellApoptosis)2010-05-25 20:06:41 来源：易生物实验浏览次数：197 网友评论0 条细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。

细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。

如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。

细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。

关键词：细胞检测单染法细胞凋亡检测Annexin-V-FITCAssayCellApoptosis一、实验原理细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。

细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。

如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。

细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。

在正常的活细胞，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在凋亡的细胞，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。

Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。

因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

二、实验仪器和材料Annexin V-FITC（膜联蛋白-V-FITC）500μl/250μl 20μg/ml标记缓冲液（Binding Buffe）r 40/20 mlPBS（1×）60/30 ml20μl , 200μl , and 1000μl 移液器和吸头微量离心管可调速离心机载玻片（用于荧光显微镜观察）盖玻片（用于荧光显微镜观察）去离子水冰块流式细胞仪或荧光显微镜三、实验方法1．凋亡细胞的制备：小鼠腹腔注射地塞米松25mg/kg体重，10h后解剖取胸腺，分离胸腺细胞。

细胞凋亡的检测方法

细胞凋亡的检测方法
细胞凋亡的检测方法有多种，下面是其中几种常见的方法：
1. DNA片段化检测：细胞凋亡的一个特征是DNA片段化，这可以通过凝胶电泳或荧光标记DNA片段进行检测。

凝胶电泳可以观察到DNA在凋亡时被酶切成特定大小的片段，而荧光标记的DNA片段可以通过流式细胞仪进行定量检测。

2. 细胞膜的改变检测：细胞凋亡时，细胞膜上的磷脂从内层转移到外层，露出磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）。

这可以通过荧光染料如annexin V 与细胞膜上的PS结合来检测。

3. 细胞色素C释放检测：细胞凋亡会引起线粒体内的细胞色素C释放到胞浆中。

可以使用免疫荧光染色技术来检测细胞色素C的定位。

4. DNA染色：细胞凋亡时，细胞核会出现特征性的形态变化，如染色质凝集和核片断。

这可以通过荧光染色剂如荧光素磷酸酯（propidium iodide）和核染色素如Hoechst 33342来观察细胞核的形态变化。

这些方法可以单独应用或结合使用，以便对细胞凋亡进行准确的检测和定量分析。

实验十三、放线菌素D诱导细胞凋亡形态学观察

• 最后凋亡小体被周围的细胞或者单核细胞吞噬。胞吞噬。
凋亡小体
• 生化特征：生化特征：内源性核酸内切酶基因的活化和表达，因的活化和表达，导致凋亡细胞的染色质 DNA的有控裂解，得的有控裂解，的有控裂解到的DNA片段的长度到的片段的长度的倍数。为200bp的倍数。的倍数
• 4.制片（空气干燥法）制片（空气干燥法）制片
取一滴细胞悬液，滴于倾斜放置一滴细胞悬液，细胞悬液的洁净盖玻片上，让细胞均匀分散，的洁净盖玻片上，让细胞均匀分散，自然干燥。
cover slip
5.染色：染色：染色滴加一滴吖啶橙荧光染液于标本上，滴加一滴吖啶橙荧光染液于标本上，铺开染液，置标本于培养皿中，铺开染液，置标本于培养皿中，室温下黑暗环境中染色10min，自来水小心冲洗黑暗环境中染色，自来水小心冲洗, 自然晾干（避光）。自然晾干（避光）。 6.封片及观察：封片及观察：封片及观察在载玻片（在载玻片（slide）上滴一滴）上滴一滴10%的甘的甘油，用镊子小心将贴有细胞的盖玻片盖在液滴上，细胞面向下，不要产生气泡，在液滴上，细胞面向下，不要产生气泡，及时于荧光显微镜下观察于荧光显微镜下观察。及时于荧光显微镜下观察。
2.程序性死亡程序性死亡（programmed 程序性死亡 cell death, PCD）
定义：
又称细胞凋亡（），细胞在又称细胞凋亡（apoptosis），细胞在），一定的生理或者病理条件下按照自身的程序结束其生存，程序结束其生存，是细胞接受指令后进行的主动性死亡，行的主动性死亡，涉及一系列基因的激表达和调控。活、表达和调控。
一、细胞死亡（cell death）细胞死亡（）

细胞凋亡测定_实验报告

一、实验目的本实验旨在通过观察细胞凋亡的形态学特征和检测凋亡相关蛋白表达，了解细胞凋亡的发生机制，为细胞凋亡相关疾病的研究提供理论依据。

二、实验材料1. 细胞：人肝癌细胞株HepG2，人正常肝细胞株LO2。

2. 试剂：Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒，Caspase-3活性检测试剂盒，DNA ladder检测试剂盒，荧光显微镜，流式细胞仪等。

3. 仪器：CO2培养箱，细胞培养瓶，移液器，离心机，荧光显微镜，流式细胞仪等。

三、实验方法1. 细胞培养：将HepG2和LO2细胞分别接种于培养瓶中，置于CO2培养箱中培养，待细胞生长至对数生长期时进行实验。

2. 细胞凋亡检测：（1）Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测：将细胞悬液离心后弃去上清，加入Annexin V-FITC/PI染液，室温避光孵育15分钟，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

（2）Caspase-3活性检测：按照试剂盒说明书操作，检测细胞中Caspase-3活性。

（3）DNA ladder检测：按照试剂盒说明书操作，进行琼脂糖凝胶电泳，观察DNA ladder现象。

3. 数据分析：采用SPSS软件进行统计学分析，比较两组细胞凋亡率、Caspase-3活性和DNA ladder的差异。

四、实验结果1. Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测：HepG2细胞凋亡率为（30.2±2.5）%，LO2细胞凋亡率为（2.1±1.2）%，两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。

2. Caspase-3活性检测：HepG2细胞Caspase-3活性为（2.58±0.21）U/mg，LO2细胞Caspase-3活性为（0.83±0.14）U/mg，两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。

3. DNA ladder检测：HepG2细胞出现明显的DNA ladder现象，LO2细胞无DNA ladder现象。

细胞凋亡的检测

细胞凋亡的检测实验人：生64范泓洋2006030003 同组实验：刘婧娟实验日期：2008年5月8日1. 实验目的1.1 了解细胞凋亡的基本概念及其意义1.2 了解细胞凋亡的诱导及检测方法，学会区分凋亡不同阶段的细胞1.3 学习Hoechst33258染色方法2. 实验原理细胞凋亡(apoptosis)或程序化细胞死亡(programmed cell death,PCD)，是多细胞有机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程，是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，并强调这一过程是一种自然的生理学过程。

由于细胞凋亡受到严格的由遗传机制决定的程序性调控，所以又被称为程序化细胞死亡。

通过细胞凋亡，机体得以消除不再需要的细胞，而不引起炎症反应。

细胞凋亡有确保正常生长、发育，维持内环境稳定，发挥积极的防御功能的作用。

凋亡过程中的细胞在形态学和很多生化指标上与正常细胞和坏死的细胞都有明显区别。

RNA结合，染色DNA时应调整染液的pH至7.0，这种染料不溶于磷酸缓冲液；所以配制时必须先以蒸馏水溶解配成储存液在4℃中避光保存。

3. 实验材料、试剂及器械3.1 材料：Hela细胞3.2 试剂：H2O2溶液，DMEM培养基，PBS溶液，胰酶-EDTA溶液，Hoechst33258染料，甲醇3.3器械：离心机，EP管，pippet，正置荧光显微镜，盖玻片，载玻片，镊子4. 实验步骤4.1 向传代24小时后的Hela细胞系（DMEM培养液1ml，贴壁50%）中加入100μlH2O2溶液，继续培养24小时4.2收集细胞(200uL胰酶37℃消化2min后，再加入1mL 培养基)至1.5mL EP管，1000g离心5min4.3 吸出上清，于沉淀中加入100uL甲醇，室温固定10min4.4 1000g离心5min4.5 弃上清，加100uL PBS洗涤沉淀细胞4.6 1000g离心5min，4.7弃上清，加40uL PBS和10uL Hochest33258染液，于37℃染色10min4.8 1000g，离心5min4.9 弃上清，加100uL PBS洗涤；4.10 1000g，离心5min4.11弃上清，加15uL PBS重悬细胞4.12 取15uL悬液于玻片上并于正置荧光显微镜下观察并选取典型凋亡阶段的细胞拍照5. 实验结果由于Hoechst33258染色法只能将细胞核染色，所以只能由核质的形态变化来推测正在凋亡的细胞处于哪一个凋亡阶段。

发学生-细胞凋亡检测

一、细胞凋亡的检测方法(一) 形态学检测1.普通光学显微镜(1)苏木素-伊红染色(HE染色法)：苏木素(hematoxylin)为碱性染料，可使细胞内嗜碱性的核染色质和核蛋白体染成蓝紫色：伊红(eosin)为酸性染料，可使胞质内嗜酸性的普通蛋白和胶原纤维等物质染成粉红色。

因此在普通光镜下细胞核呈蓝紫色，胞浆呈红色。

凋亡细胞在组织中呈现单个散在分布。

表现为核染色质致密、核碎裂。

而细胞坏死时由于细胞膜通透性增加，细胞膜破裂，因此细胞不完整，溶酶体膜破裂，使周围组织坏死，呈均质红染的无结构物质，核染色消失。

用植物材料(2) 甲基绿-派诺宁染色法：细胞凋亡和坏死均可表现为细胞核固缩等细胞死亡形态，但两者发生机制不同。

细胞凋亡是一种细胞主动死亡过程，需要有细胞内蛋白酶的激活，细胞质内常有mRNA表达的增强。

而坏死则是一种被动的细胞死亡过程，细胞质内常有RNA损失。

根据这一特点，可利用试剂甲基绿对DNA染色的特异性和派诺宁对RNA的亲和性，使甲基绿对固缩细胞核内的脱氧核糖核酸着染(呈绿色)。

如果细胞质内核糖核酸呈派诺宁阳性染色(呈现红紫色)者为凋亡细胞，呈现阴性染色者为坏死细胞。

用植物材料(3) Giemsa染色法：一般用于血液和造血组织来源的细胞或白血病细胞的染色。

正常细胞核染成蓝色或蓝紫色，色泽均一；凋亡细胞可见核固缩、边集或碎裂，染色变深；细胞膜皱折、卷曲和出泡，以及芽生形成膜包裹的凋亡小体。

用鸡血(4) 瑞氏(Wright)染色法：与Giemsa染色法相类似，多数用于血液和造血组织来源的细胞或白血病细胞的染色。

2.电子显微镜透射电镜可确定凋亡时细胞核的特征性变化和凋亡小体，同时可观察细胞外形和细胞器的变化。

由于超微结构的变化几乎存在于凋亡的全过程，故本法既适用于组织细胞(体内)又适用于离体细胞(体外)的研究，是目前用于确定细胞凋亡最为理想的形态学方法。

细胞凋亡实验步骤及注意事项

细胞凋亡实验步骤及注意事项Last revised by LE LE in 2021细胞凋亡实验步骤及注意事项一、实验目的1、掌屋凋亡细胞的形态特征2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法二、实验原理细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。

凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。

它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。

细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。

在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。

在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。

在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。

核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。

如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNAladder（梯状带纹）的特征。

相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。

细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。

一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。

三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。

研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。

第13章细胞凋亡检测

TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)
细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大
量的粘性3’-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶
（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的 3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测
是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单
个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征
Caspase活性的检测
在正常状态下， Caspase家族都以无活性的酶原(30～
50kD)形式表达，当细胞发生凋亡时Caspase可以被蛋白酶
裂解，大亚基和小亚基形成活化的Caspase 。一些Caspase
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，
它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞，
PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-
V与PI匹配使用，可检测早晚期的凋亡细胞。
已开发出多种荧光标记的试剂盒
荧光显微镜结果流式细胞仪分析
DNA 片断化检测
labeling, TUNEL）

半胱氨酸蛋白酶Caspase家族活性的检测
细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后是细胞质密度增加，核质浓缩，核膜核仁破碎，胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞膜结构仍然完整，最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为几个凋亡小体。
形态学观察
光学显微镜和倒置显微镜：体积缩小、核深染、核碎裂、
活化后可以次序激活其他Caspase形成Caspase级联反应，
促发细胞凋亡。在目前已知的14种Caspase中， Caspase-

细胞凋亡途径实验报告

细胞凋亡途径实验报告一、引言细胞凋亡（apoptosis）是一种重要的细胞死亡方式，对于维持组织与器官的正常发育和功能起着关键作用。

在细胞凋亡过程中，多种调控因子和途径参与其中，包括外源性凋亡途径和内源性凋亡途径。

为了深入了解细胞凋亡的机制及其调控方式，本次实验旨在通过应用典型的细胞凋亡途径实验方法，探究细胞凋亡的分子机理。

二、材料与方法1. 细胞系：本实验使用人类肺癌细胞株A549；2. 细胞培养基：DMEM培养基；3. 细胞处理试剂：Apo-BrdU TUNEL试剂盒（用于检测细胞凋亡指标DNA断裂）；4. 荧光显微镜：用于观察荧光标记的细胞；5. 细胞培养器具：含培养皿、离心管、培养瓶等。

三、实验步骤1. 培养细胞：将A549细胞接种于含有DMEM培养基的培养皿中，放置在37摄氏度、5% CO2培养箱内，培养至细胞处理需要的密度；2. 细胞处理：使用指定浓度的药物（如化学药物或生物试剂）处理A549细胞，不同药物处理组设有对照组；3. 细胞凋亡检测：使用Apo-BrdU TUNEL试剂盒，按照生产商指南进行操作，检测细胞内DNA断裂的程度；4. 获得结果：使用荧光显微镜观察处理后的细胞，记录并存储图像；5. 数据分析：根据实验结果，进行统计学分析和绘图。

四、结果与讨论1. 细胞凋亡的观察结果：通过使用Apo-BrdU TUNEL试剂盒，观察到处理组细胞中明显的DNA断裂现象，而对照组则相对较少；2. 细胞凋亡比较分析：对不同处理组的细胞进行统计学分析，得出细胞凋亡率的比较结果；3. 讨论细胞凋亡的调控机制：根据实验结果和已有研究，讨论细胞凋亡途径中的关键分子和信号通路。

五、结论通过本实验的细胞凋亡路径研究，我们得出了以下结论：1. 细胞凋亡途径在A549细胞中能够被有效触发，导致DNA断裂；2. 细胞凋亡途径中的关键分子和信号通路起到调控细胞凋亡的重要作用。

六、进一步研究建议基于本次实验结果，我们提出以下进一步研究的建议：1. 探究细胞凋亡途径与肿瘤发生发展的关系；2. 研究细胞凋亡途径的调控因子在治疗肿瘤等疾病方面的应用潜力。

细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of Cell Apoptosis

细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of Cell Apoptosis)一、实验原理细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。

细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。

如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。

细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。

在正常的活细胞，磷脂酰丝氨酸（ph osphotidylserine， PS）位于细胞膜的内侧，但在凋亡的细胞，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。

Annexin -Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。

因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素（如FITC、P E）或生物素（Biotin）标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

二、实验仪器和材料Annexin V-FITC（膜联蛋白-V-FITC）500μl/250μl 20μg/ml标记缓冲液（Binding Buffe）r 40/20 mlPBS（1×） 60/30 ml20μl , 200μl , and 1000μl 移液器和吸头微量离心管可调速离心机载玻片（用于荧光显微镜观察）盖玻片（用于荧光显微镜观察）去离子水冰块流式细胞仪或荧光显微镜三、实验方法1．凋亡细胞的制备：小鼠腹腔注射地塞米松25mg/kg体重，10h后解剖取胸腺，分离胸腺细胞。

用PBS洗两遍，调整待测细胞的浓度为2 ×106/ml，备用。

2．200μl细胞悬液加入1ml冷PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，1000rpm 4℃离心103．重复步骤2两次。

细胞凋亡检测

细胞凋亡检测目录一、实验原理二、实验设计原则三、实验操作步骤四、实验结果分析一、背景知识（1）细胞凋亡，又称程序性细胞死亡，是细胞在一定的生理或病理条件下，由基因控制的自主的、有序的死亡。

细胞调亡是生物体生长发育过程中出现的正常现象，在生物体形态构成、正常细胞更替以及维持细胞内环境稳定等过程中发挥重要作用，细胞凋亡受阻可以导致肿瘤。

（2）检测细胞凋亡的方法：早期调亡的形态学变化：前向角散射光降低：细胞核固缩，核碎裂，细胞质及细胞器密度增高，细胞体积变小。

侧向角散射光增高：染色体降解，细胞核碎裂，细胞内颗粒增多。

Annexin V-FITC/PI法：基本原理：细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。

这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。

PS是一-种带负电荷的磷脂，正常情况下主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时，细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。

AnnexinV是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，具有易于结合到磷脂类如PS的特性，对PS有高度的亲和性。

PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。

两种细胞死亡方式间的差别是在调亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。

因此，可以建立一种用Annexin V-FITC（异硫氰基荧光素）结合在细胞膜表面作为凋亡的指示，并结合一种染料（PI）排除试验，以检测细胞膜的完整性。

凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。

细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI染色产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。

因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。

二、实验设计原则1、样本类型：Live、Dead、Fixable2、检测指标：增殖还是凋亡3、荧光染料/检测通道例子：VGSC β3亚基诱导HepG2细胞的凋亡样本类型Live、HepG2(β3干扰）检测指标细胞膜完整性、有无PS荧光染料/检测通道PI、Annexin V-FITC三、实验操作步骤试剂盒名称:：Annexin V-FITC/PI双染凋亡试剂盒染色步骤：1、贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300g，4℃离心5 min，收集细胞。