6DNA重组技术
《DNA 重组技术的基本工具》 教学设计
《DNA 重组技术的基本工具》教学设计一、教学目标1、知识目标（1）简述 DNA 重组技术所需三种基本工具的作用。
（2）理解基因工程载体需要具备的条件。
2、能力目标（1）通过对 DNA 重组技术基本工具的学习，培养学生的分析和归纳能力。
（2）通过小组讨论和合作学习，提高学生的团队协作和交流能力。
3、情感目标（1）认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。
（2）关注基因工程的发展，激发学生对生物技术的兴趣和探索欲望。
二、教学重难点1、教学重点（1）DNA 重组技术中限制性核酸内切酶、DNA 连接酶的作用。
（2）基因进入受体细胞的载体的作用和特点。
2、教学难点（1）限制性核酸内切酶切割 DNA 分子的特点。
（2）DNA 连接酶的作用部位和连接方式。
三、教学方法讲授法、直观演示法、讨论法四、教学过程1、导入新课通过展示一些基因工程应用的实例，如转基因抗虫棉、胰岛素的生产等，引起学生的兴趣，提出问题：这些基因工程产品是如何产生的？从而引出 DNA 重组技术的基本工具这一主题。
2、限制性核酸内切酶（1）展示限制性核酸内切酶的作用示意图，讲解其来源和作用。
（2）以具体的 DNA 序列为例，演示限制性核酸内切酶的切割过程，强调其特异性。
（3）引导学生思考：限制性核酸内切酶切割后的 DNA 片段有什么特点？3、 DNA 连接酶（1）对比限制性核酸内切酶的作用，讲解 DNA 连接酶的作用。
（2）展示 DNA 连接酶连接 DNA 片段的示意图，说明其连接的部位和方式。
（3）组织学生讨论：DNA 连接酶与 DNA 聚合酶有什么区别？4、基因进入受体细胞的载体（1）介绍载体的作用，引导学生思考为什么需要载体将基因导入受体细胞。
（2）展示常见的载体，如质粒、噬菌体和动植物病毒等，讲解其结构和特点。
（3）让学生分组讨论：作为载体需要具备哪些条件？5、课堂小结（1）回顾 DNA 重组技术的三种基本工具及其作用。
（2）强调这三种工具在基因工程中的重要性和相互关系。
DNA重组的原理
DNA重组的原理
DNA重组是一种实验技术，用于将来自不同来源的DNA片段重新组合在一起形成新的DNA分子。
它的原理基于DNA的
双链结构和其特有的互补碱基配对规则。
首先，需要获取来自不同来源的DNA片段。
这些片段可以来
自同一生物体的不同基因，也可以来自不同生物体的DNA。
每个DNA片段都有自己特定的基因序列。
接下来，将目标DNA片段和载体DNA准备好。
载体DNA是
一个可以自我复制的DNA分子，常用的载体有质粒和噬菌体。
目标DNA片段和载体DNA都需要进行酶切，使用特定的限
制酶将它们切割成互补的DNA末端。
然后，将目标DNA片段和载体DNA连接在一起。
这一步需
要使用DNA连接酶，将目标DNA片段和载体DNA的互补末
端连接起来，形成一个新的DNA分子。
连接的过程中会形成
磷酸二酯键。
最后，将重组后的DNA分子导入宿主细胞中。
这可以通过转
化或转染的方法实现。
宿主细胞会接受重组后的DNA，并将
其复制和传递给子细胞，从而产生大量拥有重组DNA的细胞。
通过DNA重组，可以将不同基因或DNA片段组合在一起，
创建新的DNA分子。
这项技术被广泛应用于基因工程、遗传
学研究以及生物制药等领域。
重组dna技术的主要步骤
重组dna技术的主要步骤重组DNA技术的主要步骤引言：重组DNA技术是一种重要的生物技术，它可以改变生物体的遗传信息，为人类的科学研究和生产带来了巨大的便利。
本文将介绍重组DNA技术的主要步骤，包括DNA提取、限制酶切割、连接反应、载体转化和筛选等。
通过合理的组织和流畅的叙述，读者将能够清晰地了解重组DNA技术的整个过程。
一、DNA提取DNA提取是重组DNA技术的第一步，它的目的是从生物体中获取所需的DNA片段。
通常采用的方法有物理法和化学法。
物理法是通过机械破碎和离心等手段将细胞破裂，然后用溶液提取DNA。
化学法则是利用细胞膜的溶解特性和DNA的溶解性，在适当的缓冲液中加入酶和溶剂，将DNA从细胞中释放出来。
无论是哪种方法，DNA 提取的关键在于保持DNA的完整性和纯度。
二、限制酶切割限制酶切割是重组DNA技术的核心步骤之一。
限制酶是一类能够识别特定的DNA序列并切割它们的酶，它们可以将DNA分子切割成特定的片段。
在限制酶切割过程中，需要选择适当的限制酶，并在合适的温度和pH值下进行反应。
通过限制酶切割，可以获得具有特定序列的DNA片段，为后续的连接反应提供基础。
三、连接反应连接反应是将目标DNA片段与载体DNA连接在一起的过程。
在连接反应中，需要使用DNA连接酶将目标DNA片段与载体DNA的末端连接起来。
连接酶会识别DNA的末端序列，并在适当的条件下进行连接。
连接反应的成功与否直接影响到重组DNA技术的后续步骤和效果。
四、载体转化载体转化是将重组DNA导入到宿主细胞中的过程。
通常采用细菌作为宿主细胞，因为细菌具有较高的转化效率和较好的生长条件。
在载体转化过程中，需要将重组DNA与宿主细胞共孵育，并通过适当的操作使重组DNA进入细菌细胞内。
转化成功后，细菌细胞将能够表达重组DNA所携带的目标基因，并产生相应的蛋白质。
五、筛选筛选是重组DNA技术的最后一步，它的目的是从转化后的细菌中筛选出含有目标基因的克隆。
酶切与DNA重组技术
酶切与DNA重组技术DNA重组技术是一种用于改变DNA序列的方法，广泛应用于生物学研究、基因工程和医学诊断等领域。
而酶切是DNA重组技术中的一项重要步骤，主要是指利用特定酶将DNA分子从一个位置切割并插入到另一个DNA分子中。
本文将详细阐述酶切与DNA重组技术的原理和应用。
一、酶切的原理酶切是利用酶的特异性识别和切割DNA的特性进行的。
常用的酶是限制酶（restriction enzyme），也称为限制性内切酶。
限制酶能够识别DNA分子中的特定序列，并在该序列特定位置切割DNA分子，产生具有粘性末端（sticky end）或平滑末端（blunt end）的DNA片段。
粘性末端具有互补碱基序列，能够与其他具有相同互补序列的DNA片段连接，从而形成重组DNA分子。
二、酶切与DNA重组技术的步骤酶切与DNA重组技术通常分为以下几个步骤：1. DNA提取：首先从待处理的样本中提取DNA，可以使用不同的方法，如化学法、机械法或热变性法等。
2. 选择适当的酶：根据实验的需要选择适当的限制酶。
限制酶具有不同的切割位点，因此选择合适的酶对于实现特定的DNA重组目标非常重要。
3. 酶切反应：将所选酶与DNA反应，通常在一定的温度和缓冲液条件下进行。
酶切反应时间一般为数小时至过夜，以确保酶能够充分切割DNA。
4. 凝胶电泳：将酶切后的DNA样品进行凝胶电泳分析，可以根据DNA片段的大小和形态来检测酶切效果。
5. DNA重组：将所需的DNA片段与其他DNA分子进行连接，形成重组DNA。
常用的方法有连接酶催化的连接反应、PCR扩增等。
6. 转化：将重组DNA导入到宿主细胞中，使其在细胞内复制和表达。
常用方法有化学转化、电转化和冷冻复苏等。
三、酶切与DNA重组技术的应用酶切与DNA重组技术在生物学研究和基因工程领域有着广泛的应用，包括以下几个方面：1. 基因克隆：酶切与DNA重组技术是基因克隆的核心方法之一，可用于分离、纯化和扩增特定基因。
DNA重组技术
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② 工具酶
DNA重组技术中对DNA的“精雕细刻”主要用酶作 为工具。分子生物学研究过程中发现的酶，许多 都用作工具，所以称在核酸及有关研究中像基本 工具一样不可缺少的酶类为工具酶。这类酶包括 限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、末 端修饰酶、RNA聚合酶、逆转录酶等。
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限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
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PCR 的特点及应用： PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和 量要求低。因此，广泛应用于许多领域。 1. 基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外 获得突变体、提供大量DNA用于测序等； 2. 遗传病的产前诊断； 3. 致病病原体的检测； 4. 癌基因的检测和诊断； 5. DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证； 6. 动、植物检疫； 7. 在转基因动植物中检查植入基因的存在。
限制性核酸内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶， 可以识别并切开核酸序列特定位点——分子手术刀； 是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。 是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚 合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶； 限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且 与电泳技术相结合还可以用于基因组酶切图谱的鉴定 以及法医鉴定等。 Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开 创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。 13
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6 重组体的转化及鉴定
转化 转化过程是指将DNA重组体或质粒转到适宜的宿主细 胞中。通过这个过程，使目的基因片段得到大量扩 增、或产生需要的基因表达产物、或使宿主生物具 备所需的性状，同时目的基因还能在宿主细胞中稳 定遗传。 若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对 转化的大肠杆菌进行扩大培养使目的基因大量表达 和积累。通过对表达产物分离纯化便可获得想要的 产品。
DNA重组技术的基本步骤
DNA重组技术的基本步骤DNA重组技术是一种将不同源的DNA片段通过特定的操作方法进行拼接和重组的技术。
它是现代生物技术和基因工程的重要基础技术，被广泛应用于生物医学研究、农业育种、环境保护等领域。
下面是DNA重组技术的基本步骤：1.DNA提取：首先需要从所需的生物样品（例如细菌、动物、植物等）中提取出DNA分子。
常用的DNA提取方法包括酚/氯仿法、盐析法、商业化试剂盒法等。
2. DNA剪切：将目标DNA分子和DNA切割酶一起反应，酶会将DNA分子切割成多个较短的DNA片段。
常用的DNA切割酶有限制性内切酶（restriction enzyme），它能识别特定的DNA序列并在该序列上切割。
3.凝胶电泳：将DNA片段通过凝胶电泳技术进行分离和纯化。
通常使用琼脂糖凝胶，将DNA样品在凝胶槽中进行电泳，通过电流和凝胶孔径的作用使DNA片段按照大小分离排列，大的片段迁移慢，小的片段迁移快。
4.DNA连接：通过DNA连接酶将目标DNA片段进行连接。
连接酶能够将两端具有互补序列的DNA片段连接在一起，形成一个完整的DNA分子。
常用的连接酶有DNA连接酶I和T4DNA连接酶。
5.DNA转化：将连接后的DNA分子转化到宿主细胞中，使其在宿主细胞内进行进一步的复制和表达。
转化的方法多种多样，包括化学转化、电击转化、病毒载体介导转化等。
6.筛选和鉴定：筛选出含有目标DNA的转化细胞。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选、PCR扩增等。
鉴定转化细胞中的目标DNA是否成功插入、并且插入位置正确也是重要的一步。
7.DNA放大和纯化：将含有目标DNA的转化细胞进行大规模培养，使其扩增产生足够多的DNA。
然后通过DNA纯化方法，如离心、酚/氯仿法、硅胶柱层析法等，从大量产生的DNA中纯化出目标DNA。
DNA重组技术的基本步骤主要是DNA提取、DNA剪切、凝胶电泳、DNA连接、DNA转化、筛选和鉴定、DNA放大和纯化等。
各个步骤都需要精确和细致的操作，以确保目标DNA能够被有效地插入宿主细胞并得到高效表达。
DNA重组的主要步骤
DNA重组的主要步骤
DNA重组是指通过分离、移植和修饰DNA序列来改变基因组的过程。
主要步骤如下:
1.DNA分离: 通过酶切、洗脱或电泳等方法将所需
的DNA片段从基因组中分离出来。
2.DNA连接: 使用酶如连接酶或DNA连接酶将所
需的DNA片段连接在一起。
3.DNA克隆: 将连接好的DNA片段插入到载体中，
如质粒或菌系，进行DNA克隆。
4.DNA纯化: 从质粒或菌系中纯化出重组DNA。
5.DNA检测: 通过测序、质粒分析或其他方法检测
重组DNA的纯度和完整性。
6.DNA应用: 将重组DNA应用于基因疗法、基因
工程、药物研发等领域。
重组技术是基因工程的基础，广泛应用于生物医药、农业等领域。
在这个过程中，需要使用高纯度DNA质粒和严格的操作条件来保证重组DNA的质量。
7.DNA转化：将重组DNA转化为目标细胞，使之
能够生长和繁殖。
8.筛选：筛选出含有目标基因的细胞。
9.验证：使用多种方法（如Southern南方杂交、PCR
聚合酶链反应等）来验证重组DNA的纯度和完整性。
10.应用：将重组DNA应用于基因疗法、基因工程、
药物研发等领域。
DNA重组技术是一种高精度的分子生物学技术，可以通过改变基因组结构来改变生物体的性状。
这项技术在基因疗法、基因工程、药物研发、农业等领域都有着重要应用。
在进行DNA重组时，需要严格遵循实验流程和操作规范，避免误操作。
DNA重组技术
第五章DNA重组技术DNA重组技术是指在体外将目的DNA片段与质粒（plasmid）等能够自主复制的载体（vector）连接形成重组DNA分子，再导入合适的受体细胞。
由于重组DNA可以在受体细胞中复制，目的DNA片段同时也可以扩增获得大量拷贝，因此这项技术也被称为分子克隆（molecluar cloning）。
与PCR技术相比，通过分子克隆得到的拷贝错误率更低，并且获得重组DNA的受体细胞可以无限传代，目的片段可以更长久的保存，并能进行筛选、突变、融合、序列分析等一系列基因操作。
此外，如果载体在插入目的基因的区域具有合适的启动子、核糖体结合位点、转录终止子等序列，目的DNA片段所含基因还有可能能在受体细胞中大量表达，获得目的蛋白或其它表达产物。
通过DNA重组技术表达的蛋白又称为重组蛋白。
目前，DNA重组技术在基础研究、基因诊断、生物制药、基因治疗等方面都得到广泛的应用。
第一节DNA重组技术的常用工具酶在DNA重组技术中，需要利用一些酶来对基因进行操作，我们可以把这些酶称为工具酶。
工具酶的用途涵盖DNA重组技术的各个方面，包括目的DNA的获得、DNA的切割、片段的连接等。
一、目的DNA获得相关工具酶在DNA重组技术中，目的DNA的获得有多种方法。
其中通过酶扩增来获得是重要的一类方法，其中需要多种工具酶。
（一）Klenow片段Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，是DNA聚合酶I通过木瓜蛋白酶部分水解得到的大片段，保留了DNA聚合酶I的5’-3’的聚合和3’-5’的核酸外切酶的活性，去除了5’-3’的核酸外切酶活性。
Klenow片段可用于在体外扩增DNA片段。
由于其具有3’-5’的核酸外切酶活性，因此可以校正聚合中可能出现的错误，具有一定的保真性。
但由于其不耐热，聚合活性弱，在体外合成DNA的效率较低，随着PCR技术的发展，Klenow片段的应用已日趋减少。
现主要用于DNA双链末端的补齐和标记操作。
重组DNA技术在药物生产中的应用
重组DNA技术在药物生产中的应用重组DNA技术是指通过人工手段将不同来源的DNA片段或基因序列重新组合，形成新的DNA片段或融入到宿主细胞中，以实现特定功能的技术方法。
这项技术的应用范围广泛，其中之一就是在药物生产领域。
本文将重点介绍重组DNA技术在药物生产中的应用。
药物基因工程药物基因工程是指利用重组DNA技术来生产具有治疗或预防疾病能力的药物。
通过对目标基因的克隆、重组和表达等步骤，可以获得大量纯化的药物蛋白。
以下将介绍几个药物基因工程的具体应用案例。
1. 重组人胰岛素胰岛素是治疗糖尿病的常用药物，传统上是从牛或猪胰腺中提取得到。
然而，由于这些动物源性胰岛素可能引发过敏反应，并且提取量有限，因此科学家利用重组DNA技术成功地将人类胰岛素基因插入大肠杆菌中，在大规模发酵过程中合成了大量纯化的重组人胰岛素。
2. 重组人生长激素生长激素是一种调节人体生长和代谢的激素。
利用重组DNA技术，科学家将人生长激素基因插入大肠杆菌中，并通过发酵过程合成了纯化的重组人生长激素。
这种方法不仅提高了生长激素的产量，还避免了使用动物来源的生长激素可能产生的安全问题。
3. 重组抗体抗体是一种能够识别并结合特定抗原的蛋白质分子。
传统上，抗体需要从动物中获取或使用杂交瘤细胞进行生产。
然而，这些方法存在一些局限性，如来源有限、无法大规模生产等。
利用重组DNA技术，可以通过人工合成目标抗体的基因序列，并将其插入哺乳动物细胞中表达，从而实现大规模制备高效纯化的抗体。
要点总结重组DNA技术在药物生产中具有广阔应用前景。
通过克隆、重组和表达目标基因序列，可以实现大规模制备具有治疗或预防疾病能力的药物蛋白。
其中包括重组人胰岛素、重组人生长激素以及重组抗体等药物。
这种方法不仅提高了药物产量，还降低了制备成本，并且避免了使用动物源性药物可能带来的安全问题。
随着科学技术的不断发展和深入研究，相信重组DNA技术在药物生产领域的应用还将不断扩大，并给医药行业带来更多革命性变革。
分子生物学技术之DNA重组技术
书山有路勤为径， 学海无涯苦作舟
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书山有路勤为径， 学海无涯苦作舟
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•大肠杆 菌 pSC101 质粒载体 示意图。
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•是第一个真核基因克隆载体。缺点：它是一种 严紧型复制控制的低拷贝质粒，从带有该质粒 的寄主细胞中提取pSC101 DNA，产量很低。
书山有路勤为径， 学海无ห้องสมุดไป่ตู้苦作舟
•
• 2、ColE1质粒载体
•第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在 1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序 列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生 具有粘性末端的小片段。
书山有路勤为径， 学海无涯苦作舟
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•图5-1 几种主要DNA内切酶所识别的序列及
其酶切末端。
书山有路勤为径， 学海无涯苦作舟
•
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• 松弛型复制控制的多拷贝质粒。
• 一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或 是在细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质 的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制， 细胞的生长也随之停止。
• 而松弛型质粒DNA却继续复制数小时，使每
个寄主细胞中ColE1质粒的拷贝数达到
1000~3000个，占细胞总DNA的50%左右。
书山有路勤为径， 学海无涯苦作舟
•
•AmpR
书山有路勤为径， 学海无涯苦作舟
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•优点是具有较小的分子量，其长度为4 363bp。 不仅易于纯化，而且即使携带上一段6-8kb的外 源DNA片段，操作起来仍较为便利。
•具有两种抗生素抗性基因以用作转化子的选择 记号。有较高的拷贝数，若经过氯霉素扩增， 每个细胞中可累积1000~3000个拷贝，为重组体 DNA的制备提供了极大的方便。
生物技术知识点
生物技术知识点生物技术是一门综合性的学科，涉及生物学、化学、物理学等多个学科的知识。
它利用生物体的自然功能和生物体的特殊性质，通过改变生物体的遗传物质和代谢过程，来实现对生物体的改良、利用和控制。
下面将介绍几个生物技术的重要知识点。
1. DNA重组技术DNA重组技术是生物技术的核心技术之一。
它通过将来自不同生物体的DNA片段进行切割、连接和复制，实现对DNA的重组。
这样可以将具有特定功能的基因导入到目标生物体中，使其表达出所需的特性。
DNA重组技术在农业、医学和工业等领域具有广泛的应用，如转基因作物的培育、基因治疗和生物制药等。
2. PCR技术PCR（聚合酶链式反应）技术是一种快速、高效的DNA复制技术。
它通过反复进行DNA的变性、引物结合和DNA合成，可以在短时间内扩增特定的DNA片段。
PCR技术在分子生物学研究、疾病诊断和法医学等领域有着重要的应用，如DNA指纹鉴定和病原体检测等。
3. 基因测序技术基因测序技术是对生物体遗传物质（DNA或RNA）进行测序的技术。
它通过对DNA或RNA的序列进行分析，可以揭示生物体的遗传信息和功能。
随着测序技术的不断发展，高通量测序技术的出现使得大规模基因组测序成为可能，推动了基因组学和生物信息学的发展。
4. 细胞培养技术细胞培养技术是将细胞从体内或体外分离出来，在含有营养物质和适宜环境条件的培养基中进行培养和繁殖的技术。
细胞培养技术广泛应用于细胞生物学、生物医学研究和生物制药等领域。
它不仅可以研究细胞的生理功能和代谢过程，还可以用于生产重组蛋白和病毒疫苗等生物制品。
5. 蛋白质工程技术蛋白质工程技术是通过改变蛋白质的氨基酸序列和结构，来改变其功能和性质的技术。
蛋白质工程技术在药物研发、酶工程和生物催化等领域有着广泛的应用。
通过蛋白质工程技术，可以设计和合成具有特定功能的蛋白质，用于治疗疾病、生产工业化合物和改良农作物等。
6. 基因编辑技术基因编辑技术是一种精确修改生物体基因组的技术。
(参考)基因工程 第六章 DNA重组的操作
(三) 酶联免疫吸附测定（ELISA） Enzyme-linked immunosorbant assay 1. 原理：
一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。
2. 酶联（enzyme-link）： 二抗上携带一种酶能催 化无色底物转变为有色的物质（或发光），再通 过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而
其中载体介导的转化方法是目前植物基因工程中使用最多、 机制最清楚、技术最成熟的一种转化方法，而转化载体中 又以Ti质粒转化载体最为重要。
26
（三）重组DNA导入动物细胞
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 磷酸钙沉淀法 脂质体介导感染法 显微注射法 病毒感染法 DEAE葡聚糖转染技术 电击法 血影细胞介导法
为了克服以上弊端，目前对平末端连接常采用同 聚物加尾法、衔接物连接法和DNA接头连接法等改 进方法。
9
三、PCR产物的连接
PCR扩增是获得目的基因的重要途径 PCR产物的连接是基因工程实验中经常性的工作， 其主要方法有：
引入酶切位点克隆法、T-A克隆法和平末端克隆法等
10
（一）引入酶切位点连接法
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电转化的原理图（引自孙明，2006）
22
（二）感染 将以λ噬菌体DNA为载体的DNA重组分子包装成病毒 颗粒，使其感染受体菌的过程称为感染，由噬菌体 和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导 （transduction）
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二、重组DNA导入真核细胞的方法
常用的方法有电击法、磷酸钙沉淀法、脂质体 介导法等； 进入细胞的DNA可以被整合至宿主细胞的基 因组中，也可以在染色体外存在和表达。
重组dna技术的原理
重组dna技术的原理重组DNA技术是一种将不同来源的DNA片段重新组合的方法，其原理基于DNA的两个重要特性：互补性和酶的活性。
互补性是指DNA的互补碱基配对原则，即腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）之间存在双氢键，而鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）之间也存在双氢键。
这种互补性使得两根DNA链可以通过碱基配对重新组合。
例如，两条DNA链的序列分别为A-T-G-C和T-A-C-G，它们可以通过配对形成新的DNA链，序列为A-T-G-C-C-G-A-T。
酶的活性是重组DNA技术中另一个关键原理。
DNA中存在一种叫作限制性内切酶的酶，它可以识别特定的DNA序列，并将这些序列切割成片段。
这些限制性内切酶通常会在特定的位点产生突变，切割DNA链，形成“黏性末端”或“平滑末端”。
黏性末端是指DNA链断裂后，在切割位点处留下不平整的末端。
两个黏性末端可以通过互补性碱基配对重新连接，在连接过程中酶称为DNA连接酶起到粘合效果，形成一个新的DNA链。
平滑末端是指DNA链断裂后，在切割位点处形成平滑的末端。
平滑末端可以通过DNA连接酶直接粘合。
这些末端的形成允许不同来源的DNA片段重新组合。
基于以上原理，重组DNA技术主要包括以下步骤：1. 利用限制性内切酶切割目标DNA和载体DNA：使用特定的酶切割目标DNA和载体DNA，形成黏性末端或平滑末端。
2. 进行DNA连接：将目标DNA和载体DNA混合，通过互补性碱基配对和DNA连接酶的作用，使碱基序列相互连接，形成重组DNA。
3. 转化重组DNA：将重组DNA导入到宿主细胞中，使其在宿主细胞内进行复制和表达。
通过重组DNA技术，可以实现将外源DNA片段插入到目标位点，从而产生不同的基因组组合，用于研究、治疗或生产等领域。
重组dna技术基本步骤
重组dna技术基本步骤重组DNA技术基本步骤DNA（脱氧核糖核酸）是生物体内的遗传物质，它携带着生物体的遗传信息。
重组DNA技术是一种通过人工手段改变DNA序列的方法，被广泛应用于基因工程、医学研究和农业领域。
本文将介绍重组DNA技术的基本步骤。
1. DNA提取重组DNA技术的第一步是从源生物体中提取DNA。
常用的提取方法包括细胞裂解、蛋白酶处理、乙醇沉淀等。
提取得到的DNA需要经过纯化步骤，去除杂质和其他有机物。
2. DNA切割DNA切割是将DNA分子切割成特定的片段，以便进行后续的操作。
切割DNA的工具是限制性内切酶，这是一种具有特异性的酶，能够识别特定的DNA序列并切割它们。
通过选择不同的限制性内切酶，可以得到具有不同长度和不同序列的DNA片段。
3. DNA连接DNA连接是将两个不同的DNA片段连接在一起，形成重组DNA 分子。
连接需要使用DNA连接酶，它能够将DNA片段的末端粘性（sticky）或平滑（blunt）端连接起来。
连接的DNA片段可以来自同一源生物体或不同生物体。
4. DNA转化DNA转化是将重组DNA导入到目标细胞中。
目标细胞可以是细菌、酵母或其他真核生物细胞。
转化的方法有多种，包括热冲击法、电穿孔法和化学法等。
转化成功后，目标细胞会获得重组DNA并将其复制和表达。
5. 重组DNA筛选为了筛选出带有重组DNA的目标细胞，通常需要在培养基中加入适当的选择性抗生素或标记物。
只有带有重组DNA的细胞才能够生长和繁殖，从而实现对重组DNA的筛选。
6. DNA测序DNA测序是确定DNA序列的方法，它可以帮助确认重组DNA是否成功。
常用的DNA测序方法包括Sanger测序和新一代测序技术。
通过测序，可以获得重组DNA的准确序列信息。
7. DNA克隆重组DNA技术最终的目的是获得大量相同的重组DNA分子。
为了实现这一点，可以将重组DNA导入到合适的宿主细胞中进行克隆。
克隆的方法包括质粒克隆和基因组克隆等。
重组dna技术的主要步骤
重组dna技术的主要步骤重组DNA技术的主要步骤引言：重组DNA技术是一种革命性的生物技术，它使科学家能够通过改变生物体的遗传物质，创造出具有特殊功能的生物体。
这项技术在农业、医学和工业等领域具有巨大的潜力，可以解决许多现实世界的问题。
本文将介绍重组DNA技术的主要步骤，以及其在不同领域的应用。
一、DNA提取重组DNA技术的第一步是从生物体中提取DNA。
DNA可以从细胞核、线粒体或叶绿体等细胞器中提取。
提取DNA的方法通常包括细胞破碎、蛋白质消化以及DNA纯化等过程。
通过这些步骤，可以获得纯净的DNA样本，为后续的实验做好准备。
二、DNA切割DNA切割是重组DNA技术中的关键步骤之一。
科学家使用限制性内切酶来切割DNA，这些酶具有特异性，只能识别并切割特定的DNA序列。
通过切割，可以将DNA分成多个片段，为后续的重组提供更多的选择。
三、DNA连接DNA连接是将DNA片段重新组合的过程。
这一步骤通常涉及到DNA连接酶，它能够将DNA片段粘合在一起。
科学家可以选择连接同一生物体的DNA片段，也可以选择连接不同生物体的DNA片段，以创建新的组合。
四、DNA转化DNA转化是将重组DNA导入目标细胞的过程。
这一步骤可以通过多种方法实现，如电穿孔、热冲击和化学处理等。
转化后的细胞中将包含重组DNA，并且这些细胞将会成为新生物体的一部分。
五、筛选与鉴定在DNA转化后，科学家需要对细胞进行筛选和鉴定，以确定是否成功引入了重组DNA。
通常，这个过程包括筛选标记基因的表达、PCR检测和DNA测序等步骤。
通过这些鉴定方法，科学家可以确定重组DNA是否被正确引入，并对其进行进一步的研究。
六、应用领域重组DNA技术在多个领域具有广泛的应用。
在农业领域，它可以用于改良作物的抗病性、耐逆性和产量等特性。
在医学领域，它可以用于生产重要药物、疫苗的研发以及基因治疗等。
在工业领域，它可以用于生产生物燃料、酶和其他化学品等。
结论：重组DNA技术是一项强大的工具，它可以改变生物体的遗传特性，并为解决现实世界的问题提供了新的途径。
DNA重组技术实验报告
一、实验名称：重组DNA技术二、实验目的：1.了解掌握DNA重组技术理论基础；2.掌握质粒载体、外源DNA的准备、酶切、连接技术方法；3.掌握连接产物的转化方法及操作；4.掌握阳性重组体的的鉴定和筛选方法；三、实验原理:1.重组DNA技术重组DNA技术是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新特性的生物类型的技术。
它主要包括以下几个步骤：①目的基因的获取：主要有化学合成、PCR、基因组文库、cDNA文库构建等。
cDNA文库是以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有cDNA信息，总称cDNA文库。
常用于筛选编码蛋白质的结构基因。
基因组DNA文库是利用限制性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有基因组DNA信息，因此称为基因组DNA文库。
②基因载体的选择与构建：常用载体有质粒、噬菌体、病毒DNA等。
分为克隆载体和表达载体。
克隆载体：用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外定点突变等。
表达载体：用于在宿主细胞中表达外源目的基因，获得大量表达产物。
选择好的载体与目的基因利用限制性内切酶切割成合适片段。
③目的基因与载体的拼接：通过粘性末端连接法（同源互补粘性末端连接、非同源互补粘性末端连接）、平端连接、人工接头连接、同聚物接尾、经部分补平的不匹配末端的连接等将目的基因与载体进行连接。
④重组DNA分子导入受体细胞：将连接有目的DNA的载体导入宿主细胞，主要有以下几种方法：a、转化：将质粒或其它外源DNA导入宿主细胞(常用大肠杆菌)，并使其获得新的表型的过程。
b、转染：将外源DNA导入真核细胞的过程。
c、感染：以λ噬菌体、柯斯质粒和病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。
重组dna技术的步骤
重组dna技术的步骤重组DNA技术是一种在实验室中改变生物体遗传信息的方法。
它可以用于研究基因功能、生物制药和农业改良等领域。
下面将介绍重组DNA技术的步骤。
1. DNA提取重组DNA技术的第一步是从目标生物体中提取DNA。
这可以通过不同的方法来实现，例如使用细胞裂解液将细胞壁和细胞膜破坏，释放出DNA分子。
然后，通过离心等技术将DNA分离出来。
2. DNA切割切割DNA是重组DNA技术的关键步骤。
在这一步骤中，使用特定的酶，称为限制性内切酶，来切割DNA分子。
限制性内切酶能够识别特定的DNA序列，并在该序列上切割DNA分子。
通过选择不同的限制性内切酶，可以获得具有不同限制性内切位点的DNA片段。
3. DNA连接在DNA切割之后，需要将不同的DNA片段连接起来。
为了实现这一步骤，使用DNA连接酶将切割得到的DNA片段连接在一起。
DNA连接酶能够识别DNA片段的粘性末端，并在这些末端之间形成磷酸二酯键，将DNA片段连接在一起。
4. DNA转化DNA转化是将重组的DNA导入到宿主细胞中的过程。
这一步骤通常使用细菌作为宿主细胞。
首先，需要将DNA转化宿主细胞的能力引入到细菌中，这可以通过将宿主细胞暴露于高浓度的钙离子溶液中来实现。
然后，将重组的DNA与转化宿主细胞一起处理，使DNA能够进入细菌细胞内。
5. 筛选与鉴定在DNA转化之后，需要对转化的细菌进行筛选与鉴定。
为了实现这一步骤，可以通过选择性培养基，筛选出带有重组DNA的细菌。
此外，还可以使用PCR等方法来检测是否成功插入了目标DNA。
6. DNA复制在筛选与鉴定之后，需要进行DNA复制，以获得足够数量的重组DNA。
这可以通过培养细菌细胞并使其进行快速分裂来实现。
然后，通过离心等技术将细菌细胞分离出来，并提取其中的DNA。
7. 应用与分析重组DNA技术得到的重组DNA可以应用于不同的领域。
例如，在基因功能研究中，可以将重组DNA导入到相关细胞中，观察其对细胞功能的影响。
基因重组技术的原理和应用
基因重组技术的原理和应用原理1.DNA分子的片段切割：–利用限制酶（restriction enzyme）将DNA分子切割成碱基序列特定的片段。
2.DNA的连接：–利用DNA连接酶（DNA ligase）将不同来源的DNA片段连接起来，形成重组DNA。
3.DNA的复制：–利用聚合酶（polymerase）在合适的温度和条件下，在DNA 链的两端合成新的DNA链，形成双链DNA。
4.载体DNA的选择：–选择合适的载体，如质粒（plasmid）或病毒，将重组DNA插入其中。
5.载体DNA的转化：–将重组DNA导入宿主细胞中，如大肠杆菌，让宿主细胞表达重组DNA。
应用1.生物制药：–利用基因重组技术生产重组蛋白质，如胰岛素、生长激素等，用于治疗疾病。
–制备疫苗，如乙肝疫苗、人乳头瘤病毒疫苗等。
2.农业改良：–利用基因重组技术改良农作物，提高产量和品质，增加抗病虫害能力，如转基因水稻、玉米等。
–创造转基因植物，使其具备抗旱、抗盐等特性。
3.环境修复：–利用基因重组技术修复受污染的环境，如通过基因重组的微生物清除水体中的重金属和有机物。
4.疾病诊断和治疗：–利用基因重组技术开发创新的诊断方法，如PCR技术用于检测基因突变和感染病原体。
–利用基因重组技术研发新的基因治疗方法，如基因编辑技术用于修复遗传疾病。
5.科学研究：–利用基因重组技术揭示生物体的基因结构和功能。
–开展基因组学研究，如人类基因组计划。
结论基因重组技术的原理和应用广泛而重要。
通过切割和连接DNA分子片段，重组DNA的制备成为可能。
基因重组技术在生物制药、农业改良、环境修复、疾病诊断和治疗以及科学研究等领域有着重要的应用。
它正在推动着科学的进步，为人类的健康和发展做出了巨大贡献。
6DNA重组
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32
如果选择裂解途径，噬菌体会在较短的时 间内通过滚环复制大量增值，并导致宿主 菌裂解；
如果是溶源途径，噬菌体DNA就以位点特 异性的重组整合到宿主染色体DNA上，进 入到原噬菌体状态。在这期间，噬菌体几 乎所有的基因都不表达。
*
图6-11 λ噬菌体的位点特异性整合
34
图6-12 λ噬菌体重组整合或切除时切点的序列
17
图6-5 RecBCD酶的在同源重组中的作用
产生单链DNA，为RecA发挥作用创造条
件，* 由此最终起动了链交换和重组反应
18
χ序列是一段特殊的碱基序列，其一致序列 是5′- GCTGGTGG-3′，它的存在能显著 提高重组的频率。在重组中的作用是调节 RecBCD的酶活性，刺激RecBCD重组途径
一些从前从未想过的事情的能力。”
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7
制造设计基因组的技术未来可能会带来非 常可观的裨益：
用来制造人们目前意想不到的替代 能源， 像纯粹用蔗糖分解的丁烷和丙烷；
或者创造出能吸收二氧化碳的细菌，以纾 缓全球暖化。
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8
同源重组（homologous recombination）也称 为一般性重组（general recombination），它 是一种在两个DNA分子的同源序列之间直 接进行交换的重组形式。
protease）促进LexA 蛋白的自水解。
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图6-4 RecA蛋白促进2个双链DNA分子链之间的交换
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16
（二）RecBCD蛋白
又称为RecBCD酶，由RecB、RecC和RecD三 个亚基组成，具有5种酶的活性，即外切核 酸酶V、解链酶、核酸内切酶、ATP酶和单 链DNA外切酶。
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二、DNA重组技术的基本过程
目的基因的获取（分）
克隆基因载体的选择与构建（切） 目的基因与载体的连接 （接） 重组DNA分子导入受体细胞（转） DNA重组体的筛选与鉴定（筛）
1、目的基因的来源 1）化学合成 2）制备的基因组DNA皿上的菌落 或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜 上用标记探针进行分子杂交。
3)PCR法：
如果巳知目的序列的长度和两端的序列，则可以合成一对 引物，以转化细胞所得的DNA为模板进行扩增，若能得到预期 长度的PCR产物，则该转化细胞就可能含有目的的序列．
4)DNA限制性内切酶图谱分析
目的序列插入载体会使体DNA限制性酶图谱发生变化，提取 转化细菌的质粒.DNA酶切后做电泳观察其酶切图谱。
3)转染：重组的噬菌体DNA也可象质DNA的方式进入宿主菌，即宿主
菌先经过CaCl2等处理成感受态细菌再接受DNA，进入感受态细菌的噬 菌体DNA可以同样复制和繁殖。这种方式称为转染．用人工脂质膜包 裹DNA，形成的脂质体可以通过与细胞膜融合而将DNA导入细胞
5、DNA重组体的筛选与鉴定
1)根据重组载体的标志作筛选
1、限制性核酸内切酶 概念：是一类特异性地水解双链DNA的磷酸二酯酶．
限制性内切酶（有专一的切点并常在切口处留下黏性末端）
命名：
按酶的来源的属．种名而定，取属名的第一个字母与种名的头两个 字母组成的三个斜体字母作喀语表示；如有株名，再加上一个字母，其 后再按发现的先后写上罗马数字． 例如：从流感嗜血杆菌d株(Hocmophilu9 inrlucn：ac d)中先后分 离到3种限制酶，分别命名为HindI，HindII和HindIII·
第十三章
DNA重组技术
DNA Recombination Technique
本章主要内容
DNA重组技术相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 DNA重组技术的基本过程
一、DNA重组技术相关概念
（一）DNA克隆
克隆（clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的组合。
获取同一拷贝的过程为克隆化（cloning）, 即无性繁殖。
抗药性标志
2) 核酸杂交法
利用标记的核酸探针与转化细胞的DNA进行分子杂交， 可以直接筛选和鉴定目的序列克隆．常用的方法是将转化 后生的菌落复印到硝酸纤维膜上,再用碱裂菌，菌落释放的 DNA就吸附在膜上，再与标记的核酸探针温育杂交，核酸探 针就结合在含有目的序列的菌落DNA上。
Southern杂交(Southern印迹法)
生物技术工程
基因工程、蛋白质工程、酶工程和细胞工程统称。
（二）DNA重组技术常用的工具酶
50年来，核酸酶学的进步为DNA的分析与鉴定提供了 有力的工具。
主要的核酸酶有： DNA聚合酶（DNA polymerase ）
klenow 片段， Taq DNA聚合酶
限制性核酸内切酶（restriction endonuclease ） 逆转录酶（Reverse transcriptase） S1核酸酶（ S1 nuclease） 连接酶（Ligase） 拓扑异构酶（Topoisomerase）等
一些方法处理细胞．经处理后的细胞就容易接受外界DNA，称为感受 态细胞：再与外源DNA接触，就能提高转化效率。
2)转导：通过噬菌沐或病毒的感柒作用将一个细胞的遗传信息传递
到另一个细胞的过程．用噬菌体活病毒作载体，以其DNA与目的序列 重组后，在体外用噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNA包装成有活力 的噬菌体或病毒。就能以感染的方式进入宿主细菌或细胞，使目的序 列得以复制繁殖
3、载体
能将外源基因DNA带入宿主细胞并能复制或最终使外源 基因DNA表达的自主DNA，称为载体(vector)。
常用的载体
1）大肠杆菌的质粒(plasmid)DNA
2）噬菌体DNA 3) 病毒DNA
质粒
是一种环状双链的DNA分子.自身在细菌细胞中能不断复制繁殖,质 粒DNA能从细菌中提出来，又能再转入细菌，这个过程称转化。转入的 质粒DNA仍能进行复制，这种性能为DNA重组技术提供了重要的条件，即 将一种外源基因与质粒重组后，再转入细菌中去复制繁殖，使外源基因 得以增殖。
2、克隆基因载体的选择与构建 3、目的基因与载体的连接 平端连接：
T4DNA连接酶可催化相同或不同内切酶切割的平端连接， 但效率较低．
同聚物加尾连接
用末端转移酶添加DNA的3‘末端，人工形成能互补 的共核苷酸多聚物粘性末端。
4、重组DNA分子导入受体细胞
1)转化：由于外源DNA的进入而使细胞遗传性改变称为转化。采取
5)核苷酸序列测定
所得到的目的序列或基因的克隆，都要用其核酸序列测定 来最后鉴定．
重组DNA技术与医学的关系
疾病病因的发现---遗传病的诊断和治疗 发展生物制药—干扰素，胰岛素，ILs DNA诊断（基因诊断） 基因治疗：向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基 因， 以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的
遗传病的预防（产前诊断，携带者测试）
本章结束
DNA克隆
应用酶学的方法，在体外将各种遗传物质(DNA)与载 体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子—复制子，继 而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化 子细胞，再进行扩增，提取获得大量DNA分子，即DNA克隆 （基因克隆，重组DNA）
基因工程
实现基因克隆所采用的方法和相关的工作。
是将混合在一起的限制 性酶切DNA片段，用琼脂 糖电泳分开，并变性为 单链DNA，再转移到一张 硝酸纤维素膜上。在膜 上的这些DNA片段可以用 p32标记的单链DNA探针 杂交。再用放射自显影 方法显示出与探针顺序 互补的限制性酶切DNA片 段的位置。用这个方法 能很容易地将上百万片 段中间的一个特殊片段 鉴定出来。