HPLC培训(峰与色谱条件)课件
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HPLC
高效液相 色谱
基本原理
加样 流动相 流动相
A B C C B A
固定相 —— 柱内填料，流动相 —— 洗脱剂。 HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分 配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达 到分离的过程。
基本操作
1.打开泵电源，待自检完成后打开“Purge”阀进行排液以除去泵头之 前的气泡，排气完成后关闭“Purge”阀。按“Pump”键开启泵，然 后按“func”及数字键以0.2ml/min的速度慢慢将流速调1.0ml/min （其中测甘油果糖氯化钠注射液时应以0.1ml/min的速度慢慢将流速调 0.5ml/min ）。 2.一般柱平衡时间为30min左右（测甘油果糖氯化钠注射液时平衡时间 会更长些），此时依次打开检测器、工作站电源，打开计算机中工作 站，待仪器自检连接完成后查看基线，如基线平稳即可进样采集数据。 3.检测完成后，关闭计算机中工作站、检测器、工作站电源，将泵的 流速慢慢降至0.2ml/min，按“Pump”键关闭泵，将流动相换至10% 甲醇水或乙腈水，再以1.0ml/min流速冲洗色谱柱30-60min。 4.最后将色谱柱充满纯甲醇保存。 5.手动进样器使用后，用适当溶剂冲洗进样阀，除去残留的样品，溶 剂，缓冲盐等，盖好封盖防止灰尘颗粒。
⑧配制过程中应注意自我保护
流动相使用前为什么要脱气？
流动相使用前必须进行脱气处理 ，以除去其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过
程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪 音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化， 柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。
乙腈
避免操作不当损坏色谱柱,如:猛敲,跌落或过紧拧接头
最常用的“万能柱”填料为“C18”，简称“ODS”柱，即十八烷基硅烷键
合硅胶填料（Octadecylsilyl，简称ODS）。这种填料在反相色谱中发挥 着极为重要的作用，它可完成高效液相色谱70～80％的分析任务。 由于C18(ODS)是长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，对 各种类型的生物大分子有更强的适应能力，因此在生物化学分析工作中应 用的最为广泛。 按键合到基质上的官能团可分为： ⑴反相柱：填料为非极性，官能团为烷烃，例如：C18(ODS)、C8、C4等。 ⑵正相柱：填料为极性，官能团为 －CN氰基、－NH2氨基等。 ⑶离子交换键合相： 阳离子官能团：－SO3H磺酸基、－COOH羧基等。 阴离子官能团：―R4N＋季铵基、-氨基等。 （由于硅胶基质的键合相只能在pH＝2～7.5的范围内使用，而离子交换色谱要 求有更宽的pH范围，因此其基质现在仍主要使用聚苯乙烯和二乙烯苯）
Normal
Tailing
色谱柱故障诊断-- 峰形问题
伸舌峰（前延峰） 对称系数<0.9
可能的原因
1.小峰在大峰前流出 2.柱床塌陷 3.样品溶剂不合适 4.柱过滤片部分堵塞 5.柱过载，偶尔发生
Normal
Fronting
手动进样器的使用、维护
样品溶液进样前必须用0.45um滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损 转动切换时不能太慢，更不能停留在中间
60 15 30 15 0
20% - 100% MeOH
7
色谱柱故障诊断-- 峰形问题
色谱柱柱床塌陷， 出现死体积
可能的原因：
1、色谱柱柱床塌陷，出现死体积 2、过滤片部分堵塞 3、两个组分共同流出，形成一个峰(DAD) 4、样品溶剂不匹配
色谱柱故障诊断--峰形问题
所有的峰都变宽
1.柱效降低，柱床塌陷 2.进样体积（质量）过大 3.流动相黏度太大 4.样品溶剂与流动相不匹配
• 流动相与色谱柱未达到平衡 • 系统中污染物流失 • 电子线路不稳定
• 检测器预热时间不够
• 进样器中残留，硬件与流动
相不相容，如Peek材料与不 合适的有机溶剂合用
色谱柱故障诊断--鬼峰
鬼峰 -—是指在未进样时也能出现的色谱峰
原因：1、流动相不干净，尤其是弱极性流动相，
RPC中水的纯度比甲醇影响更大； 2、样品的交叉污染
色谱柱的故障诊断-- 基线噪音
可能的原因:
1、流动相脱气不彻底
2、检测器流通池污染或有气泡
3、检测器光源能量不稳 4、周期性噪音可能由泵的脉动引起
5、电子放大电路不稳定
Time (min.)
色谱柱故障诊断--基线漂移
可能的原因
• 梯度洗脱
• 流动相不干净 • 温度波动(对示差折光检测器
影响更大)
流动相的配制
①配制用水最好用蒸馏水（注射水） ②称量、量取、调pH时尽可能精确 ③流动相必须用0.45um滤膜过滤，注意区分有机膜、无机膜
④加入甲醇或乙腈后要混合充分
⑤流动相必须经过脱气（常用方法是超声脱气） ⑥配制所用的试剂尽可能用色谱纯，如没有色谱纯可用分析纯代替
⑦流动相应现用现配制，染菌的流动相禁止使用
常用的脱气方法比较：
氦气脱气法 加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。
抽真空脱气法：易抽走有机相。
超声脱气法：流动相放在超声波容器中用超声波振荡，超声过程中观察无气泡生成即
可。
在线真空脱气法：真空脱机利用膜渗透技术在线脱气，无需额外操作，成本低，脱气
效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。
色谱柱的良好使用规范
溶剂使用前必须过滤 运输中变干了的色谱柱要完全浸湿（预处理） 如果样品中含有无需考虑而保留强的组分时,必须进行前处理 清楚了解色谱柱填料适用的pH范围(3-7)，温度(<60),化学适应性
使用新鲜的水溶液,流动相现用现配制
定期用强极性溶剂冲洗色谱柱 储存色谱柱时,要将缓冲液冲洗干净,并保存在适合的溶剂中,如甲醇、
有些峰变宽wenku.baidu.com
1.上一次进样时未洗脱出来的峰 2.样品分子量太大，如蛋白质或聚合物 反应峰
色谱柱故障诊断-- 峰形问题
拖尾峰－－对称因子>1.2
可能的原因
有些峰拖尾
1、二次保留效应，残留的硅羟基影 响 2、在大峰的尾部有小峰流出（DAD）
Normal
Tailing
所有的峰都拖尾
1、柱外效应 2、金属离子影响（酸洗） 3、样品过载或溶剂不合适 4、柱头交叉污染或柱已损坏
高效液相 色谱
基本原理
加样 流动相 流动相
A B C C B A
固定相 —— 柱内填料，流动相 —— 洗脱剂。 HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分 配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达 到分离的过程。
基本操作
1.打开泵电源，待自检完成后打开“Purge”阀进行排液以除去泵头之 前的气泡，排气完成后关闭“Purge”阀。按“Pump”键开启泵，然 后按“func”及数字键以0.2ml/min的速度慢慢将流速调1.0ml/min （其中测甘油果糖氯化钠注射液时应以0.1ml/min的速度慢慢将流速调 0.5ml/min ）。 2.一般柱平衡时间为30min左右（测甘油果糖氯化钠注射液时平衡时间 会更长些），此时依次打开检测器、工作站电源，打开计算机中工作 站，待仪器自检连接完成后查看基线，如基线平稳即可进样采集数据。 3.检测完成后，关闭计算机中工作站、检测器、工作站电源，将泵的 流速慢慢降至0.2ml/min，按“Pump”键关闭泵，将流动相换至10% 甲醇水或乙腈水，再以1.0ml/min流速冲洗色谱柱30-60min。 4.最后将色谱柱充满纯甲醇保存。 5.手动进样器使用后，用适当溶剂冲洗进样阀，除去残留的样品，溶 剂，缓冲盐等，盖好封盖防止灰尘颗粒。
⑧配制过程中应注意自我保护
流动相使用前为什么要脱气？
流动相使用前必须进行脱气处理 ，以除去其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过
程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪 音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化， 柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。
乙腈
避免操作不当损坏色谱柱,如:猛敲,跌落或过紧拧接头
最常用的“万能柱”填料为“C18”，简称“ODS”柱，即十八烷基硅烷键
合硅胶填料（Octadecylsilyl，简称ODS）。这种填料在反相色谱中发挥 着极为重要的作用，它可完成高效液相色谱70～80％的分析任务。 由于C18(ODS)是长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，对 各种类型的生物大分子有更强的适应能力，因此在生物化学分析工作中应 用的最为广泛。 按键合到基质上的官能团可分为： ⑴反相柱：填料为非极性，官能团为烷烃，例如：C18(ODS)、C8、C4等。 ⑵正相柱：填料为极性，官能团为 －CN氰基、－NH2氨基等。 ⑶离子交换键合相： 阳离子官能团：－SO3H磺酸基、－COOH羧基等。 阴离子官能团：―R4N＋季铵基、-氨基等。 （由于硅胶基质的键合相只能在pH＝2～7.5的范围内使用，而离子交换色谱要 求有更宽的pH范围，因此其基质现在仍主要使用聚苯乙烯和二乙烯苯）
Normal
Tailing
色谱柱故障诊断-- 峰形问题
伸舌峰（前延峰） 对称系数<0.9
可能的原因
1.小峰在大峰前流出 2.柱床塌陷 3.样品溶剂不合适 4.柱过滤片部分堵塞 5.柱过载，偶尔发生
Normal
Fronting
手动进样器的使用、维护
样品溶液进样前必须用0.45um滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损 转动切换时不能太慢，更不能停留在中间
60 15 30 15 0
20% - 100% MeOH
7
色谱柱故障诊断-- 峰形问题
色谱柱柱床塌陷， 出现死体积
可能的原因：
1、色谱柱柱床塌陷，出现死体积 2、过滤片部分堵塞 3、两个组分共同流出，形成一个峰(DAD) 4、样品溶剂不匹配
色谱柱故障诊断--峰形问题
所有的峰都变宽
1.柱效降低，柱床塌陷 2.进样体积（质量）过大 3.流动相黏度太大 4.样品溶剂与流动相不匹配
• 流动相与色谱柱未达到平衡 • 系统中污染物流失 • 电子线路不稳定
• 检测器预热时间不够
• 进样器中残留，硬件与流动
相不相容，如Peek材料与不 合适的有机溶剂合用
色谱柱故障诊断--鬼峰
鬼峰 -—是指在未进样时也能出现的色谱峰
原因：1、流动相不干净，尤其是弱极性流动相，
RPC中水的纯度比甲醇影响更大； 2、样品的交叉污染
色谱柱的故障诊断-- 基线噪音
可能的原因:
1、流动相脱气不彻底
2、检测器流通池污染或有气泡
3、检测器光源能量不稳 4、周期性噪音可能由泵的脉动引起
5、电子放大电路不稳定
Time (min.)
色谱柱故障诊断--基线漂移
可能的原因
• 梯度洗脱
• 流动相不干净 • 温度波动(对示差折光检测器
影响更大)
流动相的配制
①配制用水最好用蒸馏水（注射水） ②称量、量取、调pH时尽可能精确 ③流动相必须用0.45um滤膜过滤，注意区分有机膜、无机膜
④加入甲醇或乙腈后要混合充分
⑤流动相必须经过脱气（常用方法是超声脱气） ⑥配制所用的试剂尽可能用色谱纯，如没有色谱纯可用分析纯代替
⑦流动相应现用现配制，染菌的流动相禁止使用
常用的脱气方法比较：
氦气脱气法 加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。
抽真空脱气法：易抽走有机相。
超声脱气法：流动相放在超声波容器中用超声波振荡，超声过程中观察无气泡生成即
可。
在线真空脱气法：真空脱机利用膜渗透技术在线脱气，无需额外操作，成本低，脱气
效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。
色谱柱的良好使用规范
溶剂使用前必须过滤 运输中变干了的色谱柱要完全浸湿（预处理） 如果样品中含有无需考虑而保留强的组分时,必须进行前处理 清楚了解色谱柱填料适用的pH范围(3-7)，温度(<60),化学适应性
使用新鲜的水溶液,流动相现用现配制
定期用强极性溶剂冲洗色谱柱 储存色谱柱时,要将缓冲液冲洗干净,并保存在适合的溶剂中,如甲醇、
有些峰变宽wenku.baidu.com
1.上一次进样时未洗脱出来的峰 2.样品分子量太大，如蛋白质或聚合物 反应峰
色谱柱故障诊断-- 峰形问题
拖尾峰－－对称因子>1.2
可能的原因
有些峰拖尾
1、二次保留效应，残留的硅羟基影 响 2、在大峰的尾部有小峰流出（DAD）
Normal
Tailing
所有的峰都拖尾
1、柱外效应 2、金属离子影响（酸洗） 3、样品过载或溶剂不合适 4、柱头交叉污染或柱已损坏