飞秒激光诱变微生物技术及其机理的研究进展

CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS 2011年第30卷第4期·824·化工进展飞秒激光诱变微生物技术及其机理的研究进展李海伟1，陈云琳1，黄笛2，闻建平2（1北京交通大学理学院，北京 100044；2天津大学化工学院，天津 300072）摘要：飞秒激光诱变微生物是一项崭新的技术。

本文针对传统低功率He-Ne激光诱变微生物的优点和缺点，结合飞秒激光光束脉冲持续时间短、瞬时功率大、聚焦尺寸小的优点，简要概括了国内外对飞秒激光诱变微生物技术的研究。

同时对飞秒激光辐射微生物过程中多光子吸收、形成等离子体、产生生物活性氧、DNA损伤自身修复等一系列的机理研究进行了总结。

最后，对飞秒激光诱变微生物技术及其机理研究进行了展望并提出了建议：结合关键酶活性测定和动力学参数测定来选择飞秒激光诱变的技术参数。

关键词：飞秒激光；诱变；微生物；机理中图分类号：Q 631 文献标志码：A 文章编号：1000–6613（2011）04–0824–07 Research progress of technology and mechanism of femtosecond laserinduced micro-organisms mutationLI Haiwei1，CHEN Yunlin1，HUANG Di2，WEN Jianping2（1College of Science，Beijing Jiaotong University，Beijing 100044，China；2School of Chemical Engineering & Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China）Abstract：Femtosecond laser induced micro-organisms mutation has become a new microbial technology，because of its characteristics of ultrafast pulse，high peak power and focusing on a small size. In this paper，compared to the advantages and disadvantages of the traditional low-power He-Ne laser irradiation，the technology of femtosecond laser induced micro-organisms mutation is discussed.Meanwhile，compared to traditional laser mutation mechanism of micro-organisms，the mechanisms of multi-photon absorption，formation of plasma，formation of reactive oxygen species，DNA damage and self-repair are summarized. Finally，the prospect for technology of femtosecond laser induced micro-organisms mutation is given，and the combination of key-enzyme activity measurement and dynamics parameters determination is important in choosing the technological parameters of femtosecond laser induced micro-organisms mutation.Key words：femtosecond laser；inducing；micro-organism；mechanism目前，微生物在解决人类的粮食、能源、健康、资源和环境保护等问题中正发挥着越来越重要且不可代替的独特作用，也为人类带来了巨大的社会效益和经济效益[1]。

为了获得高产、低耗、优质的菌种，人们常常通过外界物理、化学、生物因子等因素的改变诱发基因突变，其中激光诱变以其处理安全、设备简单、操作方便、辐射损伤轻、诱变当代即可变异等优点[2]越来越受到研究者的青睐，且应用此方法人们已经得到了大量的高产优质菌种[3-7]。

但是，传统低功率长脉冲He-Ne激光诱变方法存在易损伤细胞活性、突变效率低、突变无方向性、育收稿日期；2010-09-25；修改稿日期；2010-10-25。

基金项目：国家自然科学基金资助项目（21076022）。

第一作者：李海伟（1985—），男，硕士研究生。

E-mail 09122190@ 。

联系人：陈云琳，女，教授，博士生导师。

E-mail ylchen@。

第4期李海伟等：飞秒激光诱变微生物技术及其机理的研究进展·825·种周期长等缺陷，易造成细胞活性损伤致死[8]、后续筛菌工作量大、菌种退化[9]等。

飞秒激光由于其脉冲持续时间短（10−15 s）、瞬时功率大（1012W）、聚焦尺寸小（约200 nm）的特点，迅速成为激光诱变微生物获得优质菌株的一种新技术，具有潜在的、诱人的诱变效果，且人们已经应用飞秒激光诱变微生物得到了变异优质菌种[10]。

由于飞秒脉冲时间与微观生物化学反应过程时间相同，所以依靠超快过程能够彻底了解生物化学反应过程[11]。

该新技术利用飞秒激光高峰值功率、聚焦尺寸小的特点，能避免光学衍射极限，辐照微生物细胞时可以实现直接照射细胞靶点进行染色体定点切割[12]和单细胞显微操作[10]等。

另外，由于生物大分子和水几乎不吸收近红外光，应用近红外飞秒激光技术对微生物菌种进行诱变作用，可以在不损伤细胞活性的前提下，对微生物菌株进行飞秒激光诱变技术的研究[13]。

在飞秒激光诱变微生物机理研究方面，人们提出了许多不同的解释，虽然各自针对的生物化学过程不同，机理解释也有差别，但也形成了一些各不相同的、较成熟的机理解释，比如生物分子多光子吸收[14]、形成等离子体[15]、产生生物活性氧[16]、微生物细胞自身修复[17]等理论解释，但是缺乏唯一的、可信的飞秒激光诱变机理解释。

本文结合飞秒激光的特点和飞秒激光诱变微生物技术优势，围绕飞秒激光诱变微生物实验技术应用和机理的研究展开评述，并对该领域的研究进行了展望。

1 飞秒激光诱变微生物实验技术1.1 飞秒激光光束特点1981年，美国贝尔实验室的Fork等报道了脉冲碰撞锁模激光器的实验结果，将激光脉冲宽度推进到飞秒量级。

20世纪90年代以后，随着飞秒钛宝石（Ti∶Al2O3）激光器的研制成功，人们获得了峰值功率高、脉冲极短的飞秒激光，新一代光子晶体光纤飞秒激光研究也于2000年后蓬勃发展起来。

随着飞秒激光技术的发展，近红外飞秒激光在生物学上的应用日益增多[18]。

飞秒激光光束的特点主要有脉冲宽度短、瞬时功率大、聚焦尺寸小等，具体见表1所示。

1.2 飞秒激光诱变微生物技术优势飞秒激光光束有着与其它激光光束不同的特表1 飞秒激光光束的主要特点飞秒激光光束特点说明脉冲宽度短飞秒激光时间分辨率高，脉冲持续时间短，只有几个飞秒（1 fs＝10−15 s，光在1 fs 内传播的距离仅为0.3 μm，相当于光的波长，病毒的体长），属于生物化学反应时间范围。

瞬时功率大激光峰值功率极高，可达太瓦（1012 W）以上，经聚焦，峰值功率密度可达1018～1020 W/cm2，其强度超过了原子内部的库仑场，能将电子剥离，与生物组织作用产生等离子体。

聚焦尺寸小飞秒激光空间分辨率很高，它能聚焦到比头发的直径还要小的空间区域（约200 nm），可以进行微生物单细胞内细胞器的切割、移植、定点辐射等操作。

点，从而使其在微生物诱变方面有着独特的优势。

（1）脉冲时间与生物化学反应时间相同飞秒（10－15 s）超短的时间范围正好是基本的化学反应和分子内电子和原子核运动的时间范围，如化学反应中化学键的形成或断裂，分子重排形成新分子，能量从一个分子传递到另一个分子等过程。

随着Zewail[11]最早利用飞秒激光研究化学反应的动力学过程而被授予1999年的诺贝尔化学奖，人们已经在飞秒化学生物领域有了较大进步[19]，尤其飞秒技术已经被用于研究DNA中电荷传递及质子传递过程[20]。

所以超短飞秒脉冲辐射微生物细胞时能从微观角度影响到生物新陈代谢过程中各种生物化学反应，从而促进变异概率的提高。

（2）高能光子与生物组织作用强烈飞秒激光由于其高峰值功率，在与微生物细胞相互作用时引起细胞器或细胞内分子对激光能量的非线性吸收，这种非线性吸收在焦点处产生高激发的等离子体[15]。

由于在等离子体产生的过程中会产生活性自由基，它们易与细胞内的蛋白质、酶和DNA 发生化学反应，影响生物代谢，从而增强了变异的效果。

（3）DNA定点切除近红外飞秒激光系统（重复频率为80 MHz，波长为800 nm，能量2 nJ）已被用于破坏人类染色体上的高浓缩的DNA和单个伸展的DNA分子的染色体组[18]。

对于微生物（尤其原核生物）来说，由于DNA分子只有一条或者几条，又由于飞秒激光聚焦小，在显微镜下可以对化工进展2011年第30卷·826·微生物的DNA进行飞秒激光定点切除、移植等操作[12，21]。

此种方法针对性强、精确度高，使突变更有目的性，避免了目前大多激光诱变“黑箱子操作”的盲目性，能够有效的减少后续高通量筛选高产优质菌株的工作量。

（4）细胞损伤小大多数细胞在700～1100 nm 波长范围内吸收系数小，散射系数小，因而几乎是透明的，因此近红外飞秒激光对细胞的穿透深。

并且当飞秒激光聚焦于微生物细胞时，聚焦处的光强非常高，足以引起非线性吸收，但聚焦处附近的热影响非常小，飞秒激光对邻近细胞几乎没有损害（温度升高小于10－5 K）[22]，且不影响细胞活性，而紫外和可见光不仅穿透深度小，且对活细胞的损坏严重。

1.3 飞秒激光诱变微生物实验技术虽然飞秒激光在微生物诱变领域有很大的优势，但是，由于飞秒激光价格昂贵，实验环境及实验操作要求严格等因素，国内外关于飞秒激光诱变微生物获得高产优质菌株的实验技术还很少。

目前，据文献报道，飞秒激光诱变技术主要有以下成果。

（1）飞秒激光诱导细胞融合技术20世纪80年代中期，美国贝尔实验室的Ashkin等[23]发现，高度汇聚的高斯激光束能捕获单细胞，后来被发展为用于操作细胞和细胞器的工具——激光镊子。