聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离血清蛋白

聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离血清蛋白

[实验目的]

(1)学习聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳原理。

(2)掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。

(3)比较醋酸纤维薄膜电泳与聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离血清蛋白的操作效果。[实验原理]

带电质点在电场作用下，会向两极移动；带正电荷的移向负极，带负电荷的移向正极，这种现象称为电泳。

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在加速剂N，N，N'，N'—四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。

[实验试剂]

1、待测样品：新鲜血清

2、制备分离胶、浓缩胶有关试剂：

(1)凝胶缓冲液：称取1 mol/L HCl 48ml,Tris(三羟基氨基甲烷)36.6g,TEMED 0.23mL,加重蒸馏水至80mL 使其溶解，调pH8.9，然后加重蒸馏水定容至100mL ，至棕色瓶，冰箱储藏。

(2)分离胶贮液，一般有两种配法：

ⅰ28％Acr-0.735％Bis贮液：丙烯酰胺28.0克，甲叉双丙烯酰胺0.735克,加重蒸馏水使其溶解然后定容至100mL.

ⅱ30％Acr-0.8％Bis贮液:Acr30.0克,Bis0.8克,加重蒸馏水使其溶解定容至100mL.

以上两种溶液需用棕色试剂瓶盛放,4℃储存,一般可放置一个月左右.

(3)分析纯过硫酸铵(AP)(AR)0.14g加重蒸水100mL,棕色瓶,4℃储存仅能用一周,最好当天配置.上述三种试剂用于制备分离胶.

(4)浓缩胶缓冲液:称取1mol/LHCL48mL,Tris5.98g,TEMED 0.46mL,加重蒸水至80mL,调pH6.7,用重蒸水定容至100mL,棕色瓶4℃储存.

(5)浓缩胶贮液:称取Acr10g，Bis2.5g，加重蒸水溶解定容100mL，过滤后至棕色瓶4℃贮存。

(6)40％蔗糖溶液（W/V）

(7)核黄素4.0mg,加重蒸水溶解,定容至100mL,棕色瓶4℃贮存.以上(4)-(7)4种溶液用于配置浓缩胶.

3.Tris-甘氨酸电极缓冲液(pH8.3)

称取Tris 6.0g,甘氨酸28.8g,加蒸馏水至900mL,调pH之后定容至1000mL,4℃贮存,使用前稀释10倍.

4. 0.1％溴酚蓝指示剂.

5.染色液

染色液种类较多,染色方法也不完全相同,详细染色法如下:

本实验采用0.05％考马斯亮蓝R250染色液中,含20％磺基水杨酸,其优点是染色固定同时进行,背景易脱色.

0.05％考马斯亮蓝R250的20％磺基水杨酸染液:考马斯亮蓝0.05g,磺基水杨酸20g,加蒸馏水至100mL,过滤后至试剂瓶内保存.

6.脱色液

0.1mol/lNaCl溶液

7.保存液

甘油10mL,冰乙酸7mL,加蒸馏水至100mL

8.1％琼脂糖溶液

琼脂1g,加已稀释10倍的电极缓冲液,加热溶解,4℃贮存备用，使用时取出加热成液体，待稍微冷却后用胶头滴管吸取使用，胶头滴管使用完后立即清洗干净.

[实验仪器]

夹心式垂直板电泳槽，样品槽模板，直流稳压电源（电压300—600V，电流50—100mA），吸量管（1mL，5mL，10mL），烧杯，细长头滴管，1mL注射器及6号长针头，微量注射器，水泵或油泵，真空干燥器，培养皿（直径120mm），玻璃板，日光灯一台

[实验步骤]

一、安装夹心式垂直板电泳槽

夹心式垂直板电泳槽操作简单，不易渗漏，其装置如图

1.导线接头

2.下贮槽

3.凹形橡胶框 1.样品槽模板 2.长玻璃板

4.样品槽模板

5.固定螺丝

6.上贮槽 3.短玻璃板 4.凹形橡胶框

7.冷凝系统

各部件依下列顺序组装:

(1)装上贮槽和固定螺丝，勿使上下贮槽在外连通，使用橡皮管时用夹子夹住.

(2)玻璃板洗净后用吹风机吹干，清洗玻璃板时不得用刷子刷，可用纱布或海绵擦洗，

以免在玻璃表面上留下刮痕，清洗后不得用纸或布擦干，将长短玻璃板分别插在硅相框的凹形槽中，注意勿用手接触灌胶面的玻璃。

(3)将已插好玻璃板的橡胶框平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。

(4)将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线方式旋紧螺丝帽。

(5)竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅模框交界的缝隙内加入已融化的1％琼脂，其目

的是封住空隙，凝固后的琼脂应避免里面有气泡。

二、配胶

目前用于PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）凝胶贮液有30％Acr-0.8％Bis及28％Acr-0.735％Bis 2种，以它们为母液可以配置不同浓度的分离胶。

不同浓度的分离胶及浓缩胶配置方法见下表：

三、制备凝胶板

PAGE有连续体系和不连续体系，其灌胶方式不完全相同，分别叙述如下：

a)连续体系

本实验采用28％Acr-0.735％Bis 凝胶贮液，从冰箱取出各种贮液，平衡至室温后，按上表的配比配制20mL 7.0％凝胶。前三种溶液混合在一小烧杯内，（3）号液单独放置一小烧杯。二者抽气后混合均匀，立即用细长头滴管将分离胶溶液加到凝胶膜长、短玻璃板间的夹缝内，当加至距离短玻璃板上缘约0.5cm时，停止加胶，轻轻将样品槽模板（梳子）插入。

在上、下贮槽中倒入蒸馏水，液面不能超过上贮槽的短玻璃板，防止蒸馏水进入凝胶之中。

作用是增加压力，防止凝胶渗漏。凝胶液在混合后15min开始聚合，约30min-1h完成聚合作用。聚合后，在样品槽模板梳齿下缘与凝胶界面间有折射率不同的透明带。看到透明带后继续放置半小时，再用双手取出样品槽模板，动作要轻，用力均匀，以防弄破加样凹槽。凹槽中残留液体可用窄滤纸条轻轻吸取，切勿插进凝胶中，应保持加样槽凹面平整。放掉上、下贮槽中的蒸馏水，在上下两个电极槽倒入电极缓冲液，液面应没过短玻璃板上方约0.5cm。

b)不连续体系

不连续体系采用不同孔径及pH的分离胶与浓缩胶，凝胶制备分两步进行。

i.分离胶制备：根据实验要求，本实验需20mL pH8.9 7.0％PAA溶液，配置方法

见凝胶配置表。其加胶方式不同于连续体系。混合后的凝胶溶液，用细长头的

滴管加至长、短玻璃板的狭缝内，加至距离样品模板梳齿下端约1cm。用1mL

注射器在凝胶表面轻轻加一层重蒸馏水,用于隔绝空气,使胶面平整,为防止渗