微生物试验rd 文档

海桐皮药材微生物试验
1.药液的制备： 各海桐皮提取液：
取海桐皮、川桐皮、浙桐皮药材粉末各三份，每份10g ，加入不同溶剂{ 100ml 。

水浴回流提取3h ，放冷过滤，再在药渣中分别加溶剂，作第二、三次加热回流，分别约30min ，用各自溶剂清洗残渣一同过滤，将滤液浓缩至25ml ，得到质量浓度为0.4g/ml 的提取液。

2.抑菌效力测定
将定性滤纸用打孔器打成直径为5mm 的纸片，高压灭菌后烘干。

然后将滤纸片用无菌镊子夹取放入各提取液中浸泡。

用涂抹法将各供试菌液（菌液浓度约为107~108cfu/ml)接种在培养基上，再用无菌镊子夹取沾有提取液的滤纸片放入培养皿中，溶剂浸润的滤纸片作阴性对照。

然后放入37℃的培养箱中培养24h ，测量抑菌圈的直径，并记录测量数据，每组实验重复3次。

（抑菌圈直径大于6mm 小于10mm 为低度敏感；大于10mm 小于15mm 为中毒敏感；大于15mm 为高度敏感）。

3.最低抑菌浓度（MIC ）试验
将0.4g/ml 的海桐皮提取液用PBS 液（磷酸氢二钠2.83g ，磷酸二氢钾1.36g 溶于1000ml 蒸馏水）做对倍系列稀释成不同浓度的受试液（0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125g/ml)，取各稀释度受试液1ml 加入到含1ml 双倍浓度营养肉汤的试管中。

取0.1ml 含菌量约为107cfu/ml 菌悬液接种于试管中，作为实验组样本（试管号：2-9）。

以同样方法接种菌液于不含受试液的营养肉汤的试管中，作为阳性对照组样本（试管号：10）。

取含营养肉汤（不接菌种）的试管作为阴性对照组样本（试管号：1）。

将实验组样本、阳性对照组样本及阴性对照组样本放置37℃培养箱中，培养24h ，观察结果。

4.最低杀菌浓度（MBC ）试验
取最低抑菌浓度试验结果中，无菌生长的各培养管中的培养液0.1ml ，分别移种在相应的新鲜的琼脂培养基上，37℃培养24h ，观察结果。

无菌蒸馏水 95%乙醇
80%乙醇
5.抑菌率试验
将试验菌24h斜面培养物用PBS洗下，稀释成浓度为3×106cfu/ml的菌悬液。

取药液5ml1管；取上述菌悬液0.1ml置于药液管中，开始计时，作用2,5,10,20min，用无菌吸管分别移取药液管中溶液0.5ml投入含4.5mlPBS 的试管中，充分混匀，作用10分钟，适当稀释，分别吸取1ml置于两个平皿中，用凉至60℃的营养琼脂培养基（用于大肠菌、金葡菌、绿脓菌）20ml作倾注，转动平皿，使其充分混匀，琼脂凝固后翻转平板，37℃培养48h。

做活菌菌落计数。

用双蒸水代替药液做相同的处理作为阳性对照管。

计算抑菌率：X=(A-B)/A
X：抑菌率，% A：阳性对照液平均菌落数B：被试药液样品平均菌落数
6.杀菌率试验
将试验菌24h斜面培养物用PBS洗下，稀释成浓度为3×106cfu/ml的菌悬液。

取药液5ml1管；取上述菌悬液0.1ml置于药液管中，开始计时，作用2,5,10,20min，用无菌吸管分别移取药液管中溶液0.5ml投入含4.5ml中和剂的试管中，充分混匀，作用10分钟，适当稀释，分别吸取1ml置于两个平皿中，用凉至60℃的营养琼脂培养基（用于大肠菌、金葡菌、绿脓菌）20ml作倾注，转动平皿，使其充分混匀，琼脂凝固后翻转平板，37℃培养48h。

做活菌菌落计数。

用双蒸水代替药液做相同的处理作为阳性对照管。

计算杀菌率：X=(A-B)/A
X：杀菌率，% A：阳性对照液平均菌落数B：被试药液样品平均菌落数。