猪瘟病毒衣壳蛋白核仁定位信号鉴定

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猪流行性腹泻病毒N蛋白核仁定位信号对宿主细胞周期的影响

猪流行性腹泻病毒N蛋白核仁定位信号对宿主细胞周期的影响刘随新;石达;陈建飞;张鑫;时洪艳;刘孝珍;张莎;王璐;冯力【摘要】为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白(N)与宿主细胞相互作用,本研究根据前期已经鉴定的PEDVN蛋白核仁定位信号序列,利用重叠延伸PCR (SOE-PCR)方法扩增出核仁定位信号序列缺失的PEDVN基因(dN),并将其与真核表达载体pAc-GFP-Cl连接,构建重组质粒pAc-GFP-dN.将pAc-GFP-dN转染于Vero E6细胞中,利用激光共聚焦显微镜分析重组质粒pAc-GFP-dN表达蛋白的定位情况,并利用流式细胞仪检测转染细胞的周期变化.实验结果表明:与完整的N蛋白相比,缺失核仁定位信号的N蛋白不能定位于细胞核仁,同时丧失了使宿主细胞周期在G2/M期停滞的能力,从而揭示了N蛋白核仁定位信号对宿主细胞具有重要的影响.%To study the interaction between porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) N protein and the host cell, the PEDV N gene was amplified with the deletion of nucleoli localization signal sequence by SOE-PCR and cloned into eukaryotic expression vector pAc-GFP-C1 to construct the recombinant plasmid pAc-GFP-dN. Vero E6 cells were transfected with the pAc-GFP-dN and the subcellular localization of the expressed dN protein was analyzed by confocal microscopy. The effect on cell cycle of the transfected cell was detected by flow cytometry. The results showed that the dN protein was unable to localize in the nucleus compared to the N protein as expected; However, the dN was also unable to induce the arresting on cell cycle G2/M caused by N protein. These results revealedthat the nucleoli localization signal in N protein has an important function to host cell.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2013(035)003【总页数】4页(P173-176)【关键词】猪流行性腹泻病毒;核衣壳蛋白;核仁定位信号;流式细胞术;宿主细胞周期【作者】刘随新;石达;陈建飞;张鑫;时洪艳;刘孝珍;张莎;王璐;冯力【作者单位】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江哈尔滨150001;东北农业大学,黑龙江哈尔滨150030;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江哈尔滨150001;东北农业大学,黑龙江哈尔滨150030;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江哈尔滨150001【正文语种】中文【中图分类】S852.65猪流行性腹泻（Porcine epidem ic diarrhea，PED）是由PED病毒（PEDV）引起的一种急性高度接触性肠道传染病，以肠炎为主要特征，对仔猪致死率高达90%[1]，给养猪业造成了严重的经济损失。

猪瘟病毒E2蛋白部分抗原区基因在原核系统的分泌表达与鉴定

ＺｈｕＳｕ，ＬｉＪｎ，、ｎＪａｘｎｏｈｎ１ｕ２ № ｉｎｉ
（．ｉｄｏＡｒｕｔｒｌＵｉｒｔ，ｉｇａ６１９Ｃｉ；．ｓｔｔｏｎｍａＳｉｃｎｅｒａｄｉ，１ｎａｇｉｌａｎｅｓｙＱｎｄｏ２６０，ｈａ２ｎｔｕｅｆＡｉｌｃｎｅａｄＶｔｉｒＭｅｉｎＱｇｃｕｖｉｎＩｉｅｅｎｙｃｅ
摘要：于猪瘟病毒主要保护性抗原Ｅ基２囊膜糖蛋白有两个相对独立的抗原结构单位ＢＣ抗原区和ＡＤ抗原／／区，根据ＧｎＢｎｅｅａｋ中猪瘟病毒ＢＣ基因核苷酸序列设计合成一对引物，Ｒ．Ｃ／经ＴＰＲ扩增猪瘟病毒ＢＣ基因。／将扩增所得猪瘟病毒ＢＣ基因克隆于Ｐ／ＭＤ１．８Ｔ载体，然后定向亚克隆猪瘟病毒ＢＣ基因至原核表达载体ＰＴ０ａ的多／Ｅ３（）克隆位点中，经酶切鉴定后，将含有ＢＣ基因的重组质粒命名为ＰＴＢＣ／Ｅ／。用ＰＴＢＣ转化受体菌Ｂ２，Ｅ／Ｌ１挑取单个茵落，用诱导剂ＩｒｇＧ以不同浓度进行诱导，并在不同诱导时间收集样品。ＳＳＰＧＥ电泳分析证实ＢＣ基因获得经Ｄ．Ａ／了表达，并在终浓度为ｌ的ＩＴ诱导６ｍＭＩＧ，，ｈ其表达达到高峰，Ｗｅｔｎｂｏ分析证实表达的重组ＢＣ蛋白具有经ｓｒ．ｌｅｔ／反应活性，大小约为９Ｄ。Ｋ用表达产物作ＥＩＡ，ＬＳ结果表明表达产物与猪瘟病毒抗血清可发生明显的反应，而与其它８种疫病阳性血清不发生反应。常茵体蛋白与猪瘟病毒阳性血清也不发生反应。正通过对５份送检血清样品的检测８结果显示其与ＤｔＥＩＡ的相符率高达９％以上。ｏ－ＬＳ５试验证明利用原核表达系统制备的重组蛋白作为诊断用抗原，为研究亚单位疫苗或诊断抗原打下坚实基础。关键词：瘟病毒；／猪ＢＣ抗原区；达表中图分类号：８２６１Ｓ５．５文献标识码：文章编号：０５９４２１）８０２ — ４Ａ１０ — ４Ｘ（０００ — ０４０

猪瘟病毒衣壳蛋白的细胞核定位研究

２．ＤｉｖｉｓｉｏｎｏｆＳｗｉｎｅＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ，ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＨａｒｂｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｙｒＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｃｅｌｌｓ
ＬＩＵＮｉｎｇ，ＳＨＩＨｏｎｇ－ｙａｎ，ＣＨＥＮＪｉａｎ－ｆｅｉ。，ＦｅｎｇＬｉ，ＺＨＡＮＧＸｉｎ２，ＨＵＧｕｉ — ｘｕｅ
第３６卷第１期
２０１４年１月
中国预
防兽
医学报
Ｖｅ１．３６．ＮＯ．１Ｊａｎ．２０１４
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｎａｒｌｏｆＰｒｅｖｅｎｔｉｖｅＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ
ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｎｔｈｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｃｅｌｌｓ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇＣＳＦＶｃａｐｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎｈａｄｈｅｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｉｎｎｕｃｌｅｏｌｕｓ，ｗｈｉｃｈｐｒｏｖｉｄｅｄｔｈｅ
ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｒｂｉｎ１５０００１，Ｃｈｉｎａ）

抗非洲猪瘟病毒NP419L蛋白纳米抗体的筛选鉴定及其在抗体检测中的初步应用

畜牧兽医学报 2023,54(6):2509-2520A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.06.029开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):抗非洲猪瘟病毒N P 419L 蛋白纳米抗体的筛选鉴定及其在抗体检测中的初步应用王映,朱家宏,赵加凯,纪品品,陈旭,张路,刘宝元,孙亚妮*,赵钦*(西北农林科技大学动物医学院,农业农村部国家动物疫病数据中心杨凌观测实验点,杨凌712100)摘要:非洲猪瘟(A f r i c a n s w i n e f e v e r ,A S F )是猪的一种高度传染性疾病,严重威胁全球养猪业的发展㊂本研究旨在筛选抗非洲猪瘟病毒(A S F v i r u s ,A S F V )N P 419L 蛋白的纳米抗体并对其在A S F 抗体检测中的应用进行初步评价㊂大肠杆菌表达和N i -N T A 亲和层析纯化等技术表达纯化重组N P 419L 蛋白;将纯化的重组蛋白免疫双峰驼,5次免疫采集外周血淋巴细胞提取总R N A ,经反转录㊁巢式P C R ㊁酶切㊁连接和电转化等构建抗N P 419L 蛋白的噬菌体展示文库;利用噬菌体展示筛淘技术,经三轮筛淘获得抗N P 419L 蛋白的纳米抗体;构建纳米抗体与辣根过氧化物酶(H R P )融合蛋白的真核表达载体,转染H E K 293T 细胞,E L I S A 和间接免疫荧光(I F A )等鉴定融合蛋白的分泌表达及其与N P 419L 蛋白的结合;竞争E L I S A 初步评价获得的纳米抗体与H R P 融合蛋白在A S F 抗体检测中的应用㊂结果显示,成功制备了纯度较高的预期大小为48k u 的重组N P 419L 蛋白;构建获得了阳性率为89.5%,库容量为6ˑ108的噬菌体展示文库;筛淘获得了6株抗N P 419L 蛋白的纳米抗体;分泌表达了该6株纳米抗体与H R P 的融合蛋白,E L I S A 检测发现该6株融合蛋白可特异性结合重组N P 419L 蛋白,I F A 检测发现1株融合蛋白与真核表达的N P 419L 蛋白结合,该融合蛋白可作为探针应用于A S F 抗体的检测㊂本研究成功筛选出6株抗A S F V N P 419L 蛋白的特异性纳米抗体,并对其进行了结合蛋白特性的鉴定和抗体检测初步应用的评价,为后续A S F 诊断技术的研发和N P 419L 蛋白功能研究奠定了基础㊂关键词:非洲猪瘟病毒;N P 419L 蛋白;纳米抗体中图分类号:S 852.659.1 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)06-2509-12收稿日期:2022-11-04基金项目:国家自然科学基金面上项目(32273041);中央级公益性科研院所基本科研业务费院级统筹项目作者简介:王映(1996-),女,山东烟台人,硕士生,主要从事动物疫病诊断和防治技术研究,E -m a i l :1076396765@q q.c o m *通信作者:孙亚妮,主要从事重大动物疫病病原感染和致病机制研究,E -m a i l :s u n ya n i @n w s u a f .e d u .c n ;赵钦,主要从事动物重大疫病㊁分子病毒与细胞免疫生物学研究,E -m a i l :qi n z h a o _2004@n w s u a f .e d u .c n S c r e e n i n g a n d I d e n t i f i c a t i o n o f N a n o b o d i e s a ga i n s t N P 419L P r o t e i n o f A f r i c a n S w i n e F e v e r V i r u s a n d I t s P r e l i m i n a r y A p p l i c a t i o n o f A n t ib o d y De t e c t i o n WA N G Y i n g ,Z HU J i a h o n g ,Z H A O J i a k a i ,J I P i n p i n ,C H E N X u ,Z H A N G L u ,L I U B a o yu a n ,S U N Y a n i *,Z H A O Q i n*(Y a n g l i n g O b s e r v i n g a n d E x p e r i m e n t a l S t a t i o n o f N a t i o n a l D a t a C e n t e r o f An i m a l H e a l t h ,C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e ,N o r t h w e s t A&F U n i v e r s i t y ,Y a n g l i n g 712100,C h i n a )A b s t r a c t :A f r i c a n s w i n e f e v e r (A S F )i s a h i g h l y i n f e c t i o u s d i s e a s e o f p i g s ,w h i c h s e r i o u s l y t h r e a t -e n s t h e d e v e l o p m e n t o f t h e g l o b a l p i g i n d u s t r y .T h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y i s t o s c r e e n s p e c i f i c n a n o b o d i e s a g a i n s t t h e N P 419L p r o t e i n o f A S F v i r u s (A S F V )a n d e v a l u a t e i t s a p pl i c a t i o n o f a n t i -A S F V a n t i b o d y d e t e c t i o n .W e p r e p a r e d t h e r e c o m b i n a n t N P 419L p r o t e i n b y E .c o l i e x pr e s s i o n s y s t e m a n d N i -N T A a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y pu r i f i c a t i o n .T h e p u r i f i e d r e c o m b i n a n t p r o t e i n w a s u s e d t o i mm u n i z e t h e B a c t r i a n c a m e l s .A f t e r t h e f i f t h i mm u n i z a t i o n ,p e r i p h e r a l b l o o d l y m ph o -畜牧兽医学报54卷c y t e s w e r e c o l l e c t e d a n d t o t a l R N A w a s e x t r a c t e d.A p h a g e d i s p l a y l i b r a r y a g a i n s t N P419L p r o-t e i n w a s c o n s t r u c t e d b y n e s t e d P C R,e n z y m e d i g e s t i o n,l i g a t i o n a n d e l e c t r o p o r a t i o n.N a n o b o d i e s a g a i n s t N P419L w e r e o b t a i n e d t h r o u g h t h r e e r o u n d s o f s c r e e n i n g u s i n g p h a g e d i s p l a y s c r e e n i n g t e c h n o l o g y.T h e e u k a r y o t i c e x p r e s s i o n v e c t o r s o f n a n o b o d i e s f u s e d w i t h h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e (H R P)p r o t e i n s w e r e c o n s t r u c t e d a n d t r a n s f e c t e d i n t o H E K293T c e l l s.T h e s e c r e t o r y e x p r e s s i o n o f t h e f u s i o n p r o t e i n a n d i t s b i n d i n g t o N P419L p r o t e i n w e r e i d e n t i f i e d b y E L I S A a n d i n d i r e c t i m-m u n o f l u o r e s c e n c e(I F A),a n d p r e l i m i n a r y e v a l u a t i o n o f t h e o b t a i n e d n a n o b o d y f u s e d w i t h H R P p r o t e i n s i n A S F d e t e c t i o n u s i n g c o m p e t i t i v e E L I S A.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e N P419L r e c o m-b i n a n t p r o t e i n w i t h t h e e x p e c t e d s i z e o f48k u w a s s u c c e s s f u l l y p r e p a r e d w i t h h i g h p u r i t y;a p h a g e d i s p l a y l i b r a r y w i t h a p o s i t i v e r a t e o f89.5%a n d a l i b r a r y c a p a c i t y o f6ˑ108w a s c o n s t r u c t e d;s i x s t r a i n s o f a n t i-N P419L p r o t e i n n a n o b o d i e s w e r e o b t a i n e d b y s c r e e n i n g;t h e f u s i o n p r o t e i n s o f t h e s e s i x n a n o b o d i e s w i t h H R P w e r e s e c r e t i v e l y e x p r e s s e d,t h e r e s u l t s o f E L I S A s h o w e d t h a t t h e s i x f u s i o n p r o t e i n s s p e c i f i c a l l y b i n d t o t h e r e c o m b i n a n t N P419L p r o t e i n,o n e f u s i o n p r o t e i n w a s f o u n d t o b i n d t o N P419L p r o t e i n e x p r e s s e d w i t h e u k a r y o t i c s y s t e m b y I F A,a n d t h i s f u s i o n p r o-t e i n c a n b e u s e d a s a p r o b e f o r t h e d e t e c t i o n o f A S F V a n t i b o d i e s.I n t h e s t u d y,s i x n a n o b o d i e s a-g a i n s t A S F V N P419L p r o t e i n w e r e s u c c e s s f u l l y s c r e e n e d.T h e p r e l i m i n a r y c h a r a c t e r i z a t i o n o f i t s b i n d i n g p r o t e i n a n d i t s a p p l i c a t i o n o f a n t i b o d y d e t e c t i o n w e r e a l s o c a r r i e d o u t,w h i c h p r o v i d e d t h e b a s i s f o r t h e s u b s e q u e n t d e v e l o p m e n t o f A S F d i a g n o s t i c t e c h n o l o g y a n d t h e f u n c t i o n a l s t u d y o f N P419L p r o t e i n.K e y w o r d s:A f r i c a n s w i n e f e v e r v i r u s;N P419L p r o t e i n;n a n o b o d y*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r s:S U N Y a n i,E-m a i l:s u n y a n i@n w s u a f.e d u.c n;Z H A O Q i n,E-m a i l: q i n z h a o_2004@n w s u a f.e d u.c n非洲猪瘟(A f r i c a n s w i n e f e v e r,A S F)是由非洲猪瘟病毒(A f r i c a n s w i n e f e v e r v i r u s,A S F V)感染家猪和野猪引起的一种急性㊁出血性㊁高度接触性传染病,被世界动物卫生组织(WO A H)列为必须报告的动物疫病[1]㊂家猪感染A S F V强毒株可引起严重的出血性疾病,致死率高达100%[2]㊂2018年, A S F传入我国并迅速扩散[3],给我国的养猪业造成了巨大的经济损失㊂由于A S F V基因类型多,免疫逃避机制复杂多样,目前还没有开发出针对该病毒的疫苗和有效的防治药物,只能依靠隔离和扑杀等严格的生物安全防控方式来控制疫情[4]㊂A S F V属于非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属,是一种大型双链D N A病毒,病毒基因组为170~ 190k b,可编码150多种蛋白质,包括多种结构蛋白及参与D N A复制和修复的各种酶等[5-6]㊂迄今为止,仅有60多种病毒蛋白的生物学功能被报道,严重阻碍该病疫苗和防治药物的研发㊂A S F V主要感染猪巨噬细胞,这些细胞具有氧化性并对病毒基因组造成持续损害[7]㊂在众多参与病毒复制和修复的酶中,有一类酶可修复宿主因子对A S F V基因组的损伤[8],统称为碱基切除修复系统(b a s e-e x c i s i o n r e p a i r,B E R),包括A P核酸内切酶(A S F V A P)[9-10]㊁D N A修复聚合酶(A S F V P o l X)[11]和D N A连接酶(A S F V L I G)[12]㊂其中,A S F V L I G (N P419L)是修复系统中唯一的D N A连接酶,它在A S F V的D N A修复过程中催化D N A加入反应,将D N A链上的缺口连接起来,并在病毒基因组的诱变中起重要作用[13]㊂有研究认为抑制其活性可能会破坏A S F V的D N A修复过程并损害基因组稳定性[13],因此深入研究N P419L蛋白的功能有助于了解A S F V复制的机制㊂此外,目前多数使用p30㊁p72㊁p54和p p62等A S F V的结构蛋白作为靶抗原检测A S F的抗体[14-15],而N P419L蛋白能否做为抗体检测的靶抗原仍未见相关报道㊂因此,为了能够深入研究N P419L蛋白的生物学功能和免疫学特性,需要制备抗该蛋白的抗体㊂骆驼科动物体内存在一种特殊的抗体,天然缺失轻链和重链第一恒定区,被称为重链抗体(h e a v y c h a i n a n t i b o d i e s,H c A b s)[16]㊂与传统抗体不同, H c A b仅通过重链可变区(v a r i a b l e d o m a i n s o f01526期王映等:抗非洲猪瘟病毒N P419L蛋白纳米抗体的筛选鉴定及其在抗体检测中的初步应用h e a v y c h a i n o f H c A b,V HH)识别抗原㊂V HH分子量仅有15k u左右,是目前已知最小完整的功能抗原结合片段,被称为纳米抗体(n a n o b o d y, N b)[17]㊂与传统抗体相比,纳米抗体具有分子量小㊁稳定性高㊁免疫原性低㊁特异性强等优点,在病毒性疾病的诊断和治疗方面有广阔的开发前景[18]㊂目前纳米抗体已被广泛的应用于人和动物重大疫病创新型诊断试剂和防治药物的研发中,例如新型冠状病毒肺炎[19]㊁中东呼吸综合征[20]㊁口蹄疫[21]和高致病性禽流感[22-23]等㊂抗A S F V的p30和p54等蛋白的纳米抗体也已有应用于A S F抗体检测中的报道,并表现出了较高的敏感性和特异性[24-25]㊂此外,该两个蛋白纳米抗体的制备也为A S F V感染和复制机制的研究提供了有效的材料支撑㊂为了能够筛选制备抗A S F V N P419L蛋白的纳米抗体,本研究利用原核表达系统表达纯化了该蛋白,免疫双峰驼并采集外周血淋巴细胞,通过噬菌体展示技术筛选获得了6株抗N P419L蛋白的纳米抗体,构建并表达了纳米抗体与辣根过氧化物酶(h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e,H R P)融合蛋白,并对其进行了初步的鉴定和抗体检测应用的评价㊂本研究为后续A S F V N P419L蛋白功能的深入研究以及基于纳米抗体的A S F诊断技术的研发提供了一种新的策略㊂1材料与方法1.1材料1.1.1质粒㊁菌株和细胞原核表达载体p E T-28a(+)㊁噬菌体展示载体p M E C S和真核表达载体p C A G E N等商品化载体均为本实验室购买并保存;真核表达载体p C M V-N1-H R P以商品化p E G F P-N1载体为骨架进行基因改造[26],该载体引入了分泌信号肽㊁HA㊁H R P和H i s标签;大肠杆菌感受态细胞T r a n s5α和B L21(D E3)购自北京全式金生物技术公司;E.c o l i T G1感受态细胞购自B e y o t i m e公司;辅助噬菌体M13K O7购自N E B公司;H E K293 T细胞为本实验室保存㊂1.1.2主要试剂T4D N A连接酶和限制性核酸内切酶B a m HⅠ㊁X h oⅠ㊁P s tⅠ㊁N o tⅠ等购自N E B公司;R N A提取试剂盒(R N e a s y P l u s M i n i K i t)购自Q I A G E N公司,R T-P C R反转录试剂盒(T r a n s S c r i p t R e v e r s e T r a n s c r i p t a s e)㊁鼠抗H A抗体㊁鼠抗H i s抗体㊁鼠抗F L A G抗体㊁H R P 标记的羊抗鼠I g G和羊抗兔I g G均购自北京全式金生物技术公司;兔抗骆驼多克隆抗体由实验室制备保存[27];转染试剂P E I购自P o l y s c i e n c e s公司;无机试剂均为国产分析纯产品;临床34份阳性和47份阴性A S F抗体猪血清为实验室收集并保存,上述血清均通过非洲猪瘟病毒E L I S A抗体检测试剂盒(北京金诺百泰生物技术有限公司)鉴定㊂1.2方法1.2.1 A S F V N P419L蛋白的原核表达与纯化A S F V编码N P419L蛋白的基因序列(G e nB a n k: N C_001659.2)由G E N E W I Z公司合成,连接至p U C56载体㊂由G E N E W I Z公司合成扩增该基因的引物(表1)㊂以合成的N P419L基因为模板,A S-F V-N P419L-F和A S F V-N P419L-R为引物,PC R 扩增目的基因片段㊂限制性内切酶B a m HⅠ和X h oⅠ酶切P C R产物和p E T-28a(+)表达载体, T4连接酶将目的基因连入载体中㊂测序鉴定正确后得到重组表达质粒p E T-28a-N P419L㊂阳性重组质粒转化至B L21(D E3)感受态细胞,表达重组蛋白㊂阳性菌液培养至O D600n m值为0.6~0.8,加入终浓度为1mm o l㊃L-1的I P T G, 37ħ诱导表达8h后收集菌体㊂以180W功率超声3s,暂停3s,超声40m i n裂解菌体后分别收集上清和沉淀,参考N i-N T A使用说明书纯化目的蛋白㊂S D S-P A G E和W e s t e r n b l o t分析目的蛋白的表达㊁纯化和抗原性㊂1.2.2动物免疫及血清效价测定 1m L纯化的重组N P419L蛋白(2m g㊃m L-1)与等体积佐剂乳化,颈部皮下多点免疫4周龄雌性双峰驼,共免疫5次㊂每两周免疫一次,第一次采用完全弗氏佐剂进行乳化,后四次采用不完全弗氏佐剂㊂第五次免疫一周后采集免疫骆驼的颈静脉血,分离血清和外周血淋巴细胞㊂参考刘红亮等描述的方法[28], E L I S A检测骆驼血清中抗N P419L蛋白的抗体效价㊂1.2.3噬菌体展示文库的构建参考R N A提取试剂盒说明书提取外周血淋巴细胞总R N A㊂以提取的R N A为模板,O l i g o(d T)20为反转录引物,参考T r a n s S c r i p t Ⅱ反转录试剂盒的说明书,合成c D N A㊂以c D N A为模板,参考刘红亮等描述的方法[28],巢式P C R扩增V HH基因片段㊂第一轮P C R以C A L L001㊁C A L L002为引物(表1),P C R产物经12g㊃L-1的琼脂糖凝胶电泳分离鉴定,回收大小约700b p的条带;以第一轮P C R回收产物为模1152畜牧兽医学报54卷表1 目的基因扩增引物T a b l e 1 P r i m e r s f o r a m p l i f i c a t i o n o f t a r g e t ge n e 引物名称P r i m e r n a m e引物序列(5'ң3')P r i m e r s e qu e n c e 酶切位点R e s t r i c t i o n s i t e sA S F V -N P 419L -FC G C G G A T C C A T G C T A A A T C A A T T T CB a m H ⅠA S F V -N P 419L -RC C G C T C G A G A A T G A T T T C T A A A A C AX h o Ⅰp C A G E N -N P 419L -F C C G A A T T C A T G C T A A A T C A A T T T C C T G G CE c o R I pC A G E N -N P 419L -R C G G C G G C C G C C T A A G C G T A G T C T G G G A C G T C G TA T G G G T A A A T G A T T T C T A A A A C AN o t IC A L L 001G T C C T G G C T G C T C T T C T A C A A G GC A L L 002G G T A C G T G C T G T T G A A C T G T T C C V HH -F C A G G T G C A G C T G C A G G A G T C T G G G G G A G RP s t ⅠV HH -RC T A G T G C G G C C G C T G A G G A G A C G G T G A C C T G G G TN o t Ⅰ下划线为酶切位点T h e u n d e r l i n e i s t h e r e s t r i c t i o n s i t e板,VHH -F ㊁V HH -R 为上下游引物(表1)进行第二轮P C R ,P C R 产物经15g ㊃L -1的琼脂糖凝胶电泳分离鉴定,回收大小约为400b p 的条带㊂限制性内切酶P s t Ⅰ和N o t Ⅰ对第二轮P C R 产物和p M E C S 噬菌体展示载体进行双酶切,T 4D N A 连接酶将目的基因连入载体㊂连接产物电转化至大肠杆菌T G 1感受态细胞,涂布于含葡萄糖且氨苄抗性的L B (L B /A m p-G L U )固体平板,37ħ培养6~8h ,收集菌苔,即为构建的抗N P 419L 的噬菌体展示文库㊂取20μL 培养物进行10倍比稀释,取10-3至10-6稀释度的样品涂布于L B /A m p-G L U 固体平板,37ħ培养8h ,计数平板上的菌落㊂次日,随机挑取48个单克隆加入1m L L B /A m p-G L U 液体培养基,37ħ振荡培养4~6h ,引物V HH -F 和V HH -R 进行P C R 鉴定,测定文库的阳性率,计算构建的纳米抗体库的库容㊂阳性克隆送至西安擎科生物技术有限公司,测序获得序列后分析文库的多样性㊂1.2.4 A S F V -N P 419L 特异性纳米抗体的淘选构建的噬菌体文库接种于含葡萄糖且氨苄抗性的Y T (2ˑY T /A m p-G L U )液体培养基,培养至O D 600n m 值为0.6~0.8,加入M 13K O 7辅助噬菌体,静置离心,加入氨苄和卡那霉素双抗性Y T (2ˑY T /A m p-K a n )液体培养基㊂过夜培养后收集上清,加入预冷的P E G /N a C l ,离心收集沉淀并用P B S 重悬,再次离心后收集上清即为救援的重组噬菌体㊂重组噬菌体进行10的倍比稀释后浸染对数生长期的T G 1,涂布于L B /A m p -G L U 固体平板,计算重组噬菌体滴度㊂原核表达纯化的重组N P 419L 蛋白包被E L I S A 板,加入救援的重组噬菌体,37ħ孵育2h ,加入新鲜配制的三乙胺溶液(0.1m o l ㊃L -1)洗脱结合的噬菌体,加入等体积的T r i s -H C l (1m o l ㊃L -1,pH=7.4)中和,即为第一轮洗脱液㊂参考上述救援噬菌体滴度的测定方法,测定第一轮洗脱液中的噬菌体滴度㊂将洗脱液浸染对数生长期的T G 1,进行第二轮的救援和筛淘㊂参考上述方法,对构建的噬菌体文库共进行三轮的救援和筛淘㊂第三轮淘选后测定滴度的平板上随机挑取96个单克隆,接种于L B /A m p-G L U 培养基,37ħ培养至对数生长期,加入终浓度为1mm o l ㊃L -1的I P T G 诱导表达㊂离心收集菌体沉淀,冻融3次,上清即为包含纳米抗体的粗提物㊂E L I S A 鉴定特异结合N P 419L 蛋白的粗提物㊂原核表达纯化的重组N P 419L 蛋白包被E L I S A 板,2.5%脱脂奶粉封闭;加入上述制备的粗提物,37ħ孵育1h ;加入抗H A 单抗,37ħ孵育1h ;加入H R P 标记的羊抗鼠I gG 抗体,37ħ孵育1h ,加入T M B 室温显色15m i n,用3m o l ㊃L-1H 2S O 4终止反应后,读取O D 450n m值㊂以包被的血清4型禽腺病毒(f o w l a d e n o v i r u s,F A d V )的H e x o n 蛋白为阴性对照㊂以N P 419L 蛋白为包被抗原的O D 450n m 值大于阴性对照的3倍以上,初步鉴定为特异性结合靶蛋白的粗提物㊂阳性粗提物对应的单克隆菌液送至西安擎科生物技术有限公司测序,获得的序列用M e g A l i gn 软件比对,纳米抗体高变区(C D R 3区)的氨基酸序列相似性大于95%的定义为同一株纳米抗体㊂1.2.5 纳米抗体与H R P 融合蛋白的表达以21526期王映等:抗非洲猪瘟病毒N P419L蛋白纳米抗体的筛选鉴定及其在抗体检测中的初步应用上述获得的包含编码阳性纳米抗体基因序列的单克隆菌液为模板,VHH-F和V HH-R为引物扩增基因序列,P s tⅠ和N o tⅠ将P C R产物和p C MV-N1-H R P载体进行双酶切,酶切产物用T4D N A连接至载体,转化至T r a n s5α感受态细胞,测序鉴定㊂阳性质粒利用P E I转染试剂转染至H E K293T细胞,培养48h,收取细胞上清即为表达制备的抗N P419L纳米抗体与H R P融合蛋白㊂间接免疫荧光试验(i n d i r e c t i mm u n o f l u o r e s-c e n c e a s s a y,I F A)鉴定融合蛋白在H E K293T细胞内的表达㊂4%多聚甲醛溶液固定转染细胞,1% B S A溶液封闭;依次孵育抗H i s单抗和F I T C标记的羊抗鼠I g G;D A P I染细胞核后,倒置荧光显微镜观察㊂E L I S A鉴定融合蛋白被分泌表达至细胞上清并具有H R P的反应活性㊂将收集的上清直接包被E L I S A板,2.5%脱脂奶粉封闭1h,直接加入TM B 显色液避光显色,加入3m o l㊃L-1H2S O4终止反应,读取O D450n m值㊂与阴性对照相比,鉴定上清中是否含有纳米抗体与H R P融合蛋白㊂1.2.6融合蛋白与原核表达N P419L蛋白结合的鉴定 E L I S A鉴定表达制备的纳米抗体与H R P 融合蛋白与原核表达的重组N P419L蛋白的结合㊂重组N P419L蛋白包被E L I S A酶标板,相同载体和系统表达制备的A S F V-p30和F A d V-H e x o n蛋白为无关蛋白对照,2.5%脱脂奶粉封闭;分别加入收集的上清(包含抗N P419L纳米抗体与H R P融合蛋白),室温孵育后加入T M B显色液,避光显色15 m i n后加入3m o l㊃L-1H2S O4终止反应,读取O D450n m值㊂E L I S A测定上清中不同纳米抗体与H R P融合蛋白与N P419L蛋白的结合效价㊂收集的转染细胞上清进行10的倍比(1ʒ10㊁1ʒ102㊁1ʒ103㊁1ʒ104)稀释后加入E L I S A板中,然后显色㊁终止反应,根据读取的O D450n m值确定不同融合蛋白的结合效价㊂1.2.7融合蛋白与真核表达N P419L蛋白的结合构建带有F L A G标签的N P419L蛋白的真核表达载体㊂以p E T-28a-N P419L质粒为模板,引物为p C A G E N-N P419L-F和p C A G E N-N P419L-R (表1),P C R扩增靶基因㊂E c o RⅠ和N o tⅠ将P C R 产物和p C A G E N真核表达载体分别双酶切,T4 D N A连接酶将靶基因连接至p C A G E N载体,测序鉴定㊂将阳性质粒转染至H E K293T细胞,培养24h,4%多聚甲醛固定细胞以及1%B S A溶液封闭;依次孵育抗F L A G单抗和F I T C标记的羊抗鼠I g G,D A P I染核后,倒置荧光显微镜下观察重组N P419L蛋白的表达㊂确定蛋白表达后,I F A鉴定表达制备的纳米抗体与H R P融合蛋白结合真核表达的N P419L蛋白㊂质粒转染的细胞固定封闭后,加入纳米抗体与H R P融合蛋白室温孵育1h;依次孵育抗H i s单抗和F I T C标记的羊抗鼠I g G,D A P I 染核后倒置荧光显微镜观测结果㊂1.2.8融合蛋白在A S F抗体检测中的初步应用竞争E L I S A初步评价制备的纳米抗体与H R P 融合蛋白在A S F抗体检测中的应用㊂重组N P419L蛋白(400n g㊃孔-1)包被E L I S A板,2.5%脱脂奶粉封闭;制备的纳米抗体与H R P融合蛋白分别与A S F抗体阳性(34份)和阴性(47份)猪血清混匀后,加入E L I S A板中,37ħ孵育1h;洗板后每孔加入T M B显色液,避光显色15m i n后加入3m o l㊃L-1H2S O4终止反应,读取O D450n m值㊂比较分析阳性和阴性血清的O D450n m值,初步评价筛选获得的纳米抗体在A S F抗体检测中的应用㊂2结果2.1A S F V N P419L重组蛋白的原核表达、纯化及鉴定构建的A S F V N P419L蛋白原核表达质粒转化至B L21(D E3),经I P T G诱导表达后,S D S-P A G E 结果显示,成功获得预期大小为48k u的重组N P419L蛋白(图1A);菌体超声裂解后,该重组蛋白主要以包涵体的形式存在(图1A);N i-N T A亲和层析纯化获得了纯度较高的目的蛋白(图1A)㊂W e s t e r n b l o t结果显示,表达制备的N P419L重组蛋白与A S F阳性猪血清具有良好的反应性,说明原核表达的重组N P419L蛋白具有良好的抗原性(图1B)㊂2.2免疫骆驼抗N P419L蛋白抗体效价的测定5次免疫后,采集免疫骆驼的血清,E L I S A结果显示,免疫骆驼中抗N P419L蛋白特异性抗体效价可达1ʒ128000(图2),表明制备的重组N P419L蛋白具有良好的免疫原性,可刺激骆驼产生较好的免疫应答反应㊂2.3抗A S F V N P419L蛋白纳米抗体噬菌体展示文库的构建5免后1周采集免疫骆驼的外周血并提取总3152畜牧兽医学报54卷M.蛋白质相对分子质量标准;1.p E T -28a 空载诱导表达菌体;2.未诱导表达菌体;3.诱导表达菌体;4.菌体裂解后沉淀;5.菌体裂解后上清;6.纯化的重组蛋白M.P r o t e i n m a r k e r ;1.N e ga t i v eb ac t e r i a w i t h i nd u c t i o n ;2.P o s i t i ve b a c t e r i a w i t h o u t i n d u c t i o n ;3.P o s i t i v e b a c t e r i a w i t h i n -d u c t i o n ;4.P e l l e t s af t e r s o n i c a t i o n ;5.S u pe r n a t a n t af t e r s o n i c a t i o n ;6.P u r i f i e d r e c o m b i n a n t p r o t e i n 图1 S D S -P A G E (A )和W e s t e r n b l o t (B )鉴定原核表达纯化的A S F V N P 419L 重组蛋白F i g .1 I d e n t i f i c a t i o n o f t h e r e c o m b i n a n t A S F V N P 419L p r o t e i n b y S D S -P AG E (A )a n d W e s t e r n b l o t a n a l ys i s (B)图2 E L I S A 检测免疫骆驼中抗N P 419L 抗体的效价F i g .2 T i t e r s o f a n t i -N P 419L a n t i b o d yt i t e r i n t h e i m m u n i z e d b y de t e c t i o n of E L I S A R N A ,以R N A 为模板,经巢式R T -P C R 成功扩增得到了编码V HH 的基因片段,其预期大小为400b p(图3A )㊂经酶切,连接和电转化后,成功构建了库容量为6ˑ108的抗N P 419L 蛋白的V HH 噬菌体展示文库㊂经菌液P C R 鉴定,文库阳性率约为89.5%(图3B )㊂阳性单克隆测序结果表明插入的V HH 基因没有重复序列(图3C ),说明构建的文库多样性较好㊂2.4 抗A S F V N P 419L 蛋白特异性纳米抗体的淘选以表达制备的N P 419L 重组蛋白为包被抗原,三轮噬菌体展示淘选后,结果显示与对照相比,抗N P 419L 蛋白的特异性噬菌体比例逐渐升高,由0.7升至85(表2),表明抗N P 419L 特异性噬菌体得到有效富集㊂将第三轮淘选的噬菌体进行滴度测定,结果显示与阴性对照组相比,抗N P 419L 的噬菌体得到明显富集(图4A )㊂第三轮淘选后测定滴度的平板上随机挑取96个单克隆,经I P T G 诱导制备可溶性的纳米抗体粗提物㊂利用制备的粗提物进行E L I S A ,结果显示制备的96个粗提物中有23个可能与N P 419L 蛋白发生特异性结合(图4B )㊂将阳性粗提物对应的单克隆进行测序,根据获得的23个V HH C D R 3的氨基酸序列比对结果,成功筛淘获得6株抗N P 419L 蛋白的特异性纳米抗体,分别命名为A S F V -N P 419L -N b 18㊁-20㊁-34㊁-46㊁-49和-89,且6株纳米抗体均在F R 2区存在典型的亲水性氨基酸替换(图5)㊂2.5 抗A S F V N P 419L 蛋白与H R P 融合蛋白的表达获得的抗N P 419L 纳米抗体的基因序列连接至pC MV -N 1-H R P 载体,成功构建了纳米抗体与H R P 融合蛋白的真核表达载体㊂阳性质粒转染H E K 293T 细胞48h 后,I F A 结果显示抗N P 419L 纳米抗体与H R P 融合蛋白成功在细胞中表达(图6A )㊂利用收集的上清直接包被E L I S A 板显色,结果显示,融合蛋白成功分泌至细胞培养上清中,具有H R P 与其底物T M B 反应的特性(图6B )㊂该6株融合蛋白命名为A S F V -N P 419L -N b 18-H R P ㊁-20-H R P ㊁-34-H R P ㊁-46-H R P ㊁-49-H R P 和-89-H R P ㊂2.6 6株纳米抗体与H R P 融合蛋白与A S F V N P 419L 蛋白的结合原核表达制备的N P 419L 蛋白为包被抗原,收集的6株纳米抗体与H R P 融合蛋白上清为孵育的一抗,直接E L I S A 结果显示,与无关抗原相比6株融合蛋白均可特异性结合原核表达制备的A S F V41526期王映等:抗非洲猪瘟病毒N P 419L 蛋白纳米抗体的筛选鉴定及其在抗体检测中的初步应用A.巢式P C R 扩增V HH 基因(M.D N A 相对分子质量标准;1.第一轮P C R 扩增;2.第二轮P C R 扩增);B .P C R 鉴定V HH 文库阳性率;C .阳性克隆序列A.A m p l i f i c a t i o n o f V HH g e n e b y ne s t e d P C R (M.D N A m a r k e r ;1.T h ef i r s t r o u n d o f P C R ;2.T h e s e c o n d r o u n d o f P C R );B .I d e n t i f i c a t i o n o f V HH l i b r a r y p o s i t i v e r a t e b y P C R ;C .T h e s e q u e n c e s o f t h e p o s i t i v e P C R p r o d u c t s i n t h e l i b r a r y 图3 V H H 噬菌体展示文库的构建F ig .3 C o n s t r u c t i o n o f V H H ph a g e di s p l a y l i b r a r y表2 N P 419L 特异性噬菌体富集情况T a b l e 2 E n r i c h m e n t o f p h a g e p a r t i c l e s c a r r y i n g s pe c if i c a n t i -N P 419L n a n o b o d i e s 淘选轮数R o u n d o f p a n n i n g投入量/(p f u ㊃w e l l -1)I n p u t p h a g e 阳性洗脱量/(p f u ㊃w e l l -1)P o u t p u t 对照洗脱量/(pf u ㊃w e l l -1)N o u t pu t 特异性噬菌体比例P /N 第一轮R o u n d 15.0ˑ10102.1ˑ1063.0ˑ1060.7第二轮R o u n d 25.0ˑ10106.4ˑ1082.2ˑ10729.1第三轮R o u n d 35.0ˑ10101.7ˑ1082.0ˑ10685.0N P 419L 蛋白(图7A )㊂E L I S A 分析6株融合蛋白结合重组N P 419L 蛋白的效价,结果表明A S F V -N P 419L -N b 20-H R P 的结合效价最高,达104;A S F V -N P 419L -N b 89-H R P 的结合效价最低,在1ʒ102稀释时已不能结合;其余4株结合效价为103(图7B)㊂经E c o RⅠ和N o t Ⅰ双酶切鉴定后,琼脂糖凝胶电泳结果显示成功构建了重组N P 419L 蛋白的真核表达质粒(图7C )㊂阳性质粒转染H E K 293T 细胞,利用抗F L A G 单抗进行I F A 检测发现,重组N P 419L 蛋白成功在细胞质中表达(图7D )㊂利用收集的抗N P 419L 蛋白纳米抗体与H R P 融合蛋白为一抗进行I F A 检测,结果发现A S F V -N P 419L -N b 20-H R P 与H E K 293T 细胞中表达的N P 419L 蛋白结合,其余融合蛋白不结合(图7D )㊂2.7 A S F V -N P 419L -N b 20-H R P 融合蛋白在A S F V 抗体检测中的应用A S F V -N P 419L -N b 20-H R P 融合蛋白作为检测探针,竞争E L I S A 检测A S F 抗体阳性和阴性猪血清,结果发现47份阴性血清的O D 450n m 值在1.17~1.35之间㊂34份阳性血清中,32份的5152畜牧兽医学报54卷A.噬菌体滴度;B .间接E L I S A 检测重组纳米抗体与N P 419L 的结合A.P h a g e t i t e r s ;B .D e t e c t i o n t h e r e a c t i v i t y o f r e c o m b i n a n t n a n o b o d i e s w i t h N P 419L p r o t e i n b yi n d i r e c t E L I S A 图4 间接E L I S A 筛选N P 419L 特异性纳米抗体F i g .4 S c r e e n i n g o f N P 419L -s p e c i f i c n a n o b o d i e s b y In d i r e c t E L I SA 图5 N P 419L 特异性纳米抗体氨基酸序列比对F i g .5 A m i n o a c i d s e q u e n c e s a l i g n m e n t o f N P 419L -s pe c if i c n a n o b o d i e s O D 450n m 值在0.21~0.67之间,平均竞争率为73%,统计学分析显示该32份阳性血清显著竞争抑制了A S F V -N P 419L -N b 20-H R P 融合蛋白与N P 419L 蛋白的结合(图8)㊂另外2份阳性血清用该竞争E L I S A 方法未检测出,而商品化试剂盒检测结果为弱阳性㊂上述结果初步表明,制备的A S F V -N P 419L -N b 20-H R P 融合蛋白可以作为A S F 抗体检测的竞争探针,应用于猪血清中A S F 抗体检测竞争E L I S A 试剂盒的开发㊂61526期王映等:抗非洲猪瘟病毒N P 419L蛋白纳米抗体的筛选鉴定及其在抗体检测中的初步应用A.I F A 鉴定细胞中融合蛋白的表达;B .E L I S A 鉴定融合蛋白分泌至细胞上清中表达A.E x p r e s s i o n o f a n t i -N P 419L n a n o b o d y -H R P f u s i o n p r o t e i n s i n t h e H E K 293T c e l l s b y I F A a n a l y s i s ;B .S e c r e t o r y e x pr e s -s i o n o f a n t i -N P 419L n a n o b o d y -H R P f u s i o n p r o t e i n s i n t h e H E K 293T c e l l s b y E L I S A a n a l y s i s 图6 抗N P 419L 蛋白纳米抗体与H R P 融合蛋白在H E K 293T 细胞中的表达鉴定F i g .6 E x pr e s s i o n o f a n i -N P 419L n a n o b o d i e s f u s e d w i t h H R P i n t h e H E K 293T c e l ls A.融合蛋白特异性结合原核表达的重组N P 419L 蛋白;B .上清中融合蛋白结合N P 419L 蛋白的结合效价;C .重组N P 419L 真核表达载体的酶切鉴定(M.D N A 相对分子质量标准;1.阳性质粒的双酶切鉴定);D.I F A 鉴定融合蛋白结合真核表达的重组N P 419L 蛋白A.S p e c i f i c i t y ;B .A f f i n i t y ;C .E n z y m a t i c d i ge s t i o n of r e c o m b i n a n t p l a s m i d s p C A G E N -N P 419L (M.D N A m a r k e r ;1.E n -z y m a t i c d ig e s t i o n o f p C A G E N -N P 419L );D.D e t e c t i o n th e bi n d i n g o f N b 20t o N P 419L i n H E K -293T c e l l s b y IF A 图7 抗N P 419L 纳米抗体与H R P 融合蛋白结合不同表达形式N P 419L 蛋白的鉴定F i g .7 A c t i v i t y i d e n t i f i c a t i o n o f N P 419L -s pe c if i c n a n o b o d i e s 3 讨论最近有研究发现,我国出现了基因Ⅰ型和低毒力的基因Ⅱ型A S F V 毒株[29-30],该类毒株可导致猪的轻度感染和慢性疾病,加大了早期诊断难度,给我国A S F 的防控带来更多问题和挑战㊂因此,仍需要制备抗A S F V 不同蛋白的抗体并深入研究它们的生物学特性,为该病诊断技术和疫苗的开发提供理论和材料支撑㊂纳米抗体作为第三代基因工程抗体,逐渐成为病原体特性研究及疫病诊断和防治技术研发的有效工具㊂基于A S F 对我国养猪业的危害以及纳米抗体易基因工程改造和体外表达成本低7152畜牧兽医学报54卷***.P<0.001图8竞争E L I S A检测A S F抗体阳性和阴性猪血清F i g.8C o m p e t i t i v e E L I S A f o r d e t e c t i o n o f A S F a n t i b o d y p o s i-t i v e a n d n e g a t i v e s w i n e s e r u m的优势,本研究成功筛选制备了6株抗A S F V N P419L蛋白的纳米抗体,并且初步评价了其中1株纳米抗体在A S F抗体检测中的应用㊂然而,目前针对该病抗体的检测,大多数使用p30㊁p72㊁p54和p p62等A S F V主要的结构蛋白为靶抗原㊂因此, N P419L蛋白与上述蛋白在A S F抗体检测中的差异以及其能否也成为一种理想的检测靶抗原,仍需要后续深入的研究,进而为A S F抗体的检测提供一种新的策略㊂本研究通过抗原表达㊁动物免疫和噬菌体展示筛淘等技术成功筛选了6株抗A S F V N P419L的特异性纳米抗体㊂然而,前期我们制备其它病原(如新城疫和禽流感病毒)和蛋白的纳米抗体,通常能够筛选到20株左右㊂比较整个试验的操作过程,作者发现免疫的抗原以可溶形式存在时,筛选获得的纳米抗体较多㊂本研究中原核表达制备的重组N P419L 蛋白以包涵体的形式存在,该蛋白在透析复性过程中也迅速析出而无法完全复性㊂面对该问题,作者也通过降低诱导表达温度(16ħ)和转速(150r㊃m i n-1)等表达条件,但是重组N P419L蛋白均以包涵体的形式存在㊂因此,为了后续能够筛选更多株的抗N P419L蛋白的纳米抗体,建议后续可以用真核表达系统表达制备可溶形式的N P419L蛋白进行免疫㊂本研究制备的6株纳米抗体通过体外原核表达的重组N P419L蛋白免疫双峰驼获得,需要鉴定该6株纳米抗体能否结合A S F V内源性N P419L蛋白㊂基于此,作者先鉴定了6株纳米抗体与H R P 融合蛋白与真核表达的N P419L蛋白的结合特性,发现仅A S F V-N P419L-N b20-H R P可特异性结合真核表达的N P419L蛋白㊂随后利用该融合蛋白为一抗,I F A和W e s t e r n b l o t检测了A S F V感染P AM细胞后的内源性N P419L蛋白,结果均为阴性,该结果似乎提示该融合蛋白不能结合病毒内源性N P419L蛋白㊂然而,该融合蛋白可作为竞争探针有效检测猪血清中的A S F抗体,提示该纳米抗体识别的表位在A S F V感染猪后可刺激机体产生抗体㊂因此,作者推测该融合蛋白不能结合内源性N P419L蛋白可能是由于融合蛋白亲和力低或上清中含量低㊂总之,后续仍需对该株纳米抗体进行免疫学特性研究,验证其作为A S F V N P419L蛋白功能研究工具的可行性㊂纳米抗体易被体外基因工程改造,近年来被广泛的应用于疫病诊断和食品检测技术的研发中㊂例如,在疫病诊断领域,利用纳米抗体与H R P融合蛋白为检测探针,目前已成功建立了鸡新城疫[26]㊁猪繁殖与呼吸综合征[31]㊁猪圆环病毒2型[32]等重要动物疫病的抗体竞争E L I S A检测方法[33]㊂此外,也有利用纳米抗体的生物素或胶体金标记,建立了病原的夹心E L I S A和胶体金检测试纸条[34]㊂与基于传统抗体建立的诊断或检测技术相比,该类创新技术展现了生产成本低,耐极端环境和操作简易的特点㊂本研究成功表达制备了6株抗A S F V N P419L 纳米抗体与H R P融合蛋白,其中1株融合蛋白可有效的作为竞争探针检测猪血清中A S F的抗体㊂但是利用该融合蛋白检测的34份A S F抗体阳性猪血清,结果2份为阴性㊂该结果提示该融合蛋白作为探针检测A S F的抗体,可能敏感性较低,后续仍需要优化竞争E L I S A相关条件,提高该检测方法的敏感性㊂4结论利用大肠杆菌表达系统成功表达并纯化了重组A S F V N P419L重组蛋白,该蛋白具有很好的抗原性;通过双峰驼免疫和文库构建等技术,成功构建了库容为6ˑ108的噬菌体展示文库,利用噬菌体展示技术成功筛选获得6株抗N P419L蛋白的特异性纳米抗体;真核表达了该6株纳米抗体与H R P的融合蛋白,其中1株融合蛋白A S F V-N P419L-N b20-H R P可结合真核表达的N P419L蛋白,并可与A S F抗体阳性猪血清竞争地结合N P419L蛋白㊂8152。

猪瘟病毒E2蛋白抗原表位集中区的原核表达及鉴定

ｏｎｔｈｅＡＩＶｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ，ｔｈｅｃｈｉｃｋｅｎＳＴ３ＧａｌＩｇｅｎｅｗａｓｅｏｌｏｎｅｄａｎｄｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘ —
石出。
关键词：猪瘟病毒；Ｅ２蛋白；抗原表位；原核表达；鉴定
中图分类号：Ｑ７８６文献标识码：Ａ文章编号：１００７ — ５０３８（２０１３）０３ — ００１５ — ０６
猪瘟（Ｃｌａｓｓｉｃａｌｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒ，ＣＳＦ）是由猪瘟病
ＳＴ３ＧＡＬ工Ｇｅｎｅ
ＣＨＥＮＨｕａｎ。ＬＩＭｉｎｇ — ｙｉ，ＧＡＯＸｕａｎ
（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＨｅｂｅｉ，Ｂａｏｄｉｎｇ，Ｍｅｂｅｉ，０７１０００，Ｃｈｉｎａ；
作者简介：郭东光（１９８７一），男，河南淮阳人，硕士研究生，主要从事动物病理学与分子免疫学研究。＊通讯作者
ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆＢＨＫ－２１ＣｅｌｌＬｉｎｅＳｔａｂｌｙＥｘｐｒｅｓｓｉｎｇＣｈｉｃｋｅｎ

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白的高效表达及鉴定

３ａ均作为阴性对照。收集菌液，心弃上清用ＰＳ进２菌离Ｂ
行两次洗涤，ＰＳ悬浮菌体。取少量的菌液加人上样缓冲用Ｂ液，沸５ｒｉ，ｌ％的分离胶、％的浓缩胶进行ＳＳ— 煮ｎ用２ａ５ＤＰＧ电泳，２．，考马斯亮蓝Ｒ５ＡＥ１０Ｖ１５ｈ经２０染色后，冰用乙酸一乙醇脱色液进行脱色。
ＤＨ５。碱裂解法小提质粒。ａ
１２６酶切鉴定：据设计的酶切位点进行双酶切鉴定，．．根用
１％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。同时把部分质粒送大连宝
氨基酸序列同源性在９％～１０６０％之间
１２．表达产物的鉴定：上述表达的ｐ．９取ＥＴ一３ａ—Ｎ阳性２
・
６・
《海畜牧兽医通讯》２０上０９年第２期
猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣蛋白效表鉴定壳的高达及
张林吉，任士飞。李明义杜元钊 ’ 刘秀梵
（１徐州生物工程高等职业学校
２１０２扬州大学兽医学院３青岛易邦生物工程有限公司）２０６
琼脂糖凝胶电泳。１２４片段的纯化回收：Ｒ７ＰＲ产物经琼脂糖凝胶电．．ＯＦＣ
泳后，ＡｇｒｓｅＤＮＡｘｒｃｉｎｋｔ产品说明书回收目用ａｏｅｇｌｅｔａｔｉ按ｏ

猪瘟病毒研究进展

。
，
Ｃ
、
Ｅ。Ｏ、１Ｅ．们均由ＣＦ的对致死量ＣＦ（）Ｅ和２它ＥＳＶＳＶ的保护性免疫。由于编码
Ｎ－Ｒ５在结构蛋白中．ｇ４／８ｐ４４的核酸序列在属内比编码ｇ５ｐ５含有一个大的开放性阅读框架（Ｒ）此ＲＡＯＦ一端所编码。ＯＦ．
Ｎ５。Ｓ－３被加工成Ｎ２Ｎ３式存在于囊膜表面。ＳＢＮ２可Ｓ，Ｓ由于其分子内缺乏
与病毒囊膜结合力弱．（８）除ＣＥ，１Ｅ为结构蛋白外．Ｐ０．、ＯＥ和２其疏水的膜锚定区．
余均为非结构蛋白。
１ＳＶ基因结构与功能的研究ＣＦ
是各国研究的热点。
白在病毒ＲＡ上的编码顺序为Ｎ。Ｃ、ｒＮ、Ｅｎ
（Ｏ）Ｅ，２ＰＮＳ－３、Ｅ、１Ｅ、７、２ＮＳ４ＮＳＢ、Ａ、４
ＮＳＡ５
、
于细胞膜表面或被分泌到胞外。在病毒粒子中ｇ４／８７Ｄ的同源二聚体形ｐ４４以９Ｋａ
２２
２６０００３
维普资讯
主题策划
■
发病特征不典型．以发热、精ｙ残基则参与同源、异源二聚体的形区性散发．的序列保守程度高．因此Ｅ。ｒ可作为防治个Ｃｓｎ
猪瘟的一种靶蛋白。成。
神沉郁、食欲减退、咳嗽、共济失调、结膜
Ｅｎ有Ｒａｅ具ｒｓＮｓ活性．用于单链的作
ＲＮＡ
，
ｇ５的抗原决定区在其Ｎ端部分炎以及腹泻、Ｐ５围产期死亡、死胎、流产。中

猪瘟

是猪的一种急性接触性传染病，又称猪霍乱。

1885年首先在美国发现，以后传播到世界各大洲。

中国大部分省都有发生。

1903年美国兽医学家德希尼兹和多赛特鉴定本病的病原是披盖病毒科的瘟病毒属(Pestivirus)中的猪瘟病毒。

主要通过直接接触，或由于接触污染的媒介物而发病。

消化道、鼻腔粘膜和破裂的皮肤均是感染途径。

一年四季都可发生，以春夏多雨季节为多。

中文名：猪瘟英文名：swine fever；hog cholera别名：猪霍乱病原学：猪瘟病毒季节分布：春秋传染病：是传播途径：直接接触传播为主要方式潜伏期：5~7天，短的2天，长的21天临床表现：发病急，高热稽留，细小血管壁变性，全身广泛性出血点，脾梗死并发症：非洲猪瘟，猪丹毒疫苗预防：是预防措施：坚持自繁自养，必须引进种猪时严格做好检疫发病时，严格隔离疫苗防治猪瘟病猪是猪的一种急性接触性传染病，又称猪霍乱。

1885年首先在美国发现，以后传播到世界各大洲。

中国大部分省都有发生。

1903年美国兽医学家德希尼兹和多赛特鉴定本病的病原是披盖病毒科的瘟病毒属(Pestivirus)中的猪瘟病毒。

主要通过直接接触，或由于接触污染的媒介物而发病。

消化道、鼻腔粘膜和破裂的皮肤均是感染途径。

一年四季都可发生，以春夏多雨季节为多。

人工接种的猪，一般在36～48小时后体温升高。

而自然感染的潜伏期常为3～6天，间有延长到24天的。

典型病例表现为最急性、亚急性或慢性病程，死亡率高。

最急性型较少见，病猪体温升高，常无其他症状，1～2天内死亡。

急性型最常见，体温可上升到41℃以上，食欲减退或消失，可发生眼结膜炎并有脓性分泌物，鼻腔也常流出脓性粘液，间有呕吐,有时排泄物中带血液,甚至便血。

初期耳根、腹部、股内侧的皮肤常有许多点状出血或较大红点。

病程一般为1～2周，最后绝大多数死亡。

亚急性型常见于本病流行地区，病程可延至2～3周；有的转为慢性，常拖延1～2个月。

表现粘膜苍白，眼睑有出血点。

猪瘟病毒衣壳蛋白与宿主细胞核仁素蛋白相互作用

ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｃｅｌｌｕｌａｒＮＣＬｉｎｔｅｒａｃｔｓｗｉｔｈＣｐｒｏｔｅｉｎｏｆＣＳＦＶｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｃｅｌｌｓ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｃｌａｓｓｉｃａｌｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓ（ｃｓｒｖ）ｃａｐｓｉｄ（Ｃ）ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｎｕｃｌｅｏｌｉｎ
（ＮＣＬ）ｉｎｃｅｌｌｓ，ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｏｆＧＳＴｐｕｌｌ－ｄｏｗｎａｎｄＣｏ－ＩＰｗｅｒｅｕｓｅｄｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｔｈｅＮＣＬｐｒｏｔｅｉｎｏｆｓｗｉｎｅｔｅｓｔｉｃｌｅ（ＳＴ）ｃｅｌｌｓ，
摘
要：为鉴定猪瘟病毒（ＣＳＦＶ）衣壳蛋白（ｃ）与宿主细胞核仁素（ＮＣＬ）蛋白的相互作用，本研究将重组质粒
ｐＥＧＦＰ．ＣＳＦＶ．Ｃ转染至猪睾丸细胞（ＳＴ）中，采用ＧＳＴｐｕｌ１．ｄｏｗｎ和免疫共沉淀方法沉淀ｓＴ细胞中的ＮＣＬ蛋白，通

猪瘟病毒core蛋白核仁定位序列鉴定

基金项目:国家自然科学基金(３１５７０１５２)通信作者:吴锐,潘兹书C o r r e s p o n d e n c e t o :WU R u i ㊀E Ｇm a i l :w r u i １１２０＠１６３．c o m ;P A N Z i s h u ㊀E Ｇm a i l :z s pa n ＠w h u ．e d u ．c n d o i :１０．３９６９/j．i s s n ．１６７３Ｇ６１８４．２０１９．０５．００３论著猪瘟病毒C o r e 蛋白核仁定位序列鉴定吴锐１,２,潘兹书２１．贵州省人民医院生殖中心,贵阳５５０００２;２．武汉大学生命科学学院/病毒学国家重点实验室,武汉４３００７２摘㊀要:黄病毒科病毒核衣壳蛋白的核仁定位在病毒颗粒包装与病毒复制中发挥重要作用.为鉴定黄病毒科的猪瘟病毒C o r e 蛋白核仁定位序列,本研究构建了将C o r e 蛋白㊁截短突变体和氨基酸位点突变体分别与增强型绿色荧光蛋白(e n h a n c e d g r e e n f l u o r e s c e n t p r o t e i n ,E G F P )融合的真核表达质粒,转染至P K １５细胞后进行表达和定位分析,结果显示C o r e 蛋白核仁定位序列为P E S R K K L ,其关键氨基酸为R ７６K ７７,对理解猪瘟病毒C o r e 蛋白结构与功能和为后续研究C o r e 蛋白在病毒复制及颗粒包装中的作用有重要意义.关键词:猪瘟病毒;C o r e 蛋白;核仁定位I d e n t i f i c a t i o no fn u c l e o l u sl o c a l i z a t i o ns e q u e n c ei nt h e C o r e pr o t e i no f c l a s s i c a l s w i n e f e v e r v i r u s WU R u i １,２,P A N Z i s h u２１．R e p r o d u c t i v eC e n t e r ,G u i z h o u p r o v i n c i a l p e o p l e sh o s p i t a l ,G u i y a n g ５５０００２,C h i n a ;２．S t a t e K e yL a b o r a t o r y o f V i r o l o g y ,C o l l e g e o f l i f e s c i e n c e ,W u h a nU n i v e r s i t y ,W uh a n４３０７２,C h i n a A b s t r a c t :T h ec o r e p r o t e i no fc l a s s i c a l s w i n ef e v e rv i r u s (C S F V )i san u c l e o c a ps i d p r o t e i nl o c a l i z e di nt h e i n n e r p a r t o f v i r i o n ．T h en u c l e o l u s l o c a l i z a t i o no fn u c l e o c a p s i d p r o t e i no f v i r u s i nf a m i l y F l a v i v i r i d a e p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i nv i r i o n p a c k a g i n g a n dv i r u s r e p l i c a t i o n ．I nt h i s s t u d y ,r e c o m b i n a n t e u k a r yo t i c p l a s m i d s e x p r e s s i n g C S F V C o r e p r o t e i n ,i t s t r u n c a t e da n da m i n oa c i d sm u t a n t s f u s e dw i t hE G F P w e r ec o n s t r u c t e d ,r e s p e c t i v e l y．S u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o no fc o r e p r o t e i na n di t s m u t a n t si nt h et r a n s f e c t e d P K １５c e l l s w e r e o b s e r v e d u n d e r c o n f o c a l m i c r o s c o p y ．W e s u c c e s s f u l l y i d e n t i f i e d t h e n u c l e o l u s l o c a l i z a t i o n s e q u e n c e P E S R K K La n d i t s c r i t i c a l a m i n oa c i d sR ７６K ７７i nC o r e p r o t e i n ．O u rw o r kw i l l f u r t h e r o u r u n d e r s t a n d i n g o f t h e s t r u c t u r ea n d f u n c t i o no fC S F V C o r e p r o t e i na n d i t s r o l e s i nv i r i o n p a c k a g i n g a n dv i r u s r e p l i c a t i o n ．K e yw o r d s :C l a s s i c a l s w i n e f e v e r v i r u s ;C o r e p r o t e i n ;N u c l e o l u s l o c a l i z a t i o n ㊀㊀猪瘟病毒(c l a s s i c a l s w i n e f e v e rv i r u s ,C S F V )为黄病毒科瘟病毒属成员,是引起猪急性㊁发热性与接触性传染病猪瘟的病原体.C S F V 基因组为１条长约１２３k b 的单股正链R N A ,包括位于两端的非编码区和中间编码多聚蛋白的开放读码框.多聚蛋白经过细胞与病毒的蛋白酶加工后形成４个结构蛋白和８个非结构蛋白.C S F V４种结构蛋白分别是核衣壳C o r e 蛋白㊁包膜蛋白E r n s㊁E １和E ２[１].C o r e 蛋白在基因组编码的多聚蛋白上位于N 端蛋白酶N pr o 与糖蛋白Er n s 之间.C o r e 蛋白的成熟包括N p r o 蛋白酶水解多聚蛋白,形成C o r e 蛋白的N 端及细胞信号肽酶加工７７２微生物与感染㊀J o u r n a l o f M i c r o b e s a n d I n f e c t i o n s ,O c t o b e r ２５,２０１９,１４(５):２７７Ｇ２８１㊀h t t p :ʊjm i ．f u d a n ．e d u ．c n产生C o r e蛋白的C端[２Ｇ４].通过C o r e蛋白缺失突变体的C S F V感染性c D N A克隆,研究人员发现C o r e蛋白的N端与C端在病毒颗粒形成中发挥重要作用[５].用缺失C o r e蛋白的C S F V感染性c D N A克隆转染细胞,连续传代后获得的N S３突变以补偿C o r e蛋白缺失的功能,产生的C S F V毒力降低[６],表明C o r e蛋白在决定C S F V毒力中有重要作用.研究还发现,对C o r e蛋白的S UMO化位点或I Q G A P１相互作用位点进行突变,可导致C S F V毒力减弱[７Ｇ８].研究表明C o r e蛋白对病毒的包装及其毒力具有十分重要的作用,但目前关于C o r e蛋白在细胞中的定位与功能的关系研究报道相对较少.本实验通过研究C o r e蛋白㊁截短突变体及氨基酸位点突变体在细胞中的定位,发现C o r e 蛋白的核仁定位序列为P E S R K K L,关键氨基酸为R７６K７７.１㊀材料与方法１．１㊀材料p E G F PＧC１质粒和P K１５细胞为本实验室保存,大肠埃希菌(E s c h e r i c h i ac o l i,E．c o l i)D H５α感受态细胞为本实验室制备,E c o RⅠ㊁B a m HⅠ限制性内切酶㊁T４D N A连接酶㊁D N A M a r k e r均购自T h e r m oF i s h e r公司,质粒提取试剂盒与D N A凝胶回收试剂盒购自P r o m e g a公司,L i p o f e c t a m i n e T M ２０００购自I n v i t r o g e n公司,D A P I购自S i g m a 公司.１．２㊀方法１．２．１㊀重组质粒p E G F PＧC o r e及C o r e蛋白突变体的构建㊀根据C S F V石门株基因组序列(N C B I N O．A F０９２４４８２),设计扩增C o r e基因及其突变体的引物,在引物两端分别引入E c o RⅠ和B a m HⅠ酶切位点.以C S F V石门株感染性c D N A克隆为模板,聚合酶链反应(p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n, P C R)扩增C o r e蛋白基因及其截短突变体.将扩增得到的D N A片段和p E G F PＧC１质粒用E c o RⅠ和B a m HⅠ双酶切后回收,并用T４连接酶进行连接,获得p E G F PＧC o r e及其截短的重组质粒.利用重叠P C R扩增法获得C o r e蛋白基因点突变D N A 片段,采取上述重组质粒构建方法获得了p E G F PＧC o r e突变体.重组质粒由上海生工生物工程公司进行测序鉴定.１．２．２㊀转染㊀提取足量的p E G F PＧC１㊁p E G F PＧC o r e蛋白及其突变体的重组质粒.将培养状态良好的P K１５细胞种植于３５m m细胞培养皿,常规培养６h左右.当细胞汇合度约８０％~９０％时,用L i p o f e c t a m i n e T M２０００进行转染.具体操作:分别配置A液(３μg质粒㊁２５０μL O p t iＧM E M培养基)和B液(１０μL L i p o f e c t a m i n e T M２０００㊁２５０μL O p t iＧM E M培养基),室温孵育５分钟后,混匀A液与B液,继续室温孵育２０分钟,加到含有细胞和培养液的培养皿中并混匀.１．２．３㊀荧光显微镜观察亚细胞定位㊀将重组质粒转染２４h后的P K１５细胞用P B S清洗,经甲醇Ｇ丙酮固定液(１ʒ１)固定后,D A P I染色.L A SA FL i t e ４０共聚焦荧光显微镜(L e i c a,G e r m a n y)下进行观察.２㊀结果２．１㊀C o r e蛋白定位于胞质及核仁为研究C S F V C o r e蛋白在P K１５细胞的定位分布情况,构建重组真核表达质粒p E G F PＧC o r e,转染到P K１５细胞后观察C o r e蛋白与E G F P融合蛋白的表达及细胞定位.结果显示,对照组E G F P均匀分布于整个细胞,而在转染重组质粒p E G F PＧC o r e的P K１５细胞的E G F PＧC o r e除胞质定位外还具有明显的核仁定位分布(图１),这与早期C o r e蛋白核仁定位的研究结论一致[９].２．２㊀C o r e蛋白核仁定位序列为P E S R K K L为鉴定C o r e蛋白核仁定位序列,构建３个p E G F PＧC o r e截短突变体重组质粒(图２A).将重组质粒分别转染至P K１５细胞,荧光共聚焦显微镜观察.结果显示,E G F PＧC o r e M１与E G F P定位情况类似,表明C o r e M１不存在定位C o r e蛋白的特异序列;E G F PＧC o r e M２与E G F PＧC o r e定位情况类似,存在明显的核仁定位,表明C o r e蛋白的核仁定位序列位于C o r e蛋白的第３６位与第８１位氨基酸之间;E G F PＧC o r e M３只定位在胞质内,没有细胞核仁定位(图２B).为进一步确认C o r e蛋白的核仁定位序列,利用P S O R T I I计算机程序(h t t p s://p s o r t．h g c．j p/ f o r m２．h t m l)对C o r e M２进行核仁定位序列分析.分析结果显示,７３~７９位氨基酸序列(P E S R K K L)可能是潜在的核仁定位序列.为了验证P E S R K K L 序列是否是C o r e蛋白核仁定位的关键序列,构建了p E G F PＧC o r eM４(Δ７３~７９)重组质粒,并将其转染到P K１５细胞.荧光显微镜显示,E G F PＧC o r e M４(Δ７３~７９)没有核仁定位(图２B),表明P E S R K K L８７２微生物与感染㊀J o u r n a l o f M i c r o b e s a n d I n f e c t i o n s,O c t o b e r２５,２０１９,１４(５):２７７Ｇ２８１图１㊀C S F VC o r e 蛋白在P K １５细胞的定位分析F i g ．１㊀A n a l yz e t h e l o c a l i z a t i o no fC S F VC o r e p r o t e i n i nP K １５c e l ls A :A m i n o a c i d s s e q u e n c e o f C S F VC o r e a n d i t s t r u n c a t e dm u t a n t s d i a g r a m．B :I mm u n o f l u o r e s c e n c e a n a l ys i s o f t r u n c a t e dC S F VC o r e p r o t e i n i nP K １５c e l l s ．图２㊀C S F VC o r e 蛋白、截短突变体的亚细胞定位F i g．２㊀S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o no f t r u n c a t e dC S F VC o r em u t a n t s９７２吴锐,等:猪瘟病毒C o r e 蛋白核仁定位序列鉴定序列是C S F V C o r e 蛋白核仁定位的关键序列.２．３㊀C o r e 蛋白核仁定位的关键氨基酸为R ７６K ７７为进一步定位C o r e 蛋白核仁定位序列的关键氨基酸,将C o r e 蛋白核仁定位序列的氨基酸依次突变为丙氨酸(图３A 和图３B ).结果发现,P E S R K K L 序列的单个氨基酸突变并不影响C o r e 蛋白的核仁定位(图３C ).根据黄病毒科其他病毒C o r e 蛋白的核仁定位序列研究,推测P E S R K K L 序列的连续２个碱性氨基酸序列可能是该序列核仁定位的关键氨基酸.因此,构建了E G F P ＧC o r e 的突变体R ７６A /K ７７A (图３A 和图３B ).观察发现,突变体R ７６A /K ７７A 不存在核仁定位(图３C ).以上结果表明R ７６K ７７是决定C o r e 蛋白核仁定位的关键氨基酸.A :C o r em u t a n t sw i t hi n d i c a t e da m i n oa c i d sm u t a t i o na n di t s l o c a l i z a t i o ni nP K １５c e l l s ．B :T h ea l i g n m e n to f s e q u e n c i n g r e s u l t so fC o r e m u t a n t s ．C :I mm u n o f l u o r e s c e n c e a n a l ys i s o fC o r em u t a n t s l o c a l i z a t i o n i nP K １５c e l l s ．图３㊀C S F VC o r e 蛋白核仁定位的关键氨基酸鉴定F i g．３㊀I d e n t i f i c a t i o no f c r i t i c a l a m i n o a c i d s f o r n u c l e o l u s l o c a l i z a t i o no fC S F VC o r e ３㊀讨论本研究发现C S F V C o r e 蛋白的核仁定位序列位于７３P E S R K K L ７９.已有研究报道,C S F V C o r e 蛋白的一个核仁定位序列位于５１K K K G K V ５６[９].因此,我们推测C S F V C o r e 蛋白至少具有两个核仁定位序列,缺失其中任何一个核仁定位序列都将导致C o r e 蛋白的核仁定位功能丧失.已有的研究表明,黄病毒科成员核心蛋白具有一个或多个核仁定位序列,对这些核仁定位序列进行的突变都严重影响病毒的包装与复制.例如,乙型脑炎病毒C o r e 蛋白的G ４２P ４３[１０],登革病毒C o r e 蛋白的K ７３K ７４A 和R ８５K ８６[１１]以及丙型肝炎病毒C o r e 蛋白第５~１３㊁３８~４３和１１２~１１７位氨基酸[１２]都是决定C o r e 蛋白核仁定位的关键氨基酸.那么C S F V C o r e 蛋白的核仁定位对病毒复制具有怎样的意义?有文献报道,缺失C o r e 蛋白第５１~５７位或第７１~７８位氨基酸分别导致转染感染性克隆２４h 后病毒滴度降低８７５％和９３７５％[５].可见,C S F V C o r e 的核仁定位对病毒颗粒具有一定的影响.而C o r e 蛋白核仁定位序列的缺失对病毒基因组的复制与病毒毒力的影响尚未可知,有待进一步的研究.此外,研究发现,第８２~９９位氨基酸序列具有０８２微生物与感染㊀J o u r n a l o f M i c r o b e s a n d I n fe c t i o n s ,O c t o b e r ２５,２０１９,１４(５):２７７Ｇ２８１较强的疏水性.研究结果显示,E G F PＧC o r e M３第８２~９９位氨基酸定位在胞质而没有细胞核仁定位,提示C o r e蛋白第８２~９９位氨基酸序列定位于细胞质而发挥作用.在黄病毒科的其他病毒也有类似报道,如丙型肝炎病毒C o r e蛋白的疏水结构域第１０９~１３３位氨基酸是C o r e蛋白从细胞核转运到细胞质的重要出核信号序列,突变其中的疏水氨基酸都将导致C o r e蛋白的核仁定位减少[１３];登革病毒C o r e蛋白通过其内部疏水序列第４６~６６位氨基酸定位到内质网膜上,使得病毒颗粒与内质网膜相关联[１４].登革病毒C o r e蛋白的内部疏水序列将病毒颗粒牵引到内质网膜形成的脂滴上,促进病毒基因组的复制,从而影响登革病毒的复制[１５].位于C S F V C o r e蛋白第８２~９９位氨基酸促进C o r e蛋白的核仁定位对病毒复制与包装具有怎样的功能还有待进一步研究.综上所述,本研究通过分析C o r e蛋白㊁截短突变体及氨基酸位点突变体与E G F P融合蛋白在P K１５细胞中的亚细胞定位,发现了C S F V C o r e蛋白核仁定位序列和关键氨基酸位点,为进一步研究C S F V C o r e蛋白结构与功能及其在病毒复制和组装中的作用提供了依据.参考文献[１]㊀T h i e lH J,S t a r k R,W e i l a n d E,Rüm e n a p fT,M e y e r sG．H o g c h o l e r av i r u s:m o l e c u l a r c o m p o s i t i o no f v i r i o n s f r o map e s t i v i r u s[J]．JV i r o l,１９９１,６５(９):４７０５Ｇ４７１２．[２]㊀Rüm e n a p fT,S t a r kR,H e i m a n n M,T h i e lH J．NＧt e r m i n a l p r o t e a s eo f p e s t i v i r u s e s:i d e n t i f i c a t i o no f p u t a t i v ec a t a l y t i cr e s i d u e s b y s i t eＧd i r e c t e dm u t a g e n e s i s[J]．JV i r o l,１９９８,７２(３):２５４４Ｇ２５４７．[３]㊀Rüm e n a p fT,U n g e rG,S t r a u s s J H,T h i e lH J．P r o c e s s i n g o f t h ee n v e l o p e g l y c o p r o t e i n s o f p e s t i v i r u s e s[J]．J V i r o l,１９９３,６７(６):３２８８Ｇ３２９４．[４]㊀S t a r kR,M e y e r sG,Rüm e n a p fT,T h i e lH J．P r o c e s s i n g o f p e s t i v i r u s p o l y p r o t e i n:c l e a v a g es i t eb e t w e e n a u t o p r o t e a s ea n dn u c l e o c a p s i d p r o t e i no f c l a s s i c a l s w i n e f e v e r v i r u s[J]．JV i r o l,１９９３,６７(１２):７０８８Ｇ７０９５．[５]㊀R i e d e l C,L a m p B,H e i m a n n M,Rüm e n a p f T．C h a r a c t e r i z a t i o no fe s s e n t i a ld o m a i n sa n d p l a s t i c i t y o ft h ec l a s s i c a l S w i n eF e v e r v i r u sC o r e p r o t e i n[J]．JV i r o l,２０１０,８４(２１):１１５２３Ｇ１１５３１．[６]㊀R i e d e lC,L a m p B,H e i m a n n M,Kön i g M,B l o m e S,M o e n n i g V,S c hüt t l e rC,T h i e lH J,Rüm e n a p fT．T h e c o r ep r o t e i no f c l a s s i c a l S w i n eF e v e r v i r u s i s d i s p e n s a b l e f o r v i r u sp r o p a g a t i o n i n v i t r o[J]．P L o S P a t h o g,２０１２,８(３):e１００２５９８．[７]㊀G l a d u eD P,H o l i n k aL G,F e r n a n d e zＧS a i n zI J,P r a r a tMV, O D o n n e l lV,V e p k h v a d z eN G,L uZ,R i s a t t iG R,B o r c aMV．I n t e r a c t i o n b e t w e e n C o r e p r o t e i n o fc l a s s i c a ls w i n ef e v e rv i r u sw i t hc e l l u l a rI Q G A P１p r o t e i na p p e a r se s s e n t i a lf o r v i r u l e n c e i n s w i n e[J]．V i r o l og y,２０１１,４１２(１):６８Ｇ７４．[８]㊀G l a d u eD P,H o l i n k aL G,F e r n a n d e zＧS a i n zI J,P r a r a tMV, O D o n e l lV,V e p kh v a d z eN,L uZ,R o g e r sK,Ri s a t t iG R,B o r c a MV．E f f e c t so ft h ei n t e r a c t i o n so fc l a s s i c a ls w i n ef e v e r v i r u sC o r e p r o t e i nw i t h p r o t e i n so f t h eS UMO y l a t i o np a t h w a y o nv i r u l e n c ei ns w i n e[J]．V i r o l o g y,２０１０,４０７(１):１２９Ｇ１３６．[９]㊀张鑫,刘宁,时洪艳,徐佳．猪瘟病毒衣壳蛋白核仁定位信号鉴定[J]．中国预防兽医学报,２０１５,３７(２):９３Ｇ９６．[１０]㊀M o r iY,O k a b a y a s h iT,Y a m a s h i t aT,Z h a oZ,W a k i t aT, Y a s u iK,H a s e b eF,T a d a n o M,K o n i s h iE,M o r i i s h iK,M a t s u u r a Y．N u c l e a rl o c a l i z a t i o no fJ a p a n e s ee n c e p h a l i t i sv i r u sc o r e p r o t e i ne n h a n c e sv i r a l r e p l i c a t i o n[J]．J V i r o l,２００５,７９(６):３４４８Ｇ３４５８．[１１]㊀S a n g i a m b u t S,K e e l a p a n g P,A a s k o v J,P u t t i k h u n t C, K a s i n r e r k W,M a l a s i t P,S i t t i s o m b u tN．M u l t i p l e r e g i o n s i nd e n g u e v i r u s c a p s i d p r o t e i n c o n t r i b u t e t on u c l e a r l o c a l i z a t i o nd u r i n g v i r u s i n fe c t i o n[J]．JG e n V i r o l,２００８,８９(P t５):１２５４Ｇ１２６４．[１２]㊀L e v i nA,N e u f e l d tC J,P a n g D,W i l s o nK,L o e w e nＧD o b l e r D,J o y c e MA,W o z n i a k RW,T y r r e l l D L．F u n c t i o n a lc h a r a c t e r i z a t i o no f n u c l e a r l o c a l i z a t i o na n de x p o r t s i g n a l s i nh e p a t i t i sCv i r u s p r o t e i n s a n dt h e i r r o l e i nt h em e m b r a n o u sw e b[J]．P L o SO n e,２０１４,９(１２):e１１４６２９．[１３]㊀C e r u t t iA,M a i l l a r dP,M i n i s i n iR,V i d a l a i nP O,R o o h v a n d F,P e c h e u rE I,P i r i s iM,B u d k o w s k aA．I d e n t i f i c a t i o no f af u n c t i o n a l,C RMＧ１Ｇd e p e n d e n t n u c l e a r e x p o r t s ig n a l i nh e p a t i t i sCv i r u s c o r e p r o t e i n[J]．P L o SO n e,２０１１,６(１０):e２５８５４．[１４]㊀M a r k o f fL,F a l g o u t B,C h a n g A．A c o n s e r v e di n t e r n a lh y d r o p h o b i c d o m a i n m e d i a t e s t h e s t a b l e m e m b r a n ei n t e g r a t i o no f t h e d e n g u e v i r u s c a p s i d p r o t e i n[J]．V i r o l o g y,１９９７,２３３(１):１０５Ｇ１１７．[１５]㊀S a m s aMM,M o n d o t t eJ A,I g l e s i a sN G,A s s u nçãoＧM i r a n d a I,B a r b o s aＧL i m a G,D aP o i a n A T,B o z z aP T,G a m a r n i kA V．D e n g u ev i r u sc a p s i d p r o t e i nu s u r p s l i p i dd r o p l e t sf o rv i r a l p a r t i c l e f o r m a t i o n[J]．P L o S P a t h o g,２００９,５(１０):e１０００６３２．(收稿日期:２０１９Ｇ０７Ｇ２４)１８２吴锐,等:猪瘟病毒C o r e蛋白核仁定位序列鉴定。

非洲猪瘟病毒（ASFV）结构蛋白p54 的表位定位研究

国际瞭望GLOBAL NEWS精选文章非洲猪瘟病毒（ASFV）结构蛋白p54的表位定位研究张爱琼，贺志昊（编译）（毕节市动物疫病预防控制中心，贵州毕节 551700）非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，对全球养猪业造成严重威胁，给中国以及东南亚在内的一些国家造成了严重的经济损失。

急性型ASF感染的猪只在感染后的临床表现为昏睡、厌食、高烧和死亡；在慢性型ASF中，猪只临床症状要轻得多。

由于现今没有有效的非洲猪瘟疫苗对猪只进行免疫来避免该病毒的感染，疫病的防控严重依赖于生物安全与对被感染猪的早期诊断检测，因此诊断工具对于该病早期发现和实施控制措施至关重要。

Petrovan V等人基于非洲猪瘟病毒p72和p30抗原应用于酶联免疫吸附试验作为非洲猪瘟血清学检测的重要工具，对与其他免疫原性蛋白一样p54结构蛋白进行研究。

除p72和p30抗原外，非洲猪瘟的另一个血清学目标是有183个氨基酸的结构蛋白p54，p54是进行ASFV检测和监测的良好血清学靶标，它是病毒基因E183L的产物，位于内包膜病毒体中。

p54是一种第二型病毒膜蛋白，其内部N-末端60个氨基酸，随后是一个跨膜结构域和一个131个氨基酸的C-末端结构域，据预测其外域具有几个糖基化和磷酰化位点。

该蛋白质具有保守和可变的肽区，p54蛋白间的差异很大程度上由位于蛋白C端一半的Pro-Ala-Ala-Ala重复序列的数量决定，基因变异与毒力无关，但有助于将病毒分为不同的基因型。

p54与p30共同参与病毒颗粒与靶细胞的结合，在病毒内化后，p54与宿主蛋白dynein相互作用，导致病毒粒转运到细胞的核周区域，p54中相应的动力蛋白结合结构域（DBD）也参与Caspase-3的激活和凋亡的诱导，位于氨基酸149-161之间的DBD，是ASFV感染猪的对照血清中和目标。

抗p54抗体最早在感染后8 d出现，并持续数周。

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

畜牧兽医学报 2023,54(8):3415-3423A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.08.026开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):非洲猪瘟病毒p 30蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定刘桃雪1,2,3,苏冰倩1,2,3,齐艳丽1,2,3,郭江涛1,2,3,刘忠虎1,2,3,褚贝贝1,2,3,王江1,2,3*,曾磊1,2,3*(1.河南农业大学动物医学院,郑州450046;2.河南农业大学,农业农村部动物生化与营养重点实验室,郑州450046;3.河南农业大学,河南省动物生长发育调控重点实验室,郑州450046)摘要:为制备非洲猪瘟病毒(A S F V )p30蛋白的单克隆抗体,以原核表达的重组p 30蛋白为免疫原免疫6~8周龄雌性B A L B /c 小鼠,3次免疫后分离小鼠脾细胞并将其与S P 2/0细胞进行融合,通过间接E L I S A 方法筛选㊂结果获得2株能稳定分泌抗A S F V p 30蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2G 10-2和6D 2-1㊂抗体效价分别为1ʒ12800和1ʒ3200㊂亚型鉴定结果显示,2株单克隆抗体的重链均属于I gG ,轻链均为κ型㊂W e s t e r n b l o t 和间接免疫荧光试验结果显示,2株单克隆抗体与p 30蛋白均具有良好的结合活性㊂通过W e s t e r n b l o t 检测,2株单克隆抗体能有效结合截短重组p 30蛋白的170~194位氨基酸,证明其抗原识别区域为第170~194位氨基酸㊂本研究制备了p 30蛋白的2株单克隆抗体,并对其抗原表位进行鉴定,为A S F V p 30蛋白结构和功能的研究及血清学诊断试剂的研发奠定基础㊂关键词:非洲猪瘟病毒;p30蛋白;原核表达;单克隆抗体;抗原表位中图分类号:S 852㊁659.1 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)08-3415-09收稿日期:2022-10-21基金项目:河南农业大学青年英才项目;河南省教学改革项目(2021S J G L X 351)作者简介:刘桃雪(1995-),女,河南商丘人,硕士生,主要从事动物生物化学与分子生物学研究,E -m a i l :1002691439@q q .c o m ;苏冰倩(1994-),女,河南安阳人,博士生,主要从事基础兽医学研究,E -m a i l :1126575812@q q .c o m ㊂刘桃雪和苏冰倩为同等贡献作者*通信作者:王江,主要从事动物生物化学与分子生物学研究,E -m a i l :w a n g j i a n g@h e n a u .e d u .c n ;曾磊,主要从事动物生物化学与分子生物学研究,E -m a i l :z e n gl e i 2021918@163.c o m P r e p a r a t i o n o f t h e M o n o c l o n a l A n t i b o d y a ga i n s t t h e A f r i c a n S w i n e F e v e r V i r u s p 30P r o t e i n a n d I d e n t i f i c a t i o n o f t h e A n t i g e n i c E p i t o pe L I U T a o x u e1,2,3,S U B i n g q i a n 1,2,3,Q I Y a n l i 1,2,3,G U O J i a n g t a o 1,2,3,L I U Z h o n g h u 1,2,3,C HU B e i b e i 1,2,3,WA N G J i a n g1,2,3*,Z E N G L e i 1,2,3*(1.C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e ,H e n a n A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ,Z h e n gz h o u 450046,C h i n a ;2.K e y L a b o r a t o r y o f A n i m a l B i o c h e m i s t r y a n d N u t r i t i o n ,H e n a n A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ,M i n i s t r y o f A g r i c u l t u r e a n d R u r a l A f f a i r s o f t h e P e o p l e 's R e p u b l i c o f Ch i n a ,Z h e n g z h o u 450046,C h i n a ;3.K e y L a b o r a t o r y o f A n i m a l G r o w t h a n d D e v e l o p m e n t o fH e n a n ,H e n a n A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ,Z h e n gz h o u 450046,C h i n a )A b s t r a c t :T h i s s t u d y i s a i m e d t o p r e p a r e m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s a ga i n s t A f r i c a n s w i n e f e v e r v i r u s (A S F V )p 30p r o t e i n .F i v e 6-8w e e k s f e m a l e B A L B /c m i c e w e r e i mm u n i z e d w i t h p r o k a r yo t i c r e c o m b i n a n t p 30p r o t e i n a s i mm u n o g e n .S pl e e n c e l l s w e r e i s o l a t e d a n d f u s e d w i t h S P 2/0c e l l s a f t e r 3t i m e s o f i mm u n i z a t i o n .T w o h yb r i d o m ac e l l l i n e s ,n a m ed 2G 10-2a n d 6D 2-1,w h i c h c o u l d畜牧兽医学报54卷s t a b l y s e c r e t e m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s a g a i n s t A S F V p30p r o t e i n w e r e o b t a i n e d.T h e a n t i b o d y t i t e r s w e r e1ʒ12800a n d1ʒ3200,r e s p e c t i v e l y.T h e r e s u l t s o f s u b t y p e i d e n t i f i c a t i o n s h o w e d t h a t t h e h e a v y c h a i n o f t h e t w o m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s b e l o n g e d t o I g G,a n d t h e l i g h t c h a i n w a sκt y p e.T h e r e s u l t s o f W e s t e r n b l o t a n d i n d i r e c t i mm u n o f l u o r e s c e n c e a s s a y s h o w e d t h a t b o t h m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s h a d g o o d b i n d i n g a c t i v i t y t o p30p r o t e i n.W e s t e r n b l o t a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e t w o m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s c o u l d e f f e c t i v e l y b i n d t h e170-194a m i n o a c i d s o f t h e r e c o m b i n a n t p30p r o t e i n,w h i c h p r o v e d t h a t t h e a n t i g e n i c r e c o g n i t i o n r e g i o n w a s t h e170-194 a m i n o a c i d s.I n t h i s s t u d y,t w o m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s a g a i n s t p30p r o t e i n w e r e p r e p a r e d a n d t h e i r e p i t o p e s w e r e i d e n t i f i e d,w h i c h l a i d a f o u n d a t i o n f o r t h e s t u d y o f t h e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f A S F V p30p r o t e i n a n d t h e d e v e l o p m e n t o f s e r o l o g i c a l d i a g n o s t i c r e a g e n t s.K e y w o r d s:A f r i c a n s w i n e f e v e r v i r u s;p30;p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n;m o n o c l o n a l a n t i b o d y;e p i t o p e of a n t ig e n*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r s:WA N G J i a n g,E-m a i l:w a n g j i a n g@h e n a u.e d u.c n;Z E N G L e i,E-m a i l: z e n g l e i2021918@163.c o m非洲猪瘟(A f r i c a n s w i n e f e v e r,A S F)是由非洲猪瘟病毒(A f r i c a n s w i n e f e v e r v i r u s,A S F V)感染家猪和各种野猪(如非洲野猪㊁欧洲野猪等)而引起的一种急性㊁出血性㊁烈性传染病㊂其特征是发病过程短,最急性和急性感染死亡率高达100%㊂非洲猪瘟的爆发,给全球养殖业造成了严重经济损失㊂虽然对非洲猪瘟已进行了广泛的研究,但是仍然缺乏有效的疫苗或抗病毒策略[1],目前主要是采取早期检测㊁严守卫生程序㊁大规模扑杀带毒家畜和野猪等措施将A S F控制在一定区域[2]㊂A S F V是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员,是具有双层膜结构,直径为200n m的大型双链D N A病毒,呈复杂的二十面体结构,其结构由内到外依次是内核㊁内核心壳㊁内膜㊁衣壳㊁囊膜,基因组全长为170~193k b,中央为保守区,两侧为可变区㊂A S F V基因组庞大且复杂,并具有双层囊膜,所以病毒耐受力强变异度高导致难以形成中和抗体[3]㊂A S F V基因组有150~167个开放阅读框,编码150~200种蛋白质,其中至少有54个结构蛋白[4],主要的结构蛋白有p30㊁p54㊁p72㊁p p220㊁p p62和C D2v蛋白等[5]㊂其中,A S F V的p72㊁p54和p30等结构蛋白均具有良好的抗原性和免疫原性[6-9],具备血清学诊断价值[10-11]㊂p30蛋白是由C P204L基因编码的重要的内囊膜蛋白,是A S F V的主要结构蛋白之一,也是最具免疫原性的蛋白之一㊂它能够介导A S F V对巨噬细胞的吸附和内化,干扰宿主细胞的转录与翻译,在感染后4h,能在细胞质中检测到[12],然后在整个感染周期中持续高水平表达,含量丰富且抗原性较高,是重要的病毒早期诊断靶标[13-14]㊂p30的表达表明病毒已经进入细胞并脱壳,病毒基因的早期表达已经开始[15]㊂p30蛋白在非洲猪瘟病毒粒子进入宿主细胞中发挥重要作用,抗p30蛋白的抗体对病毒内化有一定的抑制作用[6],这提示p30蛋白参与A S F V的内化过程,但具体作用机制尚不清楚[7,16]㊂鉴于p30是早期检测的优良靶标,本研究通过对A S F V p30蛋白氨基酸序列进行原核密码子优化,利用大肠杆菌表达系统获得可溶性重组p30蛋白,将其作为抗原免疫B A L B/c小鼠,制备了2株针对p30蛋白的单克隆抗体,均具有良好的特异性,对其抗原表位进行鉴定,并在预测的三级结构中进行标注㊂为A S F V p30蛋白结构和功能的研究及血清学诊断试剂的研发奠定基础㊂1材料与方法1.1材料1.1.1质粒㊁菌株N C B I(MK128995.1)中C h i n a/2018/A n h u i X C G Q-A S F V毒株C P204L基因序列由上海金斯瑞生物科技有限公司进行密码子优化并合成㊂表达菌株B L21(D E3)感受态细胞购自北京擎科生物科技有限公司㊁克隆菌株T o p10由本实验室制备及保存㊂1.1.2细胞及毒株骨髓瘤细胞(S P2/0)购自美国A T C C;猪伪狂犬病病毒(P R V)㊁猪繁殖与呼吸综合征病毒(P R R S V)㊁猪流行性腹泻病毒61438期刘桃雪等:非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定(P E D V)㊁猪圆环病毒(P C V2)㊁猪细小病毒(P P V)㊁猪急性腹泻综合征冠状病毒(S A D S-C o V)为本实验室保存㊂A S F V标准阳性血清购自中国兽医药品监察所㊂1.1.3动物雌性6~8周龄的B A L B/c小鼠购自郑州大学实验动物中心㊂1.1.4试剂考马斯亮蓝R-250购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;弗氏佐剂㊁H A T㊁H T 贮存液㊁融合剂P E G1450购自S i g m a公司; N i-N T A A g a r o s e购自Q I A G E N公司;A E C酶底物显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司;小鼠单克隆抗体亚类鉴定试剂盒购自S i n o B i o l o g i-c a l公司;M i l l i p o r e超滤管购自密理博中国有限公司;透析袋购自V A K E公司(U S A)㊂1.2方法1.2.1重组质粒构建及鉴定参考N C B I (MK128995.1)中C h i n a/2018/A n h u i X C G Q-A S-F V毒株C P204L基因序列,运用在线密码子优化工具G e n S m a r t T M C o d o n O p t i m i z a t i o n根据大肠杆菌的密码子偏好性调整p30基因的同义密码子进行密码子优化C P204L全基因㊂表达序列两端引入酶切位点N d eⅠ和H i n dⅢ及6ˑH i s标签,便于基因克隆和蛋白纯化,提交金斯瑞生物科技有限公司合成㊂将重组质粒命名为p E T30a-H i s-p30㊂使用限制性内切酶N d eⅠ和H i n dⅢ对合成的重组质粒p E T30a-H i s-p30进行双酶切鉴定,酶切鉴定正确后将重组质粒送至北京擎科生物科技有限公司进行测序㊂1.2.2重组p30蛋白诱导表达及可溶性分析将重组质粒转化至B L21感受态细胞,于37ħ恒温振荡摇床中振荡培养4h,至O D600n m=0.6左右,取1m L菌液作为未诱导对照,然后分别加入0.2㊁0.4㊁0.6㊁0.8和1.0mm o l㊃L-1I P T G,于37ħ及16ħ,180r㊃m i n-1条件下诱导表达10h,以确定诱导p30重组蛋白表达的最佳条件㊂富集菌体,超声波破碎后,4ħ㊁10000r㊃m i n-1离心10m i n分离上清和沉淀㊂S D S-P A G E凝胶电泳后经考马斯亮蓝染色检测蛋白可溶性㊂1.2.3表达蛋白的纯化及W e s t e r n b l o t鉴定以最佳诱导条件大量诱导表达p30重组蛋白,参照N i-N T A A g a r o s e操作技术手册对破碎后的上清进行纯化,通过S D S-P A G E电泳,考马斯亮蓝染色鉴定蛋白纯度㊂然后经B C A法测定p30蛋白浓度,将其定量为1m g㊃m L-1后分装保存于-80ħ备用㊂对纯化后的p30蛋白进行W e s t e r n b l o t鉴定,使用按1ʒ1000比例稀释的h i s标签抗体作为一抗, 1ʒ5000比例稀释的H R P标记的兔抗鼠的I g G抗体作为二抗,显色后,进行免疫印迹结果分析㊂1.2.4动物免疫取5只6~8周龄雌性B A L B/c小鼠(分别记为鼠1~5),将纯化的重组p30蛋白与弗氏完全佐剂1ʒ1混匀乳化,通过皮下多点注射方式免疫小鼠,免疫剂量为每只50μg㊂二次免疫㊁三次免疫用弗氏不完全佐剂乳化p30蛋白,每次免疫间隔2周,第3次免疫后1周自小鼠尾部采血,分离血清,用间接E L I S A方法测定血清抗体效价;融合前3d选择抗体效价最高的小鼠进行再次免疫,每只腹腔注射100μg重组蛋白㊂1.2.5杂交瘤细胞融合及筛选再次免疫3d 后将小鼠安乐死,分离脾细胞,在P E G1450作用下将脾细胞与对数生长期的S P2/0细胞按照7ʒ1的比例进行细胞融合㊂融合后将细胞铺至含有H A T选择培养基的96孔细胞板中培养㊂细胞融合7d后,取100μL培养上清用间接E L I S A方法进行检测㊂阳性杂交瘤细胞需进行2~3次亚克隆,直至抗体阳性率达100%㊂将稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株扩大培养并冻存于液氮中长期保存㊂间接E L I S A方法:将重组p30蛋白用1ˑP B S 稀释至2μg㊃m L-1包被酶标板,4ħ包被过夜,弃去包被液,100μL㊃孔-1P B S T,洗涤3次;用5%脱脂奶于37ħ封闭2h,P B S T洗涤3次;将杂交瘤细胞培养上清作为一抗,加入酶标板,同时设立阴㊁阳性对照,于37ħ反应1h,P B S T洗涤3次;加入100μL H R P标记的山羊抗小鼠I g G(1ʒ2500稀释)于37ħ反应1h,P B S T洗涤3次;每孔加入100μL T M B显色液于37ħ避光显色15m i n;加入100μL2m o l㊃L-1H2S O4终止反应㊂用酶标仪测定每孔O D450n m值,待检样品O D450n m/阴性样品O D450n m(S/N)>2.1判定为阳性㊂1.2.6腹水制备及纯化选取12周龄雌性B A L B/c小鼠,向小鼠腹腔内注射300μL弗氏不完全佐剂㊂7d后,向小鼠腹腔中注射3ˑ106~4ˑ106个杂交瘤细胞㊂5~7d后,小鼠的腹部变大,待触之有波动感㊁行动不敏捷㊁被毛粗糙时收集腹水,于4000r㊃m i n-1离心5m i n,取中间层液体㊂用饱和硫酸铵沉淀法对所获得腹水进行纯化,收集纯化后的目标抗体,标记清楚名称等信息并分装后于7143畜牧兽医学报54卷-80ħ保存㊂1.2.7单克隆抗体效价测定利用间接E L I S A 以纯化的p30蛋白为抗原,用P B S稀释至100n g㊃m L-1后加入96孔的E L I S A板内,用5%的B S A连续2倍倍比稀释的待检抗体作为一抗,用H R P标记的山羊抗小鼠I g G按照1ʒ5000的比例进行稀释作为二抗,T M B显色15m i n后终止,使用酶标仪,读取各样品孔O D450n m值㊂1.2.8单克隆抗体亚型鉴定包被亚型抗体:用P B S按比例稀释同型特异性抗体:I g G1 (1ʒ1000)㊁I g G2a(1ʒ2000)㊁I g G2b(1ʒ200)㊁I g G3 (1ʒ500)㊁I g M(1ʒ4000),之后分别加入96孔微孔板内,每个亚型重复3孔;以单克隆细胞培养上清作为一抗,同时设置阳性对照和阴性对照,用H R P标记的山羊抗小鼠I g G按照1ʒ5000的比例进行稀释作为二抗,T M B显色15m i n后终止,读取各样品的O D450n m值,并判定抗体亚型㊂1.2.9 W e s t e r n b l o t反应性鉴定将p c D N A3-H A及p c D N A3-p30-H A质粒转染H E K293T细胞,收取细胞内蛋白进行W e s t e r n b l o t验证,用H A 标签抗体按1ʒ1000比例稀释作为一抗,用H R P标记的山羊抗小鼠I g G按照1ʒ5000的比例进行稀释作为二抗,加入显色试剂,显色后,进行免疫印迹结果分析㊂1.2.10间接免疫荧光试验(I F A)反应性鉴定取转染p c D N A3-p30-H A质粒24h的H e L a细胞及其玻片(4m L㊃L-1多聚甲醛固定),以单克隆细胞培养上清作为一抗,用H R P标记的山羊抗小鼠I g G 按照1ʒ200的比例进行稀释作为二抗,并对细胞核进行染色,固定玻片后,将玻片置于在荧光显微镜下观察,使用E V O S F L细胞成像系统拍摄照片并保存㊂1.2.11单克隆抗体抗原表位鉴定利用N e t-S u r f P V e r.1.1(h t t p:ʊg p s.b i o c u c k o o.c n/o n l i n e_ f u l l.p h p)预测p30二级结构,对C P204L基因进行逐步截短(避开α螺旋和β折叠),连接至p G E X4T-3载体,将构建成功的截短质粒转化至B L21感受态,用I P T G诱导表达后,取1m L菌液,99ħ变性10m i n,制作蛋白样品㊂以纯化抗体作为一抗,进行W e s t e r n b l o t反应性鉴定,以确定其抗原表位区域㊂然后使用I-T A S S E R(h t t p s:ʊz h a n g g r o u p.o r g/I-T A S S E R/)在线预测A S F V p30蛋白三级结构,在P y MO L软件中标注出p30单克隆抗体所识别抗原表位区域㊂2结果2.1密码子优化密码子优化后,与原始序列比对发现碱基序列发生改变(以浅色字体表示,图1A),编码的氨基酸类型并未发生改变(图1B),所表达的p30蛋白的类型也未发生变化㊂2.2重组p30蛋白诱导表达及可溶性分析为了诱导重组p30蛋白表达及摸索其最适表达条件,将合成的原核表达质粒p E T30a-H i s-p30转入原核表达菌株B L21(D E3)中,分别采用不同浓度的I P T G和温度诱导蛋白表达,发现在30k u处出现目的蛋白,且I P T G浓度为0.4~0.6mm o l㊃L-1,温度为16ħ,10h诱导效果最佳(图2A㊁2B)㊂S D S-P A G E电泳分析其表达产物有少量以可溶性形式存在于上清中(图2C)㊂2.3原核表达蛋白的纯化及W e s t e r n b l o t鉴定为了进一步从上清中纯化重组蛋白p30,将未诱导全菌液㊁诱导全菌液㊁破碎后上清㊁破碎后沉淀㊁收集的流穿液㊁不同咪唑浓度的洗杂缓冲液及洗脱液进行蛋白制样,S D S-P A G E检测样品中蛋白纯化效果,结果发现,在100和250mm o l㊃L-1咪唑洗脱液样品中存在洗脱的目的蛋白p30,大小为30k u,且条带单一(图3A)㊂为了验证纯化后的目的蛋白,对表达产物进行W e s t e r n b l o t验证,一抗为鼠源的H i s标签抗体,二抗为H R P标记的山羊抗鼠的I g G 抗体,结果显示目的蛋白可与H i s标签一抗结合良好,条带与预期大小30k u一致(图3B),说明蛋白成功表达㊂2.4单克隆抗体W e s t e r n b l o t及I F A反应性鉴定为了鉴定获得的2株A S F V p30蛋白的单抗与真核表达p30蛋白是否具有良好的结合活性,将p c D N A3-H A及p c D N A3-p30-H A质粒转染H E K293T细胞,收取细胞内蛋白进行W e s t e r n b l o t验证,一抗为a n t i-HA和2G10-2㊁6D2-1,二抗为H R P标记的山羊抗鼠的I g G抗体,结果显示目的蛋白p c D N A3-p30-HA成功表达,获得的2株p30单克隆抗体均能与p30蛋白发生特异性反应,蛋白质大小约为30k u(图4A)㊂其次,I F A结果显示,2株单克隆抗体均与细胞内A S F V p30瞬时表达产物结合良好,在显微镜下可见绿色荧光,定位于细胞质中,空载体转染孔对照无荧光呈现(图4B)㊂81438期刘桃雪等:非洲猪瘟病毒p 30蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定A. O p t i m i z e d 为p 30基因密码子优化后序列, O r i g i n a l 为p 30基因原始序列,优化后碱基标记为浅色;B . O pt i m i z e d 为密码子优化后p 30蛋白的氨基酸序列, O r i gi n a l 为原始p 30蛋白氨基酸序列A."O p t i m i z e d "i s t h e o p t i m i z e d c o d o n s e q u e n c e o f t h e p 30g e n e ,"O r i g i n a l "i s t h e o r i g i n a l s e qu e n c e o f t h e p 30g e n e ,a n d t h e o p t i m i z e d b a s e m a r k e r i s l i g h t c o l o r e d ;B .'O p t i m i z e d 'i s t h e a m i n o a c i d s e q u e n c e o f t h e p 30p r o t e i n a f t e r c o d o n o pt i m i z a -t i o n ,a n d 'O r i g i n a l 'i s t h e o r i g i n a l p 30p r o t e i n a m i n o a c i d s e q u e n c e 图1 p 30基因优化前后序列比对F i g .1 S e q u e n c e a l i g n m e n t a f t e r p 30g e n e o pt i m i z a t i on A.37ħ诱导10h 重组蛋白表达情况;B .16ħ诱导10h 重组蛋白表达情况;C .重组p 30蛋白可溶性分析㊂M.蛋白质相对分子质量;1.p E T 30a -C P 204L 未诱导全菌液;2.p E T 30a -C P 204L 诱导全菌液;3.p E T 30a -C P 204L 诱导上清;4.pE T 28a -C P 204L 诱导沉淀A.I n d u c t i o n o f r e c o m b i n a n t p r o t e i n e x p r e s s i o n a t 37ħf o r 10h o u r s ;B .I n d u c t i o n o f r e c o m b i n a n t p r o t e i n e x pr e s s i o n a t 16ħf o r 10h o u r s ;C .S o l u b i l i t y a n a l y s i s o f r e c o m b i n a n t p 30p r o t e i n .M.P r o t e i n m a r k e r ;1.U n i n d u c e d a l l b a c t e r i a l i qu i d o f p E T 30a -C P 204L ;2.I n d u c e d a l l b a c t e r i a l i q u i d o f p E T 30a -C P 204L p r e c i p i t a t i o n ;3.I n d u c e d s u pe r n a t a n t of p E T 30a -C P 204L ;4.I n d u c e d p r e c i p i t a t i o n o f p E T 30a -C P 204L 图2 重组p 30蛋白的S D S -P A G E 检测F i g.2 S D S -P A G E d e t e c t i o n o f r e c o m b i n a n t p 30p r o t e i n 表明获得的2株A S F V p 30蛋白的单抗与真核表达p30蛋白均具有良好的特异性㊂2.5 单克隆抗体抗原表位鉴定A S F V p 30蛋白二级结构由无规卷曲㊁α螺旋㊁β9143畜牧兽医学报54卷A.重组蛋白纯化结果;B .W e s t e r n b l o t 鉴定纯化的蛋白A.P u r i f i c a t i o n r e s u l t s o f r e c o m b i n a n t p r o t e i n s ;B .W e s t e r n b l o t i d e n t i f i c a t i o n o f p u r i f i e d p r o t e i n s图3 重组p 30蛋白的纯化及鉴定F i g.3 P u r i f i c a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f r e c o m b i n a n t p 30p r o t e in A.W e s t e r n b l o t 鉴定p 30单克隆抗体的特异性;B .I F A 鉴定p 30单克隆抗体的特异性A.W e s t e r n b l o t i d e n t i f i c a t i o n o f t h e s p e c i f i c i t y o f p 30m o n o c l o n a l a n t i b o d y ;B .T h e s p e c i f i c i t y of I F A i d e n t i f i c a t i o n o f p 30m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s 图4 抗p 30蛋白单克隆抗体与p 30蛋白反应特性鉴定F ig .4 A n a l y s i s o f th e r e a c ti v i t y o f a n t i -p 30m o n o c l o n a l a n t i b o d y wi t h p 30p r o t e i n 折叠构成(图5A ),对p 30肽段进行截短,保证每段α螺旋㊁β折叠的完整,进一步W e s t e r n b l o t 分析,结果表明A S F V -P 30识别的氨基酸序列范围是C 端170~194a a 共25个氨基酸,氨基酸序列为:I Y G T -P L K E E E K E V V R L MV I K L L K K K (图5B )㊂在p 30蛋白三级结构可视化的基础上,标注出p 30单克隆抗体识别抗原表位区域170~194a a (图5C ,以红色区域表示)㊂3 讨论非洲猪瘟病毒作为非洲猪瘟病毒科唯一成员,碱基数多达17万~19万个,基因组庞大,能够编码多种蛋白质,包括结构蛋白和免疫调节蛋白,其结构和免疫逃逸机制复杂,能够逃避宿主免疫细胞的清除,但其与宿主细胞的互作机制尚不清晰㊂针对非洲猪瘟的各种疫苗策略已经进行了研究,早期侧重于以抗原为基础的方法,旨在诱导中和血清学反应,以C D 2v 为抗原不能引起机体足够的免疫保护,此后,许多亚单位疫苗的方法都集中在p 54和p 30,数据结果显示p 54和p 30同时免疫机体可延缓A S F V 临床症状,因此深入对A S F V 蛋白质组和单个蛋白质功能的研究,对合理设计靶向疫苗方法具有重要意义[17-19]㊂现阶段对非洲猪瘟的控制主要依靠传统的措施:动物一旦确诊感染,立刻采取全扑杀以防范A S -F V 的进一步扩散和蔓延㊂因此,快速准确的诊断识别A S F 是该病流行病学管理的关键㊂目前主要将p 72㊁p 54㊁p30蛋白作为诊断抗原用于A S F V 感02438期刘桃雪等:非洲猪瘟病毒p 30蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定A.A S F V p 30蛋白二级结构预测结果;B .A S F V p 30蛋白截短示意图及抗原表位鉴定(M.蛋白分子量M a r k e r ;1.p G E X 4T -p 30;2.p G E X 4T -p 30-Δ1;3.p G E X 4T -p 30-Δ2;4.p G E X 4T -p 30-Δ3;5.p G E X 4T -p 30-Δ4;6.p G E X 4T -p30-Δ5;7.p G E X 4T -p30-Δ6);C .A S F V p 30蛋白的三级结构A P r e d i c t i o n r e s u l t s o f t h e s e c o n d a r y s t r u c t u r e o f A S F V p 30p r o t e i n ;B .A S F V p 30p r o t e i n t r u n c a t i o n s c h e m a t i c a n d a n t i ge n e p i t o p e i d e n t if i c a t i o n (M.P r o t e i n m a r k e r ;1.p G E X 4T -p 30;2.p G E X 4T -p 30-Δ1;3.p G E X 4T -p 30-Δ2;4.p G E X 4T -p30-Δ3;5.p G E X 4T -p 30-Δ4;6.p G E X 4T -p 30-Δ5;7.p G E X 4T -p 30-Δ6);C .T h e t e r t i a r y st r u c t u r e o f A S F V p 30p r o t e i n 图5 单克隆抗体2G 10-2和6D 2-1抗原表位鉴定F i g .5 E p i t o pe s i d e n t if i c a t i o n o f m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s 2G 10-2a n d 6D 2-1染时的血清学诊断㊂有研究表明,与p 54蛋白相比,可能由于p 30拥有构象表位,在E L I S A 上的灵敏度更高[20]㊂且p 30蛋白在A S F V 感染后2~4h 即可表达,能诱导中和抗体的产生,在整个感染期都能检测到,更适用于早期诊断㊂因此本研究通过原核表达系统,获得了纯度较高的可溶性p 30蛋白,建立了获得可溶性p 30蛋白的体系,且蛋白纯度高,经鉴定具有良好的反应原性,可用于间接E L I S A 来检测A S F V 的感染㊂进一步利用p 30蛋白免疫小鼠,制备了高特异性的p 30单克隆抗体,可应用于阻断E L I S A 方法的建立,这为血清学检测方法的进一步发展提供了材料㊂研究病毒蛋白的特性及评估p 30蛋白的抗原表位特征,尤其是保守表位特征,有助于研究人员更好理解病毒的生物特性和宿主的免疫反应机制,还能为发展和改进A S F 诊断和监测的血清学检测方法以及疫苗的研发提供重要信息[21-22]㊂P e t r o v a n等[23]的研究初步鉴定了p 30的61~93位氨基酸之间的表位,该区域也被A S F V 感染猪的血清识别,提示该区域是具有重要免疫功能的表位[24]㊂同时1243畜牧兽医学报54卷也鉴定了p30蛋白C端部分中的一个大多肽片段(120~204a a)与高度柔性和潜在无序倾向区域(91~143a a)部分重叠可能是p30蛋白的抗原表位区域,该结果与本研究的试验结果相似㊂本研究进一步缩小了p30蛋白的抗原表位分布范围㊂目前已有研究报道A S F V病毒颗粒[25]㊁p54蛋白[26]和p72[8]蛋白的结构解析,但是没有关于p30蛋白结构解析的报道,故本研究通过I-T A S S E R软件在线预测A S F V p30蛋白三级结构,并标注出p30单克隆抗体识别的抗原表位区域,为A S F V p30蛋白结构的研究奠定了基础㊂4结论本研究制备了2株非洲猪瘟病毒C h i n a/2018/ A n h u i X C G Q-A S F V毒株p30蛋白的单克隆抗体,同时利用蛋白截短表达的方式鉴定了170I~K194是其识别的抗原表位区域,进一步通过I-T A S S E R软件在线预测A S F V p30蛋白三级结构,并标注出p30单克隆抗体识别的抗原表位区域,丰富了p30蛋白的抗原表位信息,为A S F V p30蛋白结构的研究及血清学检测方法的进一步发展奠定了基础㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] A L E J O A,MA T AMO R O S T,G U E R R A M,e t a l.A p r o t e o m i c a t l a s o f t h e a f r i c a n s w i n e f e v e r v i r u sp a r t i c l e[J].J V i r o l,2018,92(23):01293-18.[2] SÁN C H E Z E G,PÉR E Z-NÚÑE Z D,R E V I L L A Y.D e v e l o p m e n t o f v a c c i n e s a g a i n s t A f r i c a n s w i n e f e v e rv i r u s[J].V i r u s R e s,2019,265:150-155.[3] A R A B Y A N E,HA K O B Y A N A,K O T S I N Y A N A,e t a l.G e n i s t e i n i n h i b i t s Af r i c a n s w i n e f e v e r v i r u sr e p l i c a t i o n i n v i t r o b y d i s r u p t i n g v i r a l D N A s y n t h e s i s[J].A n t i v i r a l R e s,2018,156:128-137. [4] G A U D R E A U L T N N,MA D D E N D W,W I L S O N WC,e t a l.A f r i c a n s w i n e f e v e r v i r u s:a n e m e r g i n g D N Aa rb o v i r u s[J].F r o n t V e t Sc i,2020,7:215.[5] D I X O N L K,C HA P MA N D A G,N E T H E R T O N CL,e t a l.A f r i c a n s w i n e f e v e r v i r u s r e p l i c a t i o n a n dg e n o m i c s[J].V i r u s R e s,2013,173(1):3-14.[6] N E I L A N J G,Z S A K L,L U Z,e t a l.N e u t r a l i z i n ga n t ib o d i e s t o A f r ic a n s w i n e f e v e r v i r u s p r o t e i n s p30,p54,a n d p72a r e n o t s u f f i c i e n t f o r a n t i b o d y-m e d i a t e dp r o t e c t i o n[J].V i r o l o g y,2004,319(2):337-342.[7] WU P,L OW E A D,R O D RÍG U E Z Y Y,e t a l.A n t i g e n i c r e g i o n s o f A f r i c a n s w i n e f e v e r v i r u sp h o s p h o p r o t e i n P30[J].T r a n s b o u n d E m e r g D i s,2020,67(5):1942-1953.[8] L I U Q,MA B T,Q I A N N C,e t a l.S t r u c t u r e o f t h eA f r i c a n s w i n e f e v e r v i r u s m a j o r c a p s i d p r o t e i n p72[J].C e l l R e s,2019,29(11):953-955.[9] P E T R O V A N V,MU R G I A M V,WU P,e t a l.E p i t o p e m a p p i n g o f A f r i c a n s w i n e f e v e r v i r u s(A S F V)s t r u c t u r a l p r o t e i n,p54[J].V i r u s R e s,2020,279:197871.[10] C U B I L L O S C,GÓM E Z-S E B A S T I A N S,MO R E N ON,e t a l.A f r i c a n s w i n e f e v e r v i r u s s e r o d i a g n o s i s:Ag e n e r a l r e v i e w w i t h a f o c u s o n t h e a n a l y s e s o f A f r i c a ns e r u m s a m p l e s[J].V i r u s R e s,2013,173(1):159-167.[11] G A L L A R D O C,S O L E R A,N I E T O R,e t a l.C o m p a r a t i v e e v a l u a t i o n o f n o v e l A f r i c a n s w i n e f e v e rv i r u s(A S F)a n t i b o d y d e t e c t i o n t e c h n i q u e s d e r i v e df r o m s p e c i f i c A S F v i r a lg e n o t y p e s w i th t h e O I Ei n t e r n a t i o n a l l y p r e s c r i b e d s e r o l o g i c a l t e s t s[J].V e tM i c r o b i o l,2013,162(1):32-43.[12] G O L D I N G J P,G O A T L E Y L,G O O D B O U R N S,e ta l.S e n s i t i v i t y o f A f r i c a n s w i n e f e v e r v i r u s t o t y p e Ii n t e r f e r o n i s l i n k e d t o g e n e s w i t h i n m u l t i g e n e f a m i l i e s360a n d505[J].V i r o l o g y,2016,493:154-161.[13] K A Z A K O V A A S,I M A T D I N O V I R,D U B R O V S K A Y AO A,e t a l.R e c o m b i n a n t p r o t e i n p30f o r s e r o l o g i c a ld i a g n o s i s o f a f r i c a n s w i nef e v e r b y i mm u n o b l o t t i n ga s s a y[J].T r a n sb o u n d E m e r g D i s,2017,64(5):1479-1492.[14] L I T H G OW P,T A K AMA T S U H,W E R L I N G D,e ta l.C o r r e l a t i o n o f c e l l s u r f a c e m a r k e r e x p r e s s i o n w i t hA f r i c a n s w i n e f e v e r v i r u s i n f e c t i o n[J].V e tM i c r o b i o l,2014,168(2-4):413-419. [15]J I A N,O U Y W,P E J S A K Z,e t a l.R o l e s o f A f r i c a ns w i n e f e v e r v i r u s s t r u c t u r a l p r o t e i n s i n v i r a l i n f e c t i o n[J].J V e t R e s,2017,61(2):135-143. [16] A N D RÉS G.A f r i c a n s w i n e f e v e r v i r u s g e t su n d r e s s e d:n e w i n s i g h t s o n t h e e n t r y p a t h w a y[J].JV i r o l,2017,91(4):e01906-16.[17] G A U D R E A U L T N N,R I C H T J A.S u b u n i t v a c c i n ea p p r o a c h e s f o r a f r i c a n s w i n e f e v e r v i r u s[J].V a c c i n e s(B a s e l),2019,7(2):56.[18] R U I Z-G O N Z A L V O F,R O D RÍG U E Z F,E S C R I B A N OJ M.F u n c t i o n a l a n d i m m u n o l o g i c a l p r o p e r t i e s o f t h eb ac u l o v i r u s-e x p r e s s ed he m a g g l u t i n i n of A f r i c a n s w i n ef e v e r v i r u s[J].V i r o l og y,1996,218(1):285-289.[19] GÓM E Z-P U E R T A S P,R O D RÍG U E Z F,O V I E D O J22438期刘桃雪等:非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定M,e t a l.T h e A f r i c a n s w i n e f e v e r v i r u s p r o t e i n s p54a n d p30a r e i n v o l v e d i n t w o d i s t i n c t s t e p s o f v i r u sa t t a c h m e n t a n db o t hc o n t r i b u t e t o t h e a n t i b od y-m e d i a t e d p r o t e c t i v e i mm u n e r e s p o n s e[J].V i r o l o g y,1998,243(2):461-471.[20] O V I E D O J M,R O D R I G U E Z F,GÓM E Z-P U E R T A S P,e t a l.H i g h l e v e l e x p r e s s i o n o f t h em a j o r a n t i g e n i c A f r i c a n s w i n e f e v e r v i r u s p r o t e i n s p54a n d p30i nb ac u l o v i r u s a nd t he i r p o t e n t i a l u s e a sd i a g n o s t i c re a g e n t s[J].J V i r o l M e t h o d s,1997,64(1):27-35.[21]孙娟,王愉涵,刘艳,等.抗原表位鉴定方法的研究进展[J].国外医学(医学地理分册),2017,38(3):291-295.S U N J,W A N G Y H,L I U Y,e t a l.R e s e a r c h a d v a n c e si n t h e i d e n t i f i c a t i o n m e t h o d s o f a n t i g e n e p i t o p e[J].F o r e i g n M e d i c a l S c i e n c e s(S e c t i o n o f M e d g e o g r a p h y),2017,38(3):291-295.(i n C h i n e s e)[22]陈孝军,马俊,陈熊男,等.1株非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体识别的B细胞抗原表位的鉴定[J].畜牧兽医学报,2022,53(7):2239-2251.C H E N X J,MA J,C H E N X N,e t a l.I d e n t i f i c a t i o n o f t h e B c e l l e p i t o p e s r e c o g n i z e d b y am o n o c l o n a l a n t i b o d y a g a i n s t t h e p30p r o t e i n o fA f r i c a n s w i n e f e v e r v i r u s[J].A c t a V e t e r i n a r i a e tZ o o t e c h n i c a S i n i c a,2022,53(7):2239-2251.(i n C h i n e s e)[23] P E T R O V A N V,Y U A N F F,L I Y H,e t a l.D e v e l o p m e n t a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f m o n o c l o n a la n t ib o d i e s a g a i n s t p30p r o t e i n o f A f r ic a n s w i n e f e v e rv i r u s[J].V i r u s R e s,2019,269:197632. [24]吕璐,钟秋萍,于婉琪,等.非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备及鉴定[J].中国动物传染病学报,2022,30(3):158-165.L V L,Z HO N G Q P,Y U W Q,e t a l.I mm u n o l o g i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f m o n o c l o n a la n t ib o d i e s a g a i n s t A f r ic a n s w i n e f e v e r v i r u s p30[J].C h i n e s e J o u r n a l o f A n i m a l I n f e c t i o u sD i s e a s e s,2022,30(3):158-165.(i n C h i n e s e)[25] WA N G N,Z HA O D M,WA N G J L,e t a l.A r c h i t e c t u r e o f A f r i c a n s w i n e f e v e r v i r u s a n di m p l i c a t i o n s f o r v i r a l a s s e m b l y[J].S c i e n c e,2019,366(6465):640-644.[26]齐艳丽,刘桃雪,于海深,等.非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定[J].畜牧兽医学报,2023,54(1):281-292.Q I Y L,L I U T X,Y U H S,e t a l.P r e p a r a t i o n o f t h em o n o c l o n a l a n t i b o d y a g a i n s t t h e A f r i c a n s w i n e f e v e rv i r u s p54p r o t e i n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f t h e a n t i g e n i ce p i t o p e[J].A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c a,2023,54(1):281-292.(i n C h i n e s e)(编辑白永平)3243。

猪圆环病毒3型衣壳蛋白(Cap)的原核表达及免疫评价

猪圆环病毒3型衣壳蛋白（Cap）的原核表达及免疫评价猪圆环病毒3型（Porcine circovirus type 3，PCV3）是一种新型的猪源病毒，最初于2016年在美国被鉴定出来。

与其他圆环病毒相比，PCV3具有较高的遗传变异性，并且能够感染多种生物组织和细胞类型，引起多种疾病。

作为一种病毒，PCV3具有特殊的复制和感染特性。

PCV3的基因组长度为1.7千碱基对（kbp），包含两个开放阅读框（open reading frame，ORF），编码了9个蛋白质。

其中，衣壳蛋白（Cap）是PCV3病毒颗粒的主要组成成分之一，也是潜在的疫苗候选抗原。

为了理解PCV3 Cap的功能和免疫学特性，研究人员进行了原核表达及免疫评价的实验研究。

首先，研究人员从PCV3感染的猪组织中提取了PCV3基因组DNA。

随后，他们通过特定引物和PCR方法，扩增出PCV3 Cap基因。

将PCR产物纯化后，将其连接到原核表达载体中，构建了原核表达载体。

之后，将重组质粒转入大肠杆菌宿主，通过特定的培养基和培养条件，诱导PCV3 Cap蛋白在大肠杆菌中高效表达。

为了评价PCV3 Cap蛋白的免疫学特性，研究人员进一步对表达的蛋白进行了纯化和鉴定。

首先，他们采用亲和层析技术，纯化了在大肠杆菌中表达的重组蛋白。

通过蛋白浓缩和凝胶电泳技术，研究人员确认纯化的蛋白得到了高效且纯度较高的表达。

接下来，他们通过Western blotting和间接免疫荧光技术，验证了纯化的蛋白的免疫反应性。

结果表明，PCV3 Cap蛋白与PCV3感染的病毒颗粒中的Cap蛋白具有较高的相似性，能够诱导机体产生强烈的免疫反应。

为了深入了解PCV3 Cap蛋白的免疫学特性，研究人员进一步对其免疫原性进行了评价。

他们以小鼠为实验动物，注射纯化的PCV3 Cap蛋白，观察小鼠的免疫反应。

实验结果显示，注射PCV3 Cap蛋白后，小鼠产生了特异性的抗体反应，并且能够与PCV3感染的病毒颗粒结合。

非洲猪瘟病毒的形态结构特征

非洲猪瘟病毒的形态结构特征谢春芳1,2，于瑞嵩1,2，董世娟1,2，陈冰清1,2(1.上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106；2.上海市农业遗传育种重点实验室动物遗传工程实验室，上海 201106)非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)是一种双链大DNA 病毒，目前是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)唯一的成员。

非洲猪瘟病毒粒子直径为250 nm ～ 300 nm，基因组长度为170 kb ～194 kb；细胞内ASFV 粒子直径约200 nm，病毒基因组与核蛋白聚集成病毒核心，核心外包裹有蛋白核壳，核壳外包裹着脂质内膜，脂质内膜外是二十面体蛋白衣壳，最后通过出胞获得病毒外膜，成为一个成熟完整的ASFV 粒子[1-5](图1)。

ASFV 在环境中非常稳定，在4 ℃血液中可保存一年以上，在肉制品中可保存数周。

ASFV 可在蜱类和猪中高效复制，并在两者之间循环传播[6]。

ASFV 通过脱壳侵入细胞，病毒脱壳需要酸性环境破坏病毒的外膜和蛋白衣壳。

在细胞的内泡小体内，病毒的外膜和二十面体蛋白衣壳被破坏，暴露出病毒内膜，病毒内膜与细胞膜融合，病毒核质得以进入细胞质内，感染宿主细胞。

ASFV 感染细胞后，在细胞质内质网附近的“病毒工厂(Viral Factories，VFs)”中进行复制[7]。

在早期核内复制阶段，ASFV 会导致细胞核膜破裂并募集细胞S 期特异性翻译因子——真核翻译起始因子4E/4G(eukaryotic translation Initiation Factor 4E/4G，eIF4E/4G)和真核翻译起始因子4E-结合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E-Binding Protein 1，4E-BP1)到病毒工厂，以增强病毒复制能力，然后在细胞质内进行病毒DNA 复制和包装[8-10]。

非洲猪瘟病毒的不同病原学检测方法比较

收稿日期：2021-12-23作者简介：付玉亮（1969-），男，汉族，山东兰陵人，高级畜牧师，主要从事畜牧兽医工作DOI：10.16174/j.issn.1673-4645.2022.02.023非洲猪瘟病毒的不同病原学检测方法比较付玉亮(山东省临沂市兰陵县动物疫病预防控制中心,山东临沂277700)摘要:非洲猪瘟(African swine fever,ASF )是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV )感染导致的猪高死亡率的传染病,最早起源于非洲,是最复杂的猪传染性疾病之一。

非洲猪瘟自首次报道至今已有1个世纪,但在没有疫苗和没有有效治疗方法的情况下,非洲猪瘟病毒的防控仍是一项巨大的挑战。

当前,非洲猪瘟病毒已在我国“定殖”,该病毒的检测已经成为养猪企业的一项常规工作。

实时荧光定量PCR 是检测非洲猪瘟病毒最常用的方法,一些新型的核酸检测技术也被开发用于病毒检测,例如环介导等温扩增法、荧光重组酶介导等温扩增法等,均具有较好的特异性和灵敏度。

本文阐述了非洲猪瘟的流行现状及不同病原学检测方法,对不同检测方法进行简单的比较,以期为非洲猪瘟病毒的检测提供参考。

关键词:非洲猪瘟;非洲猪瘟病毒;病原学检测;方法比较中图分类号:S828;S852.65文献标识码:B文章编号:1673-4645(2022)02-0095-04开放科学(资源服务)标识码(OSID ),扫一扫,了解文章更多内容非洲猪瘟最早起源于非洲，是世界动物卫生组织要求必须上报的传染病之一。

自1921年以来，非洲猪瘟病毒在撒哈拉以南非洲国家和撒丁岛肆虐，该病的流行对养猪业和社会经济造成巨大影响。

后来疫情陆续蔓延至欧洲、南美洲、欧亚交界等地，后又传入俄罗斯、乌克兰、波兰、意大利等国家，2014年立陶宛和波兰报道非洲猪瘟感染野猪的病例。

2017年非洲猪瘟病毒在罗马尼亚和捷克共和国流行，2018年在保加利亚、匈牙利、比利时流行，同时，2018年8月我国也发生非洲猪瘟疫情。

猪瘟病毒NS3蛋白在真核细胞中的表达与定位

猪瘟病毒NS3蛋白在真核细胞中的表达与定位宋江伟;田宏;吴锦艳;陈妍;尚佑军;刘湘涛【期刊名称】《西北农业学报》【年(卷),期】2014(023)008【摘要】为研究与猪瘟病毒NS3蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,采用PCR方法获得NS3基因,将其定向克隆至pCMV Myc真核表达载体,经酶切鉴定及序列测定分析,将鉴定为阳性重组表达质粒命名为pMycNS3.采用脂质体介导法将pMyc-NS3转染至PK-15细胞和293T细胞,Western blot和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达.结果表明,成功构建重组表达质粒pMyc-NS3,Western blot表明,NS3蛋白在PK-15细胞和293T细胞中均得到表达,NS3在PK-15和293T细胞质中呈弥散性分布.说明,成功构建的猪瘟病毒NS3基因与Myc融合表达质粒,为验证NS3蛋白与宿主细胞蛋白相互作用奠定基础.【总页数】4页(P16-19)【作者】宋江伟;田宏;吴锦艳;陈妍;尚佑军;刘湘涛【作者单位】中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点实验室/国家口蹄疫参考实验室,兰州730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点实验室/国家口蹄疫参考实验室,兰州730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点实验室/国家口蹄疫参考实验室,兰州730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点实验室/国家口蹄疫参考实验室,兰州730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点实验室/国家口蹄疫参考实验室,兰州730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点实验室/国家口蹄疫参考实验室,兰州730046【正文语种】中文【中图分类】S855.3【相关文献】1.丙型肝炎病毒NS3区7个抗原表位融合基因载体的构建及在真核细胞的表达[J], 杨素霞;李煜;杨梅英;高江平;洪宝发2.猪瘟病毒石门株NS3蛋白的原核表达及其抗体检测间接ELISA的建立 [J], 陆欣然;华思红;樊钰莹;白文顺;杜敏;孙永科;杨玉艾3.猪瘟病毒E2基因在真核细胞中表达及抗E2蛋白单克隆抗体的制备 [J], 许信刚;胡建和;张彦明;张海棠;陈永耀4.猪瘟病毒NS3丝氨酸蛋白酶功能区基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达 [J], 周鹏程;陈建国;丁明孝5.猪瘟病毒NS3蛋白ATPase/RNA解旋酶功能区的表达与纯化 [J], 郑杰;宁宜宝因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

猪细环病毒1型衣壳蛋白的原核表达及鉴定

猪细环病毒1型衣壳蛋白的原核表达及鉴定王俊;陈丙生;杨倩;于红欣;刘芊麟;周双海【摘要】为了制备猪细环病毒1型(TTSuV1)抗体,并为建立TTSuV1免疫学检测方法奠定基础.用PCR技术扩增TTSuV1衣壳蛋白(Cap)基因片段,与载体pET-32a定向连接,构建重组原核表达质粒pET-32a-Cap,转化人大肠杆菌Rosetta (DE3),诱导重组阳性菌表达,SDS-PAGE研究融合蛋白表达情况.对重组融合蛋白进行纯化、复性后,免疫BALB/c小鼠4次来制备鼠抗TTSuV1-Cap蛋白抗体.分别以鼠抗TTSuV1-Cap蛋白抗体和TTSuV1猪阳性血清为一抗,对重组融合蛋白进行免疫印迹检测.结果显示,成功表达了TTSuV1 Cap截短体融合蛋白,表达产物以包涵体形式存在,重组蛋白可与鼠抗TTSuV1-Cap蛋白抗体及TTSuV1猪阳性血清发生特异性结合,表明表达的TTSuV1-Cap融合蛋白具有良好的免疫原性和反应原性.【期刊名称】《北京农学院学报》【年(卷),期】2015(030)004【总页数】5页(P78-81,93)【关键词】猪细环病毒1型;衣壳蛋白;原核表达【作者】王俊;陈丙生;杨倩;于红欣;刘芊麟;周双海【作者单位】北京农学院动物科学技术学院,北京102206;北京农学院动物科学技术学院,北京102206;北京农学院动物科学技术学院,北京102206;北京农学院动物科学技术学院,北京102206;北京农学院动物科学技术学院,北京102206;北京农学院动物科学技术学院,北京102206【正文语种】中文【中图分类】S852.659.2细环病毒(Torque teno virus，TTV)是日本学者从非甲—非戊型肝炎患者体内首次检出[1]，在人群中的流行比较普遍，可能会影响某些疾病的发展或结果[2]。

TTV不但感染人，还可感染多种动物[3]。

猪细环病毒(Torque teno sus virus，TTSuV)也在猪群中普遍流行[4-5]。

猪瘟病毒蛋白与功能

• 用随机肽库技术在Erns鉴定了中和性抗原表位，分别位于384386及322-323位、380-386 位氨基酸区域（Zhang et al, 2006）。
诱导免疫应答相关蛋白-非结构蛋白
• 非结构蛋白NS2-3能够诱导抗体的产生，具有CSFV特异性B细胞表位。 • NS2-3还存在T细胞表位 1446KHKVRNEVMVHWFDD1460（Armengol, et al, 2002）。 • 在NS4A上鉴定出的一个T细胞表位（2276ENALLVALF2284）（Armengol, et al, 2002）。
NS4A
NS4B NS5A NS5B
参与病毒穿入和吸附的蛋白及其细胞受体
• 猪瘟病毒感染细胞是通过外膜糖蛋白Erns和E2与细胞表面蛋白的相互作用介导的。 • Erns与细胞表面受体硫酸乙酰肝素（HS）作用，帮助病毒吸附细胞表面（Hulst et al, 2009）。 • 猪瘟病毒的E2受体未见报道，我们小组初步证明宿主细胞蛋白CDx与E2蛋白之间存在相互作用，可能是E2的一个受体。 • CSFV 病毒蛋白受体将是CSFV研究的一个热点。
• 糖基化蛋白Erns和E1是否对CSFV的细胞嗜性有影响有待研究。
病毒毒力相关蛋白-结构蛋白
糖基化位点269N突变成丙氨酸A或谷氨酰胺Q，毒力减弱(Sainz et al, 2008) Erns
268 494
糖基化位点594N突变成A，毒力减弱(Sainz et al, 2009)
E1
495 689
问题和展望
• CSFV与宿主相互作用的机制仍有待阐清，特别是在对宿主细胞的调控上，CSFV是如何通过自身蛋白与宿主蛋白发生相互作用，从而帮助病毒在细胞内进行复制和增殖。 • 目前对于CSFV细胞受体方面的研究较少，CSFV 在细胞中的复制和增殖需要多个受体的参与，进一步鉴定CSFV的受体将为深入了解病毒提供帮助。 • 通过研究CSFV与宿主细胞相互作用蛋白和通路，能为进一步研究CSFV致病机理提供线索，为猪瘟的防控寻找到新的途径。

非洲猪瘟病毒p72蛋白的真核表达及反应原性鉴定

非洲猪瘟病毒p72蛋白的真核表达及反应原性鉴定梁云浩;曹琛福;叶奕优;花群义;张彩虹;曾少灵;陶虹;廖立珊;刘建利【摘要】将p72基因克隆到载体pFast Bac/ NT-TOPO上,转化大肠埃希菌DH5α.将获得的重组载体pFastBac/NT-TOPO-p72,转化大肠埃希菌DH10 Bac,获得重组杆状病毒质粒bacmid-p72.通过脂质体介导,将bacmid-p72转染sf9细胞,获得重组杆状病毒.用重组杆状病毒感染正常生长的sf9细胞,72 h后收集细胞,超声破碎后取上清进行SDS-PAGE和Western blot分析.结果显示,重组蛋白大小约78 ku,且重组蛋白可以与非洲猪瘟标准阳性血清反应.说明表达的重组蛋白为可溶性的,并具有良好的反应原性.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2015(036)006【总页数】5页(P29-33)【关键词】非洲猪瘟病毒;p72蛋白;脂质体介导;重组杆状病毒【作者】梁云浩;曹琛福;叶奕优;花群义;张彩虹;曾少灵;陶虹;廖立珊;刘建利【作者单位】深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心,广东深圳518045;暨南大学广东省分子免疫与抗体工程重点实验室,广东广州510632;深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心,广东深圳518045;深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心,广东深圳518045;深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心,广东深圳518045;深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心,广东深圳518045;深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心,广东深圳518045;深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心,广东深圳518045;深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心,广东深圳518045;深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心,广东深圳518045【正文语种】中文【中图分类】S852.651非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是一种猪的急性传染病，因猪感染非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起。