千家寨不同海拔野生茶树的+EST-SSR+遗传多样性研究

在物种水平上，Shannon 信息指数（I）和 Nei 基因多样性（He）分别为 1.33 和 0.66，表现出很高的遗传多样
性；千家寨不同海拔梯度上野生茶树居群的遗传多样性有差异，且随着海拔梯度的递增，居群的 2 100 m 处达到最大值；野生茶树居群间的基因流（Nm）为 1.84，群体 分化系数（Fst）为 0.12，且基于 AMOVA 软件分析结果显示有 16.32%的变异发生在居群间，表明野生茶树群 体间属于中度分化，且大部分变异存在于居群内。野生茶树本身的遗传特性和不同海拔居群所处生境的异质
Altitude in Qianjiazhai
HUANG Xiaoxia, TANG Tan, JIANG Yonglei, FENG Chengcheng, CHENG Xiaomao*
Faculty of Landscape Architecture, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China
1 材料与方法
1.1 研究地及试验材料的采集
研究区位于云南省普洱市镇沅县千家寨 风景区内，地处北纬 24°7′，东经 101°14′，是
哀 牢 山 国 家 级 自 然 保 护 区 的 核 心 区 域 [14]。 野 生茶树群落分布在以千家寨为中心的原始森 林中，海拔在 1 800~2 500 m。此处的野生茶 树群落是目前世界上所发现的面积最大， 保存最完整，并且以野生茶树为优势树种 的 植 物 群 落 [15]。 该 境内 地形复杂，海拔在 1 002~3 165.9 m 之间，其生态因子在这种巨 大的海拔梯度下差异较大。这里年平均气温 为 10~12℃，降水量 1 500 mm 以上，无霜期 4~10 月，属于中亚热带北缘气候区，其植被 呈现出南亚热带常绿阔叶林的山地垂直带植 被类型[14]。
青 FF，0.105 g 溴酚蓝，0.04 g NaOH），4℃ 放置备用。
用 6%尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 扩 增 产 物 ， 并 参 照 程 小 毛 等 [17]的 方 法 进 行 影 染显色，最后放在灯箱上拍照记录。
表 1 5 对 EST-SSR 引物的信息 Table 1 Information of 5 EST-SSR primer pairs tested
F:CCATTATGCAACAATTTTCTC
S19
(TC)n
54.93 R:GAAGTGGGTAAAGTGACAATG
13
26
150
F:TGCCCCTAATTTTCTATCTTT
S59
(AG)n
55.79
R:GGGAAATTGCTTACTCTCATT
16
32
149
F:GAGGTAATAGTTTGCACCTC
4期
黄晓霞，等：千家寨不同海拔野生茶树的 EST-SSR 遗传多样性研究
349
（ Applied Biosystems ） 上 进 行 。 反 应 程 序 为：94℃预变性 3 min；94℃变性 30 s，56℃ 复性 1 min，72℃延伸 90 s，40 个循环；72℃ 延伸 5 min。在扩增产物中加入等体积的上样 缓冲液（200 mL 98%甲酰胺，0.105 g 二甲苯
一个物种的形成及区域内的稳定存在与 这个种群的遗传结构和遗传多样性有着密切
的关系，遗传结构的空间分布能够反映生态 适应进化、环境的变迁和自然选择效应[1]。遗
收稿日期：2015-01-13
修订日期：2015-03-17
基 金 项 目 ： 国 家 自 然 科 学 青 年 基 金 项 目 （ 31100292 ） 、 西 南 林 业 大 学 科 研 启 动 金 项 目 （ 110909） 、 云 南 省 省 级 重 点 学 科 园 林 植 物
引物编号 重复基元 引物序列（5′-3′）
退火温度/℃
重复次数 引物长度/bp 目的片段大小
Primer code Repeat motif Primer sequences(5′-3′)
Annealing temperature Repetitions Primer length Size range/bp
S95
(CAG)n
55.5 R:TGTAATACCCTCCATTAGTCG
6
15
153
Contig18 (AG)n
F:AGATTTCCCTTTCTAAGGAGAC 54.99
1.2 试验方法
1.2.1 基因组 DNA 的提取和 EST-SSR 引物的 筛选
基因组 DNA 提取参照黄建安等[16]方法。 在程小毛等[17]开发的引物中选取 5 对扩 增条带清晰，多态性高的引物，并由生工生 物工程上海（股份）有限公司合成。有关这 5 对引物的具体情况参见表 1。 1.2.2 PCR 扩增和产物检测 参 照 程 小 毛 等 [17] 的 反 应 体 系 及 反 应 程 序 。 反 应 体 系 为 10 µ L ： 1×PCR Buffer (Mg+) ， 0.2 µ mol·L-1 dNTPs ， 0.8 µ mol·L-1 引 物，0.5 U Taq 酶（北京天根），100 ng DNA 模 板 。 扩 增 在 GeneAmp PCR system 9700
所用茶树[Camellia sinensis (L.) O. Ktze] 为 2014 年 4 月上旬采自云南哀牢山国家级自 然 保 护 区 核 心 区 域 ——千 家 寨 风 景 区 内 不 同 海拔梯度的野生茶树。从海拔 1 800 m 处开始 采集野生茶树叶片，海拔高度每上升 100 m 作为一个居群处理，共采集 7 个居群，分别 记为 A(1 800 m)、B(1 900 m)、C(2 000 m)、D (2 100 m)、E(2 200 m)、F(2 300 m)和 G(2 400 m)。 每个居群随机采集若干株（n≥10）野生茶树 的嫩叶，并且每株间的间距在 30 m 以上，共 随机选取 91 个个体的嫩叶，用变色硅胶迅速 干 燥 ， 并 及 时 带 回 实 验 室 中 ， 放 入 － 80℃ 超 低温冰箱中保存备用。
与 观 赏 园 艺 建 设 经 费 项 目 （ 50097401）
作 者 简 介 ： 黄 晓 霞 ， 女 ， 博 士 ， 副 教 授 ， 主 要 从 事 植 物 生 理 生 态 研 究 。 *通 讯 作 者 ： 30375713@
348
茶叶科学
35 卷
传多样性是生命进化和适应的基础，其水平 高低能反映物种对环境变化的适应能力[2]。近 年来，从 DNA 水平研究物种遗传多样性的分 子标记主要有 RFLP、RAPD、SCAR、AFLP、 SSR 和 ISSR 等，而基于 SSR 标记基础发展 出来的 EST-SSR 标记方法具有多态性高、共 显性遗传、重复性好、通用性好、开发引物 廉价、条带清楚等优点[3-4]，越来越受到研究 者的关注。对物种遗传多样性的研究是遗传 资 源 保 存 的 前 提 条 件 [5]， 也 是 评 价 物 种 生 存 能力和适应能力的基础，并为揭示物种的形 成 、 地 理 分 布 及 其 进 化 提 供 依 据 [6]， 同 时 在 育种和遗传改良方面也有重要的意义。
茶树作为多年生常绿植物，是中国重要 的经济作物之一。野生茶树是处于自然生长 状态下的茶树资源，其树龄一般在百年至数 百 年 以 上 [7]。 中 国 的 野 生 茶 树 资 源 主 要 分 布 在西南和华南地区，其中云南西南部和西部 是野生茶树最为集中和分布最广的区域，地 处海拔 1 600~2 700 m 的高山峡谷中[8]。近年 来，刘振 [9]、乔婷婷 [10]、吴晓梅 [11]、刘本英 [12]、周萌[13]等人利用 SSR 标记在茶树遗传多 样性中进行了相关研究，而有关不同海拔梯 度上野生茶树的遗传多样性分析鲜有报道。 海拔梯度因包括诸多生态因子的剧烈变化而 成为研究物种对环境变化适应能力的热点。 因此，本文以云南省镇沅县千家寨自然保护 区内的野生茶树群落为试验材料，利用 ESTSSR 标记对不同海拔梯度上野生茶树群体的 遗传结构和遗传多样性进行深入研究，明确 不同海拔梯度上野生茶树资源的遗传多样性 水平和种群结构，并揭示其变化规律，为今 后野生茶树资源的保护、遗传改良以及开发 利用提供参考。
Abstract: 5 pairs of EST-SSR markers derived by the authors were used to study genetic diversity and genetic structure of 7 wild tea populations at different altitudes in Qianjiazhai. At the species level, Shannon information index (I) and Nei’s gene diversity (He) were 1.33 and 0.66, respectively, indicating this species has high genetic diversity at species level. Along altitudinal gradients, the genetic diversity among population of wild tea was different and showed low-high-low distribution. The genetic diversity of population at altitude 2 100 m was much higher than others populations. AMOVA analysis showed that only 16.32% of the total genetic variation occurred among populations, whereas 83.68% of the variance was within populations, which was in line with the coefficient of genetic differentiation (Fst = 0.12). And the gene flow Nm was 1.84, indicating the genetic diversity between wild ancient population in was characterized by the moderate level. The genetic characteristics of wild tea and the habitat heterogeneity in different elevation are the main reason of existing genetic pattern. Keywords: wild tea, altitude, genetic diversity, genetic differentiation, EST-SSR