MTT实验操作步骤
MTT实验操作步骤
实验操作规程MTT实验操作步骤（一）MTT溶液的配置：市面上MTT的规格一般为100mg、250mg和1g的包装。
通常MTT配成的终浓度为5mg/ml，采用PBS或生理盐水做溶剂。
对于100mg的小包装，MTT放置在小管中，直接向管中加入0.5-1.0ml PBS，反复吹打若干次后将其转移至50ml离心管中。
重复2-3次上述操作，直至小管中的没有MTT残留，之后向50ml离心管中加入PBS直至离心管内的终体积为20ml。
将MTT溶液完全混匀后，用水相的0.22μm滤膜过滤，分装避光保存于-20℃。
分装的体积根据实验需求进行操作，如以每孔需要加入10μl计算，一般96孔板约需要1ml，因此分装时可每管分装1ml，如此可避免MTT溶液的反复冻融。
（二）化合物配制及稀释：一般化合物使用DMSO溶解配制成浓度为10mM的母液储存于-20℃。
稀释时从-20℃取出所需化合物常温融化，用1640（DMEM）基础培养基稀释化合物浓度至200μM(例如，取4μL浓度为10mM的母液溶于盛有196μL的1640基础培养基的1.5mL的EP管中，使其终浓度为200μM)。
铺板：96孔板的外周孔(绿色所示)由于存在边缘效应一般不进行实验操作，因此作为Blank 组，Blank组每孔加入120μL的1640（DMEM）基础培养基；剩余的中间60孔以实验具体要求分为control组(黄色所示)、阳性对照组(粉色所示)和实验组(蓝色所示)，control组中每孔加入50μL的1640（DMEM）基础培养基，阳性对照组每孔加入50μL的浓度为200μM的阳性药物，实验组每孔加入50μL的浓度为200μM的实验药物，每种化合物及阳性药物均做3个复孔，加完之后将96孔板放置在37℃含5% CO2的培养箱中进行预温。
（三）细胞处理：取对数生长期且已覆盖培养瓶底部面积80~90%的细胞，倒掉培养基，每瓶加入37℃预热的PBS清洗1次，倒掉PBS，加入1ml胰酶，放置37℃含5%CO2的培养箱中消化3min后取出培养瓶，向培养瓶中加入2ml预热的1640（DMEM）完全培养基终止消化反应，并用吸管反复吹打细胞混匀，将其转移至15ml离心管中使用1500rpm离心3min。
MTT法测定实验过程及注意事项
MTT法测定实验过程及注意事项小鼠淋巴细胞增殖及白介素2活性测定1. 动物分组与给药：略2. 药品及试剂：RPMI-1640完全培养液：含10%胎牛血清的1640基础液RPMI-1640基础液：10.4g粉末加入1000ml超纯水中，加2gNaHCO3，加入双抗储液，调pH到7.2左右，过滤除菌，盐水瓶分装，封口膜封口，4℃保存（需较长时间保存则放入-20℃；若4℃保存则放置时间超过一周需补加L-谷氨酰胺）双抗储液：青霉素为80万单位/瓶，用注射器加4ml超纯水；链霉素为100万单位/瓶，用注射器加5ml超纯水，即每毫升各为20万单位。
使用时各取0.5ml加入1L培养基中过滤除菌即可。
（青链霉素的工作浓度为100单位/ml）,如果买的是配好的双抗时,加10ml就可以胎牛血清：-20℃保存，使用前需56℃水浴灭活30min；分装，避免反复冻融；使用时逐步解冻，即先从-20℃转至4℃冰箱过夜，再放至室温。
可以照紫外。
强酸洗液：重铬酸钾120g 浓硫酸200 mL 蒸馏水1 000 mL（按比例配置） MTT：用PBS(pH=7.4)配成5 mg/mL，过滤除菌，1.5ml离心管分装，封口膜封口，-20℃保存，一定要避光保存PBS：NaCl 8.0g， KCl 0.2g，Na2HPO4・H2O 1.56g ，KH2PO4 0.2g 加双蒸水至1000ml，调PH至7.4，高压灭菌，4℃保存DMSO：冬天温度低时形成结晶，需水浴加热后使用，且控制房间温度；离心时注意温度，不要使用低温离心，否则96孔板温度低，DMSO加于其中后会析出晶体需泡酸处理的东西有：培养皿培养瓶离心管(50ml、10ml、1.5ml) 枪头玻璃棒烧杯（1000ml、250ml）盐水瓶量筒（筛网和培养瓶盖子绝对不可以泡强酸！）需高压的东西有：培养皿培养瓶,枪头(三种规格)需准备的其他东西还有： 75%酒精培养皿培养瓶培养板离心管(8ml 1.5ml ) 计数板盖玻片,滤菌器枪头(三种规格) 枪头盒 5ml /10ml注射器烧杯盐水瓶量筒废液缸标签记号笔 1.5ml计数用离心管毛细管生理盐水(计数稀释用) 新洁尔灭桶手套口罩称量纸(灭菌) 酒精棉酒精灯锡箔纸饭盒试管架紫外消毒注意：1. 盐水瓶盖子、培养瓶盖子绝对不可以泡强酸，可泡75%酒精消毒，再用蒸馏水洗干净后放入饭盒或者用牛皮纸包好高压灭菌2. 所有接触细胞的东西包括培养皿、培养瓶等等玻璃仪器均须泡强酸洗液；用于配液及分装的盐水瓶、大小离心管、玻璃棒、烧杯、量筒等等也须泡强酸洗液3. 冷冻离心机须提前预冷4. 每次实验前须注意房间的紫外、过滤装置等等5. 所有带入培养间的东西需紫外，放入超净台的东西需洁净，最好瓶子外表都用75%酒精擦洗 3.方法：做好一切准备工作,取出细胞放入8ml离心管,放入冷冻离心机内离心,1000转6分钟,缓缓倒出上清(或吸出上清),加入新鲜培养基(定量,因为用于计数),.轻轻吹打,制得细胞悬液,取出20μl放入dov管内，dov管内的用于计数，8ml离心管的离心。
MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项
MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项四、实验所需材料1．MTT 溶液的配制通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。
市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g1.1 对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。
具休做法：预先在50ml离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入20ml PBS，从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。
可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。
将MTT 完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。
按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。
1.2 对于大包装，可按上述方法称取一部分溶解，也有人将粉剂分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加。
注意事项：l 在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
l 配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感l MTT一般最好现用现配，过滤后4度避光保存两周内（个人曾做过4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不错）有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。
l MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.2．MTT甲瓒溶解液2.1 二甲基亚砜DMSO，可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。
2.2 三联溶解液：SDS10g，异丁醇5ml，10M HCl 0.1ml 用双蒸水溶解配成100ml溶液（文献方法：周建军等，评价抗癌物质活性的改良MTT方法，中国医药工业杂志，1993，24（10）：455-457），该溶解液不需去除原培养基，但溶解较慢。
MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项
MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项四、实验所需材料1．MTT 溶液的配制通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。
市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g1.1 对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。
具休做法：预先在50ml离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入20ml PBS，从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。
可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。
将MTT 完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。
按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。
1.2 对于大包装，可按上述方法称取一部分溶解，也有人将粉剂分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加。
注意事项：l 在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
l 配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感l MTT一般最好现用现配，过滤后4度避光保存两周内（个人曾做过4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不错）有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。
l MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.2．MTT甲瓒溶解液2.1 二甲基亚砜DMSO，可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。
2.2 三联溶解液：SDS10g，异丁醇5ml，10M HCl 0.1ml 用双蒸水溶解配成100ml溶液（文献方法：周建军等，评价抗癌物质活性的改良MTT方法，中国医药工业杂志，1993，24（10）：455-457），该溶解液不需去除原培养基，但溶解较慢。
MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项
MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项四、实验所需材料1．MTT 溶液的配制通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。
市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g1.1 对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。
具休做法：预先在50ml离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入20ml PBS，从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。
可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。
将MTT 完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。
按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。
1.2 对于大包装，可按上述方法称取一部分溶解，也有人将粉剂分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加。
注意事项：l 在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
l 配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感l MTT一般最好现用现配，过滤后4度避光保存两周内（个人曾做过4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不错）有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。
l MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.2．MTT甲瓒溶解液2.1 二甲基亚砜DMSO，可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。
2.2 三联溶解液：SDS10g，异丁醇5ml，10M HCl 0.1ml 用双蒸水溶解配成100ml溶液（文献方法：周建军等，评价抗癌物质活性的改良MTT方法，中国医药工业杂志，1993，24（10）：455-457），该溶解液不需去除原培养基，但溶解较慢。
MTT实验原理、步骤、注意事项
MTT实验原理；步骤；注意事项；一、原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法：通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。
在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。
需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
我一般都把MTT 粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT具体步骤
MTT具体步骤一般，以传代2~3次的细胞铺板为好。
1刚复苏的细胞在T25的培养瓶中培养，满瓶后，全部转至T75培养瓶中，T75培养瓶中传代1~2次；2T75瓶中细胞长至70~80%时，即可准备铺板，吸掉培养基，加入PBS约10ml 润洗后吸走PBS, 再加入胰酶约5ml 左右，消化，待细胞变圆后，轻轻敲打，若细胞成群掉落，即消化完全，及时加入全培约10ml 终止消化，转移至50ml 离心管中，800rpm，离心5min ；3离心管中，将离心好的上清去掉，先加入5ml 全培悬浮细胞，用1ml 的枪吹打均匀，后加入10 ml 全培，用移液管吹匀细胞液；4细胞计数，移取9 μl细胞液于细胞计数板中，四小格分别计数后，求和再除以4，再乘于104，得出离心管中细胞的浓度C个/ml ，根据公式C*X=5*104*10ml，（按目的浓度5*104计算）计算得出X. 即从离心管中取出的体积，转移至另一离心管中，后加培养基至10ml（终体积）；5细胞铺板，边缘孔用PBS封闭，200μl/well，中间孔加入100ul 细胞液，由前知道新配置的细胞液浓度5*104，所以得出每孔是5000个细胞，即可细胞铺板，要注意移液枪的6细胞24h过夜，配置药物（以十倍稀释为例），例：Doxocubicin 母液浓度10 mM ，配制成10-5 μM、10-4μM、10-3μM、10-2μM、10-1μM、1μM、10μM ，取准备8个离心管，从左到右，分别是：control 组，10-5 组、10-4组、10-3组、10-2组、10-1组、1组、10组，分别先加入培养基：10ml，1.8ml，1.8ml，1.8ml，1.8ml，1.8ml，1.8ml，2ml，加2μl到2ml中，吹打均匀，转移200μl到前面的管中，同样操作，使最后一个1.8ml的体积到2ml就好了；7准备加药，200μl/well，注意有些药物是在避光的条件下进行配制与加板的，加药作用48h，37℃，5%CO2培养箱中放置；8加药48h后加MTT, MTT母液是5mg/ml, 用相应的培养基稀释成0.5 mg/ml，然后吸掉96孔板中的药物培养基（注意不要吸走细胞），加入0.5 mg/ml的MTT 100μl/well，37℃，5%CO2培养箱中放置4 h；9MTT加入后4h，吸掉MTT上清，加入DMSO 150μl/well ，稍微振荡，酶标仪中检测OD570 , 根据公式Inhibition（%）=（1- X/control ）*100 计算出抑制率，再用相应软件计算出IC50值，根据需要用Prime 作图软件做出相应图表。
MTT试验方法
MTT试验方法MTT法原理、步骤以及注意事项(2009-05-28 11:18:56)标签：杂谈分类：实验操作技能MTT原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm 波长处（也有用570nm波长的，我目前用的都是570nm)测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。
在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。
需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
MTT实验方法
MTT实验
1. 接种细胞，吸出旧培养基，用适量DPBS洗去残留培养基，加入适量胰酶消化，用新鲜培养基重悬细胞并计数（1*10^5个细胞/ml,视细胞大小及生长速度而定），每个孔做3-5个重复。
根据设定的时间梯度确定板的个数
2. 接种4h（0天）之后加入含10ulMTT的培养基100ul，37摄氏度培养1-4小时
3. 吸出培养基，加入100ulDMSO震荡溶解10分钟或37度孵育30min
4. 检测OD490或者570
5. 第二天或第三天（根据自己设定的时间梯度）重复步骤2-4
注意：
接种细胞及加入MTT时可沿着96孔板的侧壁加，尽量减少气泡产生
接种细胞比较多时应注意经常颠倒混匀或吹打混匀，减少人为造成的孔间及板间误差
吸出培养基时可以用小枪头吸干净减少误差
通常35mm的小皿加培养基2ml，DPBS 1ml，胰酶200ul，消化1min（可以减少胰酶用量，延长消化时间）
60mm的小皿加4ml培基，DPBS 2ml，胰酶400ul，消化1min左右
10cm大皿加10-8ml培基，DPBS 3-4ml，胰酶600ul，消化1min左右。
MTT实验方法步骤
一．悬浮细胞MTT实验时,由于离心弃上清会造成一定程度的细胞丢失,而且操作又麻烦.请教各位老师,不用弃上清的SDS-DMF,酸化异丙醇的方法的具体步骤和参考文献.谢谢!1．介绍一种巨噬细胞杀伤活性的MTT检测：于24孔培养板中加入1×109/L腹腔巨噬细胞(1ml/孔)，培养2h后洗去未贴壁细胞，加入不同浓度的MDP。
收集对数生长期的UMR106细胞，调整细胞浓度至1×108/L，加入各孔，效靶比（E/T）为10:1，再培养24h，充分振荡。
每孔取100μl的UMR106细胞移入96孔培养板，各孔加入5g/LMTT20μl，培养4h，再加入10％SDS100μl，测定570nm处的A值。
计算公式如下：杀伤活性（％）=(1－实验组UMR106细胞的A值/对照组UMR106细胞的A值)×100％本方法参考文献，Jiao H, Shan WM, Ohe Y, et al. A new MTT assay for testing macrophage cytotoxicity to L1210 and its drug resistant cell lines in vitro. Cancer Immunol Immunother,1992;35:412～4162．SRB是一种活性蛋白染料，能与细胞蛋白的碱性氨基酸结合而显色，在490nm~520nm 波长处其OD值与活细胞数成良好的直线关系。
SRB法已被NCI选定作为筛选抗癌药物的新方法，相对于结晶紫法或目前普遍采用的MTT法，其灵敏度好于结晶紫法，相当或优于MTT法。
除此之外SRB法还有以下优点：(1)操作时间短，细胞固定和染色仅需90分钟左右，而MTT加样后还需培养4小时。
(2)没有严格时间限制，在TCA固定后或SRB结合后的细胞均可存放，Monks指出样品保存7天，测定的OD值下降不超过2％[8]。
（3）可以测定悬浮细胞，采用16% 的三氯乙酸直接加入培养细胞中能完整酸化固定细胞，较之MTT 法或结晶紫法离心取上清的操作，不会带来细胞损失，测定结果更准确。
MTT实验原理、步骤、注意事项
MTT实验原理；步骤；注意事项；一、原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法：通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。
在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。
需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项
MTT 实验操作步骤1.收集对数生长期细胞制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5×104/ml。
（MG63/DOXand SF-86 细胞都是这个浓度）。
2.细胞悬液吹打均匀后，用排枪接种到96孔板，每孔100ul(即5000个细胞)。
3.种完细胞后6—24小时后，等其完全贴壁，将排枪调至130ul，将上清液培养基吸出（吸取过程中要动作要轻，沿孔壁至每孔的左下角，枪尖不要在底面滑动，防止损伤细胞）。
4.用完全培养基将药物按梯度配制好，每孔加入含药培养基150ul，孵育72小时（每个药物做3个复孔）。
5.72h后，将排枪调至180ul，将上清液培养基吸出，每孔加入50ul 0.5mg/ml的MTT溶液，孵箱内孵育4小时。
（MTT溶液配制方法：MTT粉末先用PBS缓冲液配制成5mg/ml，超声溶解后过0.22ul微孔滤膜除菌，4℃保存，此为MTT母液，母液四度可保存一月，配制时注意不要配太多！！实验中MTT溶液为MTT母液10倍稀释与不含血清培养基，e.g. 如果需要10mlMTT溶液，取1ml 母液加9ml 不含血清培养基）6.4h后，排枪调至80ul，将上清MTT溶液吸出（注意不要损失底面的紫色结晶），每孔加入150ul DMSO 溶液，孵箱内孵育1小时，以便结晶完全溶解。
7.读板器读板（读板前注意观察紫色结晶是否完全溶解）8.读板设置为570nm 跟650nm 两波长读数，输出OD值为570nm处读数-650nm处读数。
e.g. cell plate:DRUG 1 control control 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6 3.2 6.4 12.8ug/ml control controlcontrol controlDRUG 2 control control control control control controlResult:0.0772 0.2476 0.2444 0.2394 0.1991 0.1784 0.1617 0.1376 0.1028 0.0966 0.0842 0.0775 0.0744 0.3108 0.2942 0.2683 0.2387 0.2239 0.1891 0.1737 0.1289 0.1063 0.0966 0.07650.076 0.3111 0.3185 0.2899 0.2472 0.2175 0.2048 0.1628 0.1367 0.1111 0.094 0.0788 0.0724 0.3104 0.319 0.2747 0.2513 0.2227 0.2144 0.1658 0.1439 0.1178 0.09380.0786 0.0785 0.3152 0.3039 0.2832 0.2611 0.2303 0.193 0.1678 0.1506 0.1082 0.0797 0.0754 0.0723 0.2883 0.314 0.2864 0.2591 0.2283 0.2023 0.1565 0.151 0.123 0.0981 0.0808 0.0741 0.2644 0.2928 0.2848 0.2717 0.2065 0.1852 0.1566 0.1441 0.1204 0.0899 0.08340.079 0.2846 0.2647 0.2743 0.2255 0.1953 0.1759 0.1644 0.1405 0.1083 0.0844 0.0832MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项一、MTT是什么MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
mtt细胞实验步骤
mtt细胞实验步骤
MTT细胞实验是一种常用的细胞生存率和细胞增殖能力测定方法，以下是MTT细胞实验的基本步骤：
1. 显微镜下观察细胞形态与结合情况：将需要进行实验的细胞取出，通过显微镜观察细胞形态与结合情况以确保细胞质量正常。
2. 细胞的处理：将细胞以适当的密度悬浮在含有培养基的培养皿中，并放入恒温培养箱中培养一段时间，使细胞黏附于培养皿底。
3. 处理试剂：根据实验设计的需要，如调节药物浓度、添加化合物等，处理培养皿中的细胞。
4. MTT溶液的制备：取适量的MTT混合粉末，加入生理盐水或者PBS缓冲液中，溶解后过滤灭菌。
5. MTT染色：将处理后的细胞培养皿加入预先准备好的MTT 溶液中，使其充分与细胞接触，然后将培养皿放回恒温培养箱中孵育适当的时间。
6. 细胞摄取MTT：将MTT孵育后的培养皿从恒温培养箱中取出，轻轻吸去残留的MTT溶液，并加入适量的溶解剂（如二甲基亚砜）使细胞摄入的MTT完全溶解。
7. 光度计测定：将溶解后的MTT液吸取到96孔板中，通过
光度计测定吸光度值，即MTT代谢产物形成的紫色产物的吸光度。
8. 数据分析：根据光度计测定的数据，计算细胞生存率或增殖能力并进行统计分析。
注意事项：
- 实验过程中需要严格执行无菌操作，以确保实验结果的准确性。
- 实验前需准备好试剂和培养皿等相关材料，保证实验顺利进行。
- 实验设计时应考虑到对照组设置、重复次数等因素，以增加实验的可靠性。
MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项
四、MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项1、MTT：MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
2、MTT用途：（1）药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；（2）细胞增殖及细胞活性测定。
3、原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）颗粒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒颗粒，用酶标仪在490nm波长处（也有测D570nm）测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。
4、实验材料：（1）MTT的配制：通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml，须用无菌PBS或生理盐水做溶剂。
注意事项：厂家都是将MTT放入小管中的，建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液。
细节如下：预先在50ml离心管加入20ml PBS（PH=7.4），从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。
可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。
将MTT完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)，可长期保存于-20℃，避免反复冻融。
当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。
MTT有致癌性，用的时候小心，有条件最好带那种透明的簿膜手套。
（2）MTT甲瓒溶解液：DMSO（二甲基亚砜）：可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。
mtt实验操作流程
mtt实验操作流程
MTT实验操作流程如下：
1. 细胞接种：将细胞接种在含有不同浓度的药物的培养基中，并进行培养。
2. MTT添加：将MTT添加到培养基中，使其浓度为/ml。
3. 细胞处理：将培养基中的MTT和细胞共同处理，一般处理时间为2-4小时，处理后可以观察到细胞内有紫色晶体的形成。
4. 溶解晶体：将细胞处理后的培养基去掉，加入DMSO（二甲基亚砜）溶解晶体，离心收集上清液。
5. 检测吸光度：将上清液放入96孔板中，用酶标仪检测吸光度，计算细胞的存活率。
通过上述步骤，就可以完成MTT实验。
希望对您有帮助。
MTT
MTT常用浓度为5mg/ml。
1、药物的细胞毒性四唑盐（MTT）比色法操作步骤接种细胞（1）用胰蛋白酶消化汇合的单层细胞，将细胞收集到含血清的培养基中。
（2）离心细胞悬液，使细胞沉积下来。
用培养基重悬细胞，计数。
（3）将细胞稀释至2.5×103-50×103 个/ml，每个微滴定板可容纳20ml细胞重悬液。
（4）用加样器在平底96孔板中间十列的各孔中加入200μl细胞悬液，每孔加0.5×103-10×103 个细胞。
（5）将200μl培养基加至第1列和第12列的8个孔中。
第1列作读板议的空白对照。
（6）将培养板放至塑料饭盒中，于37℃湿润环境中温育1-3天，等细胞进入指数生长期时可加入药物。
添加药物（7）用培养基将细胞毒性药物5倍系列稀释，共制备8个浓度。
（8）对于贴壁生长的细胞，去除第2-11列各孔的培养基。
（9）在第2列和第11列的8个孔中加入200μl新鲜配制的培养基，这些细胞作为对照。
（10）在第3-10列的细胞中加入细胞毒性药物。
每个药物浓度仅需4个孔，这样A-D行可用于第一种药物，E-H行用于第二种药物。
（11）向每组4 孔中各加入200μl药物溶液。
（12）将培养板放回塑料盒中，温育至确定时间。
生长期（13）在药物作用期结束时，去除所有含有细胞的孔中的培养基，加入200μl新鲜的培养基。
（14）每日换液至2-3个PDTs[群体倍增时间]。
存活细胞数的估算（15）在生长期末，每孔中各加入200μl新鲜的培养基，在第1-11列所有孔中各加入50μl MTT。
（16）用铝箔包裹培养板，于37℃湿润环境中温育4 h。
（17）弃去孔中的培养基和MTT，在第1-11列所有孔中各加入200μl DMSO，以溶解残留的MTT-甲臜结晶。
（18）在含有DMSO的各孔中加入甘氨酸缓冲液（每孔25μl）。
（19）立即在570nm处记录吸光值。
读板仪用第1 列中含培养基和MTT但不含细胞的各孔调零。
MTT实验流程
基于MTT的细胞毒性试验细胞存活率=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%抑制率=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%As: 实验孔吸光度(含细胞、培养基、MTT溶液和药物溶液) ；Ac: 对照孔吸光度(含细胞、培养基、MTT溶液，不含药物) ；Ab: 空白孔吸光度(含培养基、MTT溶液，不含细胞、药物) 。
接种细胞：1.用胰蛋白酶消化细胞，将细胞收集到含血清的培养基中。
2.离心细胞悬液（1000rpm 5min），收集沉淀，用培养基重悬，计数。
3.将细胞稀至2.5 x 10^3-5 x 10^3个/ml，这依赖于细胞的生长速度。
4.将细胞移到9ml培养皿中，用排枪在96孔板中间的10列各孔中加入200μl细胞悬液（80孔/板），从第二列开始到第十一列位置，每孔加入0.5 x 10^3-10 x 10^3个cell。
5.将200μl培养基加第1列与第12列的8个孔中。
第1列用读板仪的空白对照，第12列有助于维持第11列的湿度，并将“边缘效应”(edgeeflect)减至最小。
6.将培养板放至塑料饭盒中，于37℃湿润环境中温育1~3d，等细胞进入指数生长期时可加人药物（以上可以增加初始细胞浓度，减小培养时间）7.对于非黏附细胞，用新鲜培养基制备细胞悬液将细胞稀释至每毫升5x10^3~100x10^3个/ml，仅取100细胞悬液接种于圆底96孔板，之后立即加入药物。
添加药物8.用培养基将细胞毒性药物5被系列稀释，共制备8个浓度。
选择浓度时应以最高浓度下多数细胞被杀死，而最低浓度时不会杀死细胞为标准。
只要对药物的毒性有所了解，便可采用较小的浓度范围。
一般情况下，每种药物使用3块培养板，这样一次试验中可以有三个平行测定结果。
9.对于贴壁生长的细胞，去除第2~11列各孔中的培养基，这可以通过将皮下注射器针连在吸引管上完成。
10.在第2列和第11列的8个孔中加入200μl新鲜配制的培养基，这些细胞作为对照。
MTT实验操作步骤
MTT实验操作步骤MTT的操作方法一、MTT是什么MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetra zoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
二、MTT法用来做什么简单地说：是一种检测细胞存活和生长的方法。
MTT主要有两个用途1．药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；2．细胞增殖及细胞活性测定。
三、为何MTT可以用来做上述工作检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。
四、实验所需材料1．MTT 溶液的配制通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS 或生理盐水做溶剂。
市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g1.1对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。
具休做法：预先在50ml离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入20ml PBS，从中先吸取500-1000u l PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。
可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。
将MTT完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。
按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。
MTT实验操作步骤
MTT的操作方法一、MTT是什么MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetra zoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
二、MTT法用来做什么简单地说：是一种检测细胞存活和生长的方法。
MTT主要有两个用途1．药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；2．细胞增殖及细胞活性测定。
三、为何MTT可以用来做上述工作检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。
四、实验所需材料1．MTT 溶液的配制通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。
市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g1.1对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。
具休做法：预先在50ml离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入20ml PBS，从中先吸取500-1000u l PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。
可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。
将MTT完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。
按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。
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MTT的操作方法
一、MTT是什么
MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetra zoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
二、MTT法用来做什么
简单地说：是一种检测细胞存活和生长的方法。
MTT主要有两个用途
1．药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；
2．细胞增殖及细胞活性测定。
三、为何MTT可以用来做上述工作
检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。
四、实验所需材料
1．MTT 溶液的配制通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。
市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g
1.1对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。
具休做法：预
先在50ml离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入20ml PBS，从中先吸取500-1000u l PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。
可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。
将MTT完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。
按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。
1.2对于大包装，可按上述方法称取一部分溶解，也有人将粉剂分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加。
注意事项：
l在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
l配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感
lMTT一般最好现用现配，过滤后4度避光保存两周内（个人曾做过4度避光保存4周的M TT溶液，效果仍然不错）有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。
lMTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.
2．MTT甲瓒溶解液
2.1二甲基亚砜DMSO，可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。
2.2三联溶解液：SDS10g，异丁醇5ml，10M HCl 0.1ml 用双蒸水溶解配成100ml溶液（文献方法：周建军等，评价抗癌物质活性的改良MTT方法，中国医药工业杂志，1993，24（10）：455-457），该溶解液不需去除原培养基，但溶解较慢。
（个人觉得其溶解的能力不如DMSO强）
该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。
五、MTT法实验步骤
1: 胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10×1 04/ml。
细胞详细计数方法请参照易生物实验技术中的相关文章。
对于初学者而言，要使细胞达到5-10×104/ml往往不知从何处着手，我在这里向大家提供一个简单的方法以初步确定细胞数量。
以一般细胞培养常用的25cm2为例，
1)细胞密度在长到约80%~90%（下图所示为80%~90%密度时细胞的大致状态），消化离心收集后，将上清去掉，加入3ml培养基使其混匀。
2)另取一支新的15ml无菌离心管（为下一步接种96孔板用），装入约9ml培养基.
3)从第一步准备的3ml细胞悬液中取1ml, 加入上管，混匀后细胞计数，此时一般为或小于5-10×104/ml，该浓度相当于细胞计数板4个大格内每大格平均5-10个细胞（见下图）；如果不够该浓度，再根据计数的结果滴加细胞悬液，每滴按50ul计算。
)细胞数量因实验目的不同应做相应调整，如一般细胞增殖实验每孔2000个就可以（相当于细胞悬液密度为2×104/ml），细胞毒性实验每孔5000—10000个（相当于细胞悬液密度为5×104/ml）。
此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。
比如：生长较快的细胞密度可略小。
2．将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100ul, 这样待测细胞的密度为5000—1000 0/孔（边缘孔用无菌PBS填充）。
l注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加6个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，这对于MTT的结果至关重要。
3.将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设6个，否则难以反应真实情况。
下图可做为96孔板的的参考步局。
l对于加药，有人直接将药物按不同体积加入到96孔板中，以形成浓度梯度。
但本人认为应尽量在EP管中将不同浓度的药物配好，然后将96孔板中的培养上清去掉（可以用排枪吸走）再加入100ul含不同浓度药物的培养基，这样能保证药物浓度的准确。
另外，需注意的是，如果用这种方法，不要把96孔板的培养液全部吸走后再加药，应该吸完一部分后立即加样，避免由于96孔板干燥引起细胞死亡。
4.5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。
下图为一典型的药物梯度为细胞的毒性作用。
5.每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。
若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
6. 终止培养，准备溶解结晶。
l 溶解结晶的方法有两种，第一种，用DMSO溶解
1) MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。
将上清去掉，该过程要注意不能把Formazan 结晶移走。
有人直接用移液器将上清移走，也有人建议先铺几张滤纸在桌面，然后将96孔板轻轻倒置，这样上清便被滤纸吸走，以减少结果的损失。
个人认为，这两种方法都有可能导致结晶的损失，从而引起结果的不准确。
采用哪种方法，可以自己摸索一下再决定。
2) 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
l 另一种方法，用三联溶解液（见上面MTT甲瓒溶解液）
1) MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。
这种方法细胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。
（该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。
）
2) 放入培养箱中继续孵育4—6小时，镜下观察，待结晶全部溶解后570nm测吸光度。
通常37℃孵育4小时左右，紫色结晶会全部溶解。
如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。
如果紫色结晶较大较多，溶解的时间会长一些。
在实际的操作过程中，往往为了等待4—6小时，使得实验者在下班以后或者晚上来测OD 值，给实验者带来了很大的不方便。
个人曾经摸索，加入溶解液后过夜再测对OD值基本无影响，但要注意的是一定要避光，不过培养箱关闭后本身就是闭光的，所以加入溶解液后放入培养箱中，第二天上班时再测OD值就可以了。
7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。
六、MTT结果分析
关于如何计算IC50
1、改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
Xm:lg 最大剂量
I:lg(最大剂量/相临剂量)
P:阳性反应率之和
Pm:最大阳性反应率
Pn:最小阳性反应率
举个例子：各药物浓度作用于某肿瘤细胞后所得MTT值如下
公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率
抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值，如对于100ug/ml的药物，其抑制率=1-0.080/0.61 4=0.869，各组抑制率如下：
代入计算公式：
Pm=0.869
Pn=0.135
P=0.869+0.849+0.616+0.391+0.282+0.135=3.142
Xm=lg100=2
lgI=lg100/50=0.301
lgIC50=2-0.301*(3.142-(3-0.869-0.135)/4)=1.655
IC50=45.186
该药物的IC50值为45.186ug/ml。