HPLC培训(峰与色谱条件)课件
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高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
高效液相色谱法
在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流动相的 一个基本要求是流动相尽可能不与固定相互溶， 而且流动相与固定相的极性差别越显著越好。根 据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分 为正相分配色谱和反相分配色谱。如果采用流动 相的极性小于固定相的极性，称为正相分配色谱， 它适用于极性化合物的分离。其流出顺序是极性 小的先流出，极性大的后流出。如果采用流动相 的极性大于固定相的极性，称为反相分配色谱。 它适用于非极性化合物的分离，其流出顺序与正 相色谱恰好相反。
流动相
离子交换色谱法所用流动相大都是一定pH和盐浓度 （或离子强度）的缓冲溶液。通过改变流动相中 盐离子的种类、浓度和pH值可控制k值，改变选择 性。如果增加盐离子的浓度，则可降低样品离子 的竞争吸附能力，从而降低其在固定相上的保留 值。 一般，对于阴离子交换树脂来说，各种阴 离子的滞留次序为： 柠檬酸离子＞SO42－ ＞C2O42- ＞I- ＞NO3- ＞CrO42- ＞ Br-＞SCN-＞ Cl-＞HCOO-＞CH3C00-＞OH-＞F-
•
相平衡参数
• 分配系数(distribution coefficient，K)——在一定温度下，化合物在两 相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。 • 分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压 力有关。在不同的色谱分离机制中，K有不同的概念：吸附色谱法为 吸附系数，离子交换色谱法为选择性系数 （或称交换系数），凝胶 色谱法为渗透参数。但一般情况可用分配系数来表示 • 在条件（流动相、固定相、温度和压力等）一定，样品浓度很低时 （Cs、Cm很小）时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关。这只 是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰； 在许多情况下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为拖尾峰；而 有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只 有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得 正常峰。 在同一色谱条件下，样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长，后 流出色谱柱；
HPLC培训(峰与色谱条件)课件
HPLC
高效液相 色谱
基本原理
加样
流动相
流动相
A
C
B
B
C
A
固定相 —— 柱内填料，流动相 —— 洗脱剂。
HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分 配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达 到分离的过程。
基本操作
1.打开泵电源，待自检完成后打开“Purge”阀进行排液以除去泵头之 前的气泡，排气完成后关闭“Purge”阀。按“Pump”键开启泵，然 后按“func”及数字键以0.2ml/min的速度慢慢将流速调1.0ml/min
色谱柱的良好使用规范
溶剂使用前必须过滤 运输中变干了的色谱柱要完全浸湿（预处理） 如果样品中含有无需考虑而保留强的组分时,必须进行前处理 清楚了解色谱柱填料适用的pH范围(3-7)，温度(<60),化学适应性 使用新鲜的水溶液,流动相现用现配制 定期用强极性溶剂冲洗色谱柱 储存色谱柱时,要将缓冲液冲洗干净,并保存在适合的溶剂中,如甲醇、
计算公式
或
重复性
用于评价连续进样中，色谱系统响应值的重复性能。
采用外标法时，通常取各品种项下的对照品溶液，连 续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标 准偏差应不大于2.0%。
相对标准偏差 RSD
采用内标法时，其相对标准偏差应不大于2.0%。
拖尾因子（T）
用于评价色谱柱的对称性。
反应峰
色谱柱故障诊断-- 峰形问题
拖尾峰－－对称因子>1.2
Normal
Tailing
Normal
Tailing
可能的原因
有些峰拖尾
1、二次保留效应，残留的硅羟基影 响
2、在大峰的尾部有小峰流出（DAD）
高效液相 色谱
基本原理
加样
流动相
流动相
A
C
B
B
C
A
固定相 —— 柱内填料，流动相 —— 洗脱剂。
HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分 配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达 到分离的过程。
基本操作
1.打开泵电源，待自检完成后打开“Purge”阀进行排液以除去泵头之 前的气泡，排气完成后关闭“Purge”阀。按“Pump”键开启泵，然 后按“func”及数字键以0.2ml/min的速度慢慢将流速调1.0ml/min
色谱柱的良好使用规范
溶剂使用前必须过滤 运输中变干了的色谱柱要完全浸湿（预处理） 如果样品中含有无需考虑而保留强的组分时,必须进行前处理 清楚了解色谱柱填料适用的pH范围(3-7)，温度(<60),化学适应性 使用新鲜的水溶液,流动相现用现配制 定期用强极性溶剂冲洗色谱柱 储存色谱柱时,要将缓冲液冲洗干净,并保存在适合的溶剂中,如甲醇、
计算公式
或
重复性
用于评价连续进样中，色谱系统响应值的重复性能。
采用外标法时，通常取各品种项下的对照品溶液，连 续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标 准偏差应不大于2.0%。
相对标准偏差 RSD
采用内标法时，其相对标准偏差应不大于2.0%。
拖尾因子（T）
用于评价色谱柱的对称性。
反应峰
色谱柱故障诊断-- 峰形问题
拖尾峰－－对称因子>1.2
Normal
Tailing
Normal
Tailing
可能的原因
有些峰拖尾
1、二次保留效应，残留的硅羟基影 响
2、在大峰的尾部有小峰流出（DAD）
最新安捷伦高效液相色谱工作站高级操作培训ppt课件
• 从 Integration 菜单选择积分或自动积分 • 选择积分工具。 • 运行一个包括数据分析的完整方法。
Slide 54
自动积分
•检查开始和结束区域，确定噪音。 •赋予初始Slope Sensitivity和Height Reject值. •对第一次积分赋予一个临时峰宽值。 •设置Area Reject为0。 •执行测试性积分，有可能重复几次。 •基于较早洗脱出的色谱峰宽计算峰宽值。 •优化Slope Sensitivity和Height Reject。 •从初始的峰宽和噪音水平计算Area Reject。
Slide 34
泵的辅助功能
选择Instrument More Pump Auxiliary…菜单，即 可弹出下图窗口。
在该窗口可以设置泵 的最大升流速率、泵 冲程大小以及设置溶 剂的压缩补偿因子。
Slide 35
自动进样器的扩展功能
Slide 36
色谱柱信息的输入
Slide 37
VWD停泵扫描采集光谱
Slide 59
Peak width: (半峰宽)
如果没有设置半峰宽的时间积分表，半峰宽在整个积分过程中自动变化，变化 遵从0.75×exiting peak + 0.25×current peak。
Timed Events :(时间性积分事件)
•Area Sum ON or OFF:设定某一时间段内进行峰面积加和，加和后保 留时间被分配到第一个峰的保留时间上。
使用VWD停泵扫描的功能，可以采集样品的吸收光谱， 主要操作步骤如下： 1.在Online工作站界面的View菜单下打开VWD Scans窗口； 2.按照正常的进样方式采集样品色谱数据，并保证能够在
Online Signal窗口中观测到色谱信号； 3.进样后，色谱图上出现基线时，扫描空白吸收光谱
Slide 54
自动积分
•检查开始和结束区域，确定噪音。 •赋予初始Slope Sensitivity和Height Reject值. •对第一次积分赋予一个临时峰宽值。 •设置Area Reject为0。 •执行测试性积分，有可能重复几次。 •基于较早洗脱出的色谱峰宽计算峰宽值。 •优化Slope Sensitivity和Height Reject。 •从初始的峰宽和噪音水平计算Area Reject。
Slide 34
泵的辅助功能
选择Instrument More Pump Auxiliary…菜单，即 可弹出下图窗口。
在该窗口可以设置泵 的最大升流速率、泵 冲程大小以及设置溶 剂的压缩补偿因子。
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自动进样器的扩展功能
Slide 36
色谱柱信息的输入
Slide 37
VWD停泵扫描采集光谱
Slide 59
Peak width: (半峰宽)
如果没有设置半峰宽的时间积分表，半峰宽在整个积分过程中自动变化，变化 遵从0.75×exiting peak + 0.25×current peak。
Timed Events :(时间性积分事件)
•Area Sum ON or OFF:设定某一时间段内进行峰面积加和，加和后保 留时间被分配到第一个峰的保留时间上。
使用VWD停泵扫描的功能，可以采集样品的吸收光谱， 主要操作步骤如下： 1.在Online工作站界面的View菜单下打开VWD Scans窗口； 2.按照正常的进样方式采集样品色谱数据，并保证能够在
Online Signal窗口中观测到色谱信号； 3.进样后，色谱图上出现基线时，扫描空白吸收光谱
高效液相色谱法 (HPLC)ppt课件
Chromatography)
总之，HPLC与经典LC相比, 使用时更方便, 对操作者的依赖性更小。HPLC的高重现性和 连续的定量检测导致了定性和定量分析结果具 有较高的准确性和精密度。
经典LC的特点：简精便选课件，PPT填料一次使用。 9
高效液相色谱仪基本装置
进样阀 色谱柱
检测器
流动相 高压泵
● 通用检测器与选择型检测器
● 浓度型检测器和质量精选型课件检PPT测器
20
检测器的线性、灵敏度和柱外效应三个基本特性直
接影响色谱定量分析的准确度、精密度和再现性。
◆ 检测器的线性范围
大部分厂商都声称它们的检测器在一定的浓度范围内是线性
响应。实际上检测器的线性方程可表示为：y = a c , 只有在三 个数量级的浓度范围内满足0.98 1.02的线性响应的检测器 才是线性的。
高效液相色谱(HPLC) 、毛细管电色谱(CEC) 、微柱液相色
谱(μ- HPLC) 、固相萃取等系统上, 成功地应用于生命科学、药
物学、环境科学等领域的分精离选分课件析PP。T
31
精选课件PPT
何为无死 体积柱头 连接？
无限直径 效应（无 限直径 柱）？
32
柱填料
硅胶和硅基仍是目前最广泛应用的液相色谱柱填料。 此外还有高分子多孔微球、高疏水表面的多孔碳、无 机金属氧化物等。
tr nrti
● 基线校正和重叠峰的分离
在色谱分析中，经常会遇到基线漂移和色谱峰不能
完全分离的情况。通常采用谷—谷规则或预设基线漂
移值参数来解决
精选课件PPT
25
色谱仪自动定性和定量分析
定量计算是把各种计算公式编制成应用软件存入计算机，通 过键盘来选择所需方法。微处理机在定量计算时, 一般通过保留 值来识别峰。但由于各种因素的影响, 在重复多次分析中, 保留 值会有一定的变化, 可采用下述两种方法确定保留值的变化范围。
总之，HPLC与经典LC相比, 使用时更方便, 对操作者的依赖性更小。HPLC的高重现性和 连续的定量检测导致了定性和定量分析结果具 有较高的准确性和精密度。
经典LC的特点：简精便选课件，PPT填料一次使用。 9
高效液相色谱仪基本装置
进样阀 色谱柱
检测器
流动相 高压泵
● 通用检测器与选择型检测器
● 浓度型检测器和质量精选型课件检PPT测器
20
检测器的线性、灵敏度和柱外效应三个基本特性直
接影响色谱定量分析的准确度、精密度和再现性。
◆ 检测器的线性范围
大部分厂商都声称它们的检测器在一定的浓度范围内是线性
响应。实际上检测器的线性方程可表示为：y = a c , 只有在三 个数量级的浓度范围内满足0.98 1.02的线性响应的检测器 才是线性的。
高效液相色谱(HPLC) 、毛细管电色谱(CEC) 、微柱液相色
谱(μ- HPLC) 、固相萃取等系统上, 成功地应用于生命科学、药
物学、环境科学等领域的分精离选分课件析PP。T
31
精选课件PPT
何为无死 体积柱头 连接？
无限直径 效应（无 限直径 柱）？
32
柱填料
硅胶和硅基仍是目前最广泛应用的液相色谱柱填料。 此外还有高分子多孔微球、高疏水表面的多孔碳、无 机金属氧化物等。
tr nrti
● 基线校正和重叠峰的分离
在色谱分析中，经常会遇到基线漂移和色谱峰不能
完全分离的情况。通常采用谷—谷规则或预设基线漂
移值参数来解决
精选课件PPT
25
色谱仪自动定性和定量分析
定量计算是把各种计算公式编制成应用软件存入计算机，通 过键盘来选择所需方法。微处理机在定量计算时, 一般通过保留 值来识别峰。但由于各种因素的影响, 在重复多次分析中, 保留 值会有一定的变化, 可采用下述两种方法确定保留值的变化范围。
高效液相色谱分析(主要分离类型与原理)课件
高效液相色谱分析(主要 分离类型与原理)课件
• 高效液相色谱分析简介 • 高效液相色谱的主要分离类型 • 高效液相色谱的分离原理 • 高效液相色谱分析实验操作与注意事项 • 高效液相色谱分析的应用实例
目录
Part
01
高效液相色谱分析简介
高效液相色谱分析的定义
高效液相色谱分析（HPLC）是一种分离和检测复杂样品中各种组分的方法。它利用不同 物质在固定相和流动相之间的分配平衡来实现分离。
THANKS
感谢您的观看
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Part
03
高效液相色谱的分离原理
高效液相色谱的固定相与流动相
固定相
是色谱柱中的填充物，用于吸附 和固定样品中的组分。常见的固 定相包括硅胶、氧化铝、活性炭 等。
流动相
是携带样品通过色谱柱的液体或 气体，与固定相相互作用，使各 组分得以分离。
高效液相色谱的分离过程
样品在流动相中溶解并被 带入色谱柱。
实验操作前的准备
实验器材与试剂准备
确保所需的色谱柱、检测器、流动相 、样品等都已准备好，并确保试剂的 质量和纯度。
实验条件设定
仪器校准与维护
确保色谱仪器的准确性和稳定性，进 行必要的校准和日常维护。
根据实验需求，设定合适的流动相比 例、流速、检测波长等参数。
实验操作步骤与要点
样品处理
根据实验要求，对样品进 1
Part
02
高效液相色谱的主要分离类型
吸附色谱
STEP 01
原理
STEP 02
应用
利用固定相吸附剂对不同 组分的吸附能力差异实现 分离。
STEP 03
特点
固定相的吸附能力可以通 过改变流动相的组成进行 调节。
• 高效液相色谱分析简介 • 高效液相色谱的主要分离类型 • 高效液相色谱的分离原理 • 高效液相色谱分析实验操作与注意事项 • 高效液相色谱分析的应用实例
目录
Part
01
高效液相色谱分析简介
高效液相色谱分析的定义
高效液相色谱分析（HPLC）是一种分离和检测复杂样品中各种组分的方法。它利用不同 物质在固定相和流动相之间的分配平衡来实现分离。
THANKS
感谢您的观看
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Part
03
高效液相色谱的分离原理
高效液相色谱的固定相与流动相
固定相
是色谱柱中的填充物，用于吸附 和固定样品中的组分。常见的固 定相包括硅胶、氧化铝、活性炭 等。
流动相
是携带样品通过色谱柱的液体或 气体，与固定相相互作用，使各 组分得以分离。
高效液相色谱的分离过程
样品在流动相中溶解并被 带入色谱柱。
实验操作前的准备
实验器材与试剂准备
确保所需的色谱柱、检测器、流动相 、样品等都已准备好，并确保试剂的 质量和纯度。
实验条件设定
仪器校准与维护
确保色谱仪器的准确性和稳定性，进 行必要的校准和日常维护。
根据实验需求，设定合适的流动相比 例、流速、检测波长等参数。
实验操作步骤与要点
样品处理
根据实验要求，对样品进 1
Part
02
高效液相色谱的主要分离类型
吸附色谱
STEP 01
原理
STEP 02
应用
利用固定相吸附剂对不同 组分的吸附能力差异实现 分离。
STEP 03
特点
固定相的吸附能力可以通 过改变流动相的组成进行 调节。
液相色谱基础知识
分辨率是色谱分离中主要考虑的因素
在开发色谱方法时，有很多因素是很重要
的。除分辨率之外，以下几个因素都要考
虑。
灵敏度
成本
载样量
容易使用
分析速度
色谱柱寿命
溶剂损耗
效率
Good Column
Inject
4.4% height
W1.44
Bad Column
提高柱效的方法
色谱柱本身
减小填料的颗粒度 找到最佳的流速(根据不同内径) 合适的温度 降低溶剂的粘度 增加柱长
其他影响柱效的因素
柱外效应
连接管路 进样器、检测器
进样体积 进样量
容量因子 k'
与峰高的关系
与R的关系
示差折光 电导
响应
通用 选择性
灵敏度 毫克 纳克
线性范围 104
106
流速敏感 是
是
温度敏感 是
是
梯度淋洗 不可 有限制
紫外 荧光 电化学
选择性 选择性 选择性
纳克 Picogram Picogram
105 10~103
106
否
否
是
否
否
是
可以 可以 脉冲的可以
色谱条件的优化
分离度
速度
容量
开发液相色谱方法
进样器
液相色谱的应用（一）
“分析型液相色谱” 定性及定量分析
灵敏度的要求 样品的复杂性 样品量的要求 精度及准确度的要求 容易使用
液相色谱的应用（二）
“制备型液相色谱” 分离及纯化
化合物的稳定性 样品的复杂性 制备量的要求 纯度的要求，及纯度的鉴定 方法的安全性
开发液相色谱方法
问题∶什么样的分离结果是好的?分辨率?
高效液相色谱法培训PPT课件
注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选 择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯 度斜率，使各组分在合适的保 留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分 能够充分分离，同时避免过长 的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度 曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法 的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度， 确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测 组分浓度在该范围内时，测定结 果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性， 确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定 样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和 中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控 制图，包括平均值、标准差和控制限等 指标。
VS
发展历程及应用领域
《HPLC方法开发》PPT课件
L
电极
电导检测器
温度对电导率有很大的影响. 必须将检测池置于恒温装置中.
尿液中阴离子的色谱图
分析条件
柱 : Shim-pack IC-A3 流动相 :
8.0 mM p-hydroxybenzoic acid
3.2 mM Bis-Tris *
流速 : 1.5 mL/min 温度 : 40 C 进样量 : 100 uL
系统方法开发
开发方法之前应明确以下各项
❖ 分离目的 ❖ 样品性质和需要的预处理 ❖ 检测方法
开发分离方法的步骤
❖ 选择合适的HPLC方法 ❖ 开始建立方法 ❖ 改善分离 ❖ 检查问题 ❖ 完善方法
有关样品组分和性质的重要信息
现有组分的数目 组分的结构以及具有的官能团 组分的分子量 组分的pKa 值 样品基质的性质：溶剂, 填充物等 要检测组分在样品中的浓度范围 样品溶解度
开发HPLC方法的分离目的
目的
分离度 分离时间 定量
压力
峰形
溶剂消耗
内容
精密和抗干扰的定量分析要求 Rs > 1.5 小于5-10 min时,日常工作较理想 含量测定：RSD<1%; 要求不高或痕量分 析, RSD<5% 最好<150 kgf/cm2, <200 kgf/cm2 通常情况〔假设是新柱〕 最好是信噪比大的窄峰
Peak 3
Nitrobenzoic acid
光谱3点比较法
乙酰水杨酸 up slope, 峰顶点
down slope
荧光检测器
激发波长
*
+ hn1
*
hn2+
A*
Emission Wavelength
hplc的色谱条件及测定方法 -回复
hplc的色谱条件及测定方法-回复HPLC的色谱条件及测定方法HPLC（高效液相色谱）是基于液相色谱的一种分析技术，广泛应用于各个领域的化学分析中。
它具有分离效果好、分离速度快、灵敏度高和适用范围广等优点，因此被广泛地应用于食品、医药、环境等领域的分析和质量控制中。
本文将详细介绍HPLC的色谱条件及测定方法，并逐步解释相关概念和操作步骤。
一、基本色谱条件1. 色谱柱的选择在HPLC分析中，选择适合的色谱柱对于保证准确性和可重复性至关重要。
色谱柱的选择应根据需要分离的样品特性来确定。
常见的色谱柱有反相柱、离子交换柱和凝胶过滤柱等，每种柱的特点和分离能力都不同。
2. 流动相的选择流动相是指在色谱柱中流动的液体，由流动相A和流动相B组成。
流动相可以根据样品的特性和分离要求来选择。
在HPLC中，常用的流动相有水、有机溶剂（如乙腈）和缓冲液等。
根据不同的分析要求，可以选择不同的流动相组合。
3. 流速的选择流速是指流动相在色谱柱中流动的速率。
流速的选择应根据样品的特性、分离效果和分析时间等因素来确定。
一般来说，较高的流速可以缩短分析时间，但可能会影响分离效果，因此需要在速度和分离效果之间进行权衡。
4. 检测器的选择在HPLC中，常用的检测器有紫外-可见光谱检测器（UV-VIS）、荧光检测器、电化学检测器等。
检测器的选择应根据分析目标物的性质和分析要求来确定。
二、HPLC的测定方法1. 样品制备在进行HPLC分析之前，需要对样品进行适当的处理和制备。
常见的样品制备方法包括提取、浓缩、稀释等。
样品制备的目的是提高分析物的浓度，减少干扰物的影响。
2. 色谱柱条件的设定在测定之前，需要根据样品的特性和分析要求来设定适当的色谱柱条件，包括色谱柱的类型、尺寸和流速等。
根据需要，可以进行多次试验来确定最佳的色谱柱条件。
3. 校准曲线的建立为了定量分析目标物，需要建立校准曲线。
校准曲线通常是通过分析一系列含有不同浓度的标准样品来获得的。
相关主题
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- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
• 流动相与色谱柱未达到平衡 • 系统中污染物流失 • 电子线路不稳定
• 检测器预热时间不够
• 进样器中残留，硬件与流动
பைடு நூலகம்
相不相容，如Peek材料与不 合适的有机溶剂合用
色谱柱故障诊断--鬼峰
鬼峰 -—是指在未进样时也能出现的色谱峰
原因：1、流动相不干净，尤其是弱极性流动相，
RPC中水的纯度比甲醇影响更大； 2、样品的交叉污染
60 15 30 15 0
20% - 100% MeOH
7
色谱柱故障诊断-- 峰形问题
色谱柱柱床塌陷， 出现死体积
可能的原因：
1、色谱柱柱床塌陷，出现死体积 2、过滤片部分堵塞 3、两个组分共同流出，形成一个峰(DAD) 4、样品溶剂不匹配
色谱柱故障诊断--峰形问题
所有的峰都变宽
1.柱效降低，柱床塌陷 2.进样体积（质量）过大 3.流动相黏度太大 4.样品溶剂与流动相不匹配
Normal
Tailing
色谱柱故障诊断-- 峰形问题
伸舌峰（前延峰） 对称系数<0.9
可能的原因
1.小峰在大峰前流出 2.柱床塌陷 3.样品溶剂不合适 4.柱过滤片部分堵塞 5.柱过载，偶尔发生
Normal
Fronting
手动进样器的使用、维护
样品溶液进样前必须用0.45um滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损 转动切换时不能太慢，更不能停留在中间
⑧配制过程中应注意自我保护
流动相使用前为什么要脱气？
流动相使用前必须进行脱气处理 ，以除去其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过
程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪 音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化， 柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。
流动相的配制
①配制用水最好用蒸馏水（注射水） ②称量、量取、调pH时尽可能精确 ③流动相必须用0.45um滤膜过滤，注意区分有机膜、无机膜
④加入甲醇或乙腈后要混合充分
⑤流动相必须经过脱气（常用方法是超声脱气） ⑥配制所用的试剂尽可能用色谱纯，如没有色谱纯可用分析纯代替
⑦流动相应现用现配制，染菌的流动相禁止使用
有些峰变宽
1.上一次进样时未洗脱出来的峰 2.样品分子量太大，如蛋白质或聚合物 反应峰
色谱柱故障诊断-- 峰形问题
拖尾峰－－对称因子>1.2
可能的原因
有些峰拖尾
1、二次保留效应，残留的硅羟基影 响 2、在大峰的尾部有小峰流出（DAD）
Normal
Tailing
所有的峰都拖尾
1、柱外效应 2、金属离子影响（酸洗） 3、样品过载或溶剂不合适 4、柱头交叉污染或柱已损坏
常用的脱气方法比较：
氦气脱气法 加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。
抽真空脱气法：易抽走有机相。
超声脱气法：流动相放在超声波容器中用超声波振荡，超声过程中观察无气泡生成即
可。
在线真空脱气法：真空脱机利用膜渗透技术在线脱气，无需额外操作，成本低，脱气
效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。
乙腈
避免操作不当损坏色谱柱,如:猛敲,跌落或过紧拧接头
最常用的“万能柱”填料为“C18”，简称“ODS”柱，即十八烷基硅烷键
合硅胶填料（Octadecylsilyl，简称ODS）。这种填料在反相色谱中发挥 着极为重要的作用，它可完成高效液相色谱70～80％的分析任务。 由于C18(ODS)是长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，对 各种类型的生物大分子有更强的适应能力，因此在生物化学分析工作中应 用的最为广泛。 按键合到基质上的官能团可分为： ⑴反相柱：填料为非极性，官能团为烷烃，例如：C18(ODS)、C8、C4等。 ⑵正相柱：填料为极性，官能团为 －CN氰基、－NH2氨基等。 ⑶离子交换键合相： 阳离子官能团：－SO3H磺酸基、－COOH羧基等。 阴离子官能团：―R4N＋季铵基、-氨基等。 （由于硅胶基质的键合相只能在pH＝2～7.5的范围内使用，而离子交换色谱要 求有更宽的pH范围，因此其基质现在仍主要使用聚苯乙烯和二乙烯苯）
HPLC
高效液相 色谱
基本原理
加样 流动相 流动相
A B C C B A
固定相 —— 柱内填料，流动相 —— 洗脱剂。 HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分 配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达 到分离的过程。
基本操作
1.打开泵电源，待自检完成后打开“Purge”阀进行排液以除去泵头之 前的气泡，排气完成后关闭“Purge”阀。按“Pump”键开启泵，然 后按“func”及数字键以0.2ml/min的速度慢慢将流速调1.0ml/min （其中测甘油果糖氯化钠注射液时应以0.1ml/min的速度慢慢将流速调 0.5ml/min ）。 2.一般柱平衡时间为30min左右（测甘油果糖氯化钠注射液时平衡时间 会更长些），此时依次打开检测器、工作站电源，打开计算机中工作 站，待仪器自检连接完成后查看基线，如基线平稳即可进样采集数据。 3.检测完成后，关闭计算机中工作站、检测器、工作站电源，将泵的 流速慢慢降至0.2ml/min，按“Pump”键关闭泵，将流动相换至10% 甲醇水或乙腈水，再以1.0ml/min流速冲洗色谱柱30-60min。 4.最后将色谱柱充满纯甲醇保存。 5.手动进样器使用后，用适当溶剂冲洗进样阀，除去残留的样品，溶 剂，缓冲盐等，盖好封盖防止灰尘颗粒。
色谱柱的故障诊断-- 基线噪音
可能的原因:
1、流动相脱气不彻底
2、检测器流通池污染或有气泡
3、检测器光源能量不稳 4、周期性噪音可能由泵的脉动引起
5、电子放大电路不稳定
Time (min.)
色谱柱故障诊断--基线漂移
可能的原因
• 梯度洗脱
• 流动相不干净 • 温度波动(对示差折光检测器
影响更大)
色谱柱的良好使用规范
溶剂使用前必须过滤 运输中变干了的色谱柱要完全浸湿（预处理） 如果样品中含有无需考虑而保留强的组分时,必须进行前处理 清楚了解色谱柱填料适用的pH范围(3-7)，温度(<60),化学适应性
使用新鲜的水溶液,流动相现用现配制
定期用强极性溶剂冲洗色谱柱 储存色谱柱时,要将缓冲液冲洗干净,并保存在适合的溶剂中,如甲醇、
• 检测器预热时间不够
• 进样器中残留，硬件与流动
பைடு நூலகம்
相不相容，如Peek材料与不 合适的有机溶剂合用
色谱柱故障诊断--鬼峰
鬼峰 -—是指在未进样时也能出现的色谱峰
原因：1、流动相不干净，尤其是弱极性流动相，
RPC中水的纯度比甲醇影响更大； 2、样品的交叉污染
60 15 30 15 0
20% - 100% MeOH
7
色谱柱故障诊断-- 峰形问题
色谱柱柱床塌陷， 出现死体积
可能的原因：
1、色谱柱柱床塌陷，出现死体积 2、过滤片部分堵塞 3、两个组分共同流出，形成一个峰(DAD) 4、样品溶剂不匹配
色谱柱故障诊断--峰形问题
所有的峰都变宽
1.柱效降低，柱床塌陷 2.进样体积（质量）过大 3.流动相黏度太大 4.样品溶剂与流动相不匹配
Normal
Tailing
色谱柱故障诊断-- 峰形问题
伸舌峰（前延峰） 对称系数<0.9
可能的原因
1.小峰在大峰前流出 2.柱床塌陷 3.样品溶剂不合适 4.柱过滤片部分堵塞 5.柱过载，偶尔发生
Normal
Fronting
手动进样器的使用、维护
样品溶液进样前必须用0.45um滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损 转动切换时不能太慢，更不能停留在中间
⑧配制过程中应注意自我保护
流动相使用前为什么要脱气？
流动相使用前必须进行脱气处理 ，以除去其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过
程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪 音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化， 柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。
流动相的配制
①配制用水最好用蒸馏水（注射水） ②称量、量取、调pH时尽可能精确 ③流动相必须用0.45um滤膜过滤，注意区分有机膜、无机膜
④加入甲醇或乙腈后要混合充分
⑤流动相必须经过脱气（常用方法是超声脱气） ⑥配制所用的试剂尽可能用色谱纯，如没有色谱纯可用分析纯代替
⑦流动相应现用现配制，染菌的流动相禁止使用
有些峰变宽
1.上一次进样时未洗脱出来的峰 2.样品分子量太大，如蛋白质或聚合物 反应峰
色谱柱故障诊断-- 峰形问题
拖尾峰－－对称因子>1.2
可能的原因
有些峰拖尾
1、二次保留效应，残留的硅羟基影 响 2、在大峰的尾部有小峰流出（DAD）
Normal
Tailing
所有的峰都拖尾
1、柱外效应 2、金属离子影响（酸洗） 3、样品过载或溶剂不合适 4、柱头交叉污染或柱已损坏
常用的脱气方法比较：
氦气脱气法 加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。
抽真空脱气法：易抽走有机相。
超声脱气法：流动相放在超声波容器中用超声波振荡，超声过程中观察无气泡生成即
可。
在线真空脱气法：真空脱机利用膜渗透技术在线脱气，无需额外操作，成本低，脱气
效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。
乙腈
避免操作不当损坏色谱柱,如:猛敲,跌落或过紧拧接头
最常用的“万能柱”填料为“C18”，简称“ODS”柱，即十八烷基硅烷键
合硅胶填料（Octadecylsilyl，简称ODS）。这种填料在反相色谱中发挥 着极为重要的作用，它可完成高效液相色谱70～80％的分析任务。 由于C18(ODS)是长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，对 各种类型的生物大分子有更强的适应能力，因此在生物化学分析工作中应 用的最为广泛。 按键合到基质上的官能团可分为： ⑴反相柱：填料为非极性，官能团为烷烃，例如：C18(ODS)、C8、C4等。 ⑵正相柱：填料为极性，官能团为 －CN氰基、－NH2氨基等。 ⑶离子交换键合相： 阳离子官能团：－SO3H磺酸基、－COOH羧基等。 阴离子官能团：―R4N＋季铵基、-氨基等。 （由于硅胶基质的键合相只能在pH＝2～7.5的范围内使用，而离子交换色谱要 求有更宽的pH范围，因此其基质现在仍主要使用聚苯乙烯和二乙烯苯）
HPLC
高效液相 色谱
基本原理
加样 流动相 流动相
A B C C B A
固定相 —— 柱内填料，流动相 —— 洗脱剂。 HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分 配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达 到分离的过程。
基本操作
1.打开泵电源，待自检完成后打开“Purge”阀进行排液以除去泵头之 前的气泡，排气完成后关闭“Purge”阀。按“Pump”键开启泵，然 后按“func”及数字键以0.2ml/min的速度慢慢将流速调1.0ml/min （其中测甘油果糖氯化钠注射液时应以0.1ml/min的速度慢慢将流速调 0.5ml/min ）。 2.一般柱平衡时间为30min左右（测甘油果糖氯化钠注射液时平衡时间 会更长些），此时依次打开检测器、工作站电源，打开计算机中工作 站，待仪器自检连接完成后查看基线，如基线平稳即可进样采集数据。 3.检测完成后，关闭计算机中工作站、检测器、工作站电源，将泵的 流速慢慢降至0.2ml/min，按“Pump”键关闭泵，将流动相换至10% 甲醇水或乙腈水，再以1.0ml/min流速冲洗色谱柱30-60min。 4.最后将色谱柱充满纯甲醇保存。 5.手动进样器使用后，用适当溶剂冲洗进样阀，除去残留的样品，溶 剂，缓冲盐等，盖好封盖防止灰尘颗粒。
色谱柱的故障诊断-- 基线噪音
可能的原因:
1、流动相脱气不彻底
2、检测器流通池污染或有气泡
3、检测器光源能量不稳 4、周期性噪音可能由泵的脉动引起
5、电子放大电路不稳定
Time (min.)
色谱柱故障诊断--基线漂移
可能的原因
• 梯度洗脱
• 流动相不干净 • 温度波动(对示差折光检测器
影响更大)
色谱柱的良好使用规范
溶剂使用前必须过滤 运输中变干了的色谱柱要完全浸湿（预处理） 如果样品中含有无需考虑而保留强的组分时,必须进行前处理 清楚了解色谱柱填料适用的pH范围(3-7)，温度(<60),化学适应性
使用新鲜的水溶液,流动相现用现配制
定期用强极性溶剂冲洗色谱柱 储存色谱柱时,要将缓冲液冲洗干净,并保存在适合的溶剂中,如甲醇、