菌蝇抑制菌的筛选及抑制效果研究

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慢，不能迅速铺满整个培养皿表面，造成部分幼虫能够在没有 长满菌丝的地 方 生 存 。 105～107 个/mL 处 理 ，由 于 孢 子 浓 度 较 高，菌丝生长情况差异不大，对菌蝇幼虫的杀灭效果差异也不 显著。 2.4 孢 子 浓 度 对 菌 蝇 虫 卵 的 毒 力 效 果 研 究 试 验 观 察 期 间（10 d），各处理均未有菌蝇幼虫孵化。 这可能是因为菌蝇虫 卵的孵化需要 3～7 d 的时间， 孵化前所有处理的孢子均已萌 发并大量生长， 因此即使较低孢子浓度也能够因为其快速的 生长而抑制菌蝇虫卵的孵化。
仍较少。笔者研究了几种常用真菌杀虫剂对食用菌菌蝇幼虫、 虫卵的杀灭效果以及真菌孢子浓度对菌蝇抑制率的影响，为 食用菌菌蝇真菌杀虫剂的开发提供了一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 供 试 微 生 物 菌 种 球 孢 白 僵 菌 （ACCC 编 号 ：30713）、金 龟子绿僵菌（ACCC 编号：30104）、玫烟色拟青霉（ACCC 编号： 30444）、淡 紫 拟 青 霉 （ACCC 编 号 ：30673）和 委 内 瑞 拉 链 霉 菌 （ACCC 编号：40098）均为从中国农业微生物菌种保 藏 中 心 购 买。 将球孢白僵菌接种至葡萄糖营养培养基，金龟子绿僵菌、 玫烟色拟青霉和淡紫拟青霉分别接种至 PDA 培养基，委内瑞 拉链霉菌接种至高氏 1 号合成培养基，25℃培养后备用。 1.2 菌 蝇 的 采 集 和 饲 养 试 验 用 虫 采 集 于 山 东 省 淄 博 市 临 淄区边河镇南术北双孢蘑菇种植基地。 于虫害严重的棚区分 别采集带有大量虫卵的新鲜蘑菇和培养基料， 放于 4 L 标本 瓶中加入少量自 来 水 ， 纱 布 封 口 后 在 室 内 自 然 温 度 下 （20~ 30℃）培养。 3 d 后有菌蝇幼虫孵化，7 d 后已有大量菌蝇幼虫 羽化成成虫。 菌蝇幼虫乳白色，5~6 mm，头部黑色，体部白 色 透明。成虫初始为浅褐色，较瘦弱，后逐渐粗壮，呈黑色（图 1）。 1.3 菌 蝇 抑 制 菌 的 筛 选 用 镊 子 取 菌 蝇 幼 虫 和 虫 卵 各 10 只，蒸馏水清洗后分别接入长满菌苔的培养皿，每种抑制菌做 3 皿。 同时取未接种抑制菌的 6 皿空白培养基，3 皿接种菌蝇 幼虫 、3 皿 接 种 虫 卵 做 为 对 照 。 为 防 止 幼 虫 爬 出 或 孵 化 后 飞 出，接种后的培养皿用橡皮筋捆扎。 室温下放置（25～30℃），每
0.53±0.04＃
高糖组
0.47±0.02*＃
0.21±0.02*＃
实验组
0.4
0.34±0.02*＃
0.38±0.03*＃
0.8
0.29±0.01*＃
0.43±0.04*＃
注：与对照组比较，*P <0.01；与高糖组比较，＃P <0.01
3讨论
糖尿病心肌病是糖尿病严重并发症之一， 细胞凋亡在糖 尿病心肌病中起关键作用，可导致心肌细胞丢失及心力衰竭。 细胞凋亡又称为程序性细胞死亡（Programed cell death，PCD）， 是在一种受基因调控的细胞主动死亡过程。 细胞凋亡涉及多 基因，其中 bcl-2 基因是一种凋亡抑制基因，位于 18q21，其编 码 的 蛋 白 只 有 与 调 节 蛋 白 Bax 形 成 二 聚 体 时 才 有 活 性 ， 当 Bc1-2/Bax 比率高时，Bcl-2 抑制细胞凋亡[4]。 bc1-2 基因可以 稳 定 线 粒 体 膜 ，抑 制 caspase-3 的 激 活 ，使 细 胞 免 于 凋 亡 。 [5]-[6] caspase-3 是 细 胞 凋 亡 信 号 转 导 通 路 中 的 ICE 蛋 白 酶 家 族 的 成员，caspase-3 被凋亡信号启动后，才能转变为成熟的酶，并 酶切其特异的底物， 通过影响特定信号分子参与细胞凋亡。 caspase-3 的活化是 DNA 片段化及染色质凝聚等凋亡形态所 必 需 的[7]-[8]。
菌蝇是食用菌生产中的主要害虫之一。 其幼虫常在培养 料中取食菌丝，引起菌丝衰退而造成菇蕾萎缩，或从基部侵入 菌柄，蛀食子实体，导致菇体枯萎、腐烂。虫害可造成食用菌减 产 20%～30%，在害虫大量暴发年份达到 50％，甚至绝收[1]。 随 着栽培设施的改进，夏季反季节种植食用菌产量越来越大，但 夏季气温高、雨水多、湿度大，适宜害虫的繁殖，虫害容易爆 发，危害比春秋季更为严重。目前生产上控制菌蝇的方法仍然 以化学农药防治为主，但由于食用菌表面松软，没有保护膜， 生产中使用农药容易造成产品中存在较高的农药残留。因此， 筛选出杀虫效果显著，低污染，又能保证食用菌产量和品质的 高 效 安 全 杀 虫 剂 具 有 十 分 重 要 的 意 义 [2]。
利用虫生真菌防治害虫是一条安全有效的途径。 目前研 究应用较多的真菌杀虫剂有白僵菌、绿僵菌、青霉、拟青霉、菜 氏 蛾 霉 、 赤 座 霉 等 [3]， 由 于 其 寄 主 广 泛 、 对 人 畜 和 环 境 安 全 、 效力持久等特点，已广泛用于森林、农作物以及环境害虫的 防治 。 [4]-[8] 但目前真菌杀虫剂用于食用菌害虫抑制方面的报道
隔 24 h 观察，记录幼虫的死亡数、化蛹数、羽化数以及虫卵的 孵化数。 试验重复 3 次。 试验过程中观察发现，空白培养基对 照上接种的幼虫部分化成蛹并羽化成成虫。 抑制菌菌苔上接 种的幼虫部分在虫态死亡，部分化蛹，但无羽化现象，说明其 在化蛹后死亡。 试验结果统计中把虫态死亡和蛹态死亡的均 按 死 亡 计 [9]。
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子萌发、生长情况及菌蝇幼虫的死亡率和虫卵孵化率，共观察 10 d。 试验重复 3 次。
2 结果与分析
2.1 抑制菌对菌蝇幼虫的杀灭作用 试验观察过程中，空白 对照培养基上的菌蝇幼虫生长良好， 无死亡现象。 而实验组 72 h 内的死亡率都达到了 85%以上，且差异不显著（P>0.05）， 说明试验所选用的菌种对食用菌菌蝇均有较强的杀灭能力。 其中金龟子绿僵菌和玫烟色拟青霉对菌蝇幼虫的杀灭速度较 快，24 h 内的死亡率已达到 75%以上。 而委内瑞拉链霉菌 24 h 内的杀虫率只有 10.4%， 这可能是因为委内瑞拉链霉菌属于 放线菌，菌落较小，导致部分幼虫短时间内能够在没有菌苔的 地方存活（图 2）。 但随着幼虫在平皿内的爬动，死亡率也迅速
上升。这也在一定程度上说明，委内瑞拉链霉菌由于其菌丝体 不发达，在实际的生产实践中杀虫效果可能不如其它真菌。 2.2 抑 制 菌 对 菌 蝇 虫 卵 孵 化 率 的 影 响 在 放 大 镜 下 用 镊 子 取菌蝇虫卵 10 只， 蒸馏水清洗后接入长满菌苔的培养皿，每 种抑制菌取 3 个培养皿。同时取未接种抑制菌的 3 皿培养基， 分别接种 10 只虫卵做对照。 室温下放置（25～30℃），观察虫卵 的孵化率。 观察结果表明，空白对照培养基在接种虫卵 3～5 d 后开始化蛹并羽 化 ，7～10 d 基 本 全 部 羽 化 为 成 虫 ， 而 所 有 长 满抑制菌菌苔的平皿上均未见菌蝇幼虫。以上结果表明，实验 所选菌种的菌丝能侵入和寄生到菌蝇虫卵内部， 对虫卵的孵 化具有较强的抑制作用。 2.3 抑 制 菌 孢 子 浓 度 对 菌 蝇 幼 虫 的 毒 力 效 果 25℃下 培 养 24 h 后，各 处 理 平 皿 均 无 肉 眼 可 见 菌 丝 ，但 107 个/mL 处 理 中 有幼虫死亡，说明孢子已经萌发。 48 h 后 105～107 个/mL 处理 中均长出 了 大 量 菌 丝 ，103~104 个/mL 处 理 平 皿 中 仍 无 肉 眼 可 见菌丝。 96 h 后所有平皿中均长满了菌丝。
收 稿 日 期 ：2011-06-11 基金项目： 国家公益性行业 （农业） 科研专项 （项目编号： 200803033-B0602-02）。 e-mail：zhuying7711@
抑 制 效 果 （累 计 校 正 死 亡 率 ）/%=（处 理 死 亡 率-对 照 亡 率 ）/（100-对 照 死 亡 率 ）×100 1.4 抑制菌孢子浓度的确定 孢子悬液的制备：根据抑制菌 筛选的试验结果，将杀虫效果最好的绿僵菌在 PDA 培养基上 25℃培养 10 d，无菌水冲洗菌苔收集分生孢子。 孢子悬液经双 层无菌纱布过滤除去菌丝后，用血球计数板测定孢子浓度，然 后 用 无 菌 水 将 孢 子 分 别 稀 释 为 1.0×107 个/mL～1.0×103 个/mL 的处理浓度。为了防止试验过程中培养基干燥影响结果，试验 选择 PDA 半固体培养基进行。
18.0±5.3 42.9±6.2
23.6±4.6 40.0±7.1
42.6±2.7 66.7±9.8
96 h 0
30.7±6.8 62.5±10.1 83.3±3.5 85.2±5.7 87.5±2.6
以上结果表明，随着孢子浓度的增加，相同时间内菌蝇幼 虫的 死 亡 率 增 加 。 孢 子 浓 度 为 103 个/mL 时 ，4 d 内 对 菌 蝇 幼 虫的杀灭率一直较低。这可能是由于孢子浓度低，菌丝生长缓
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病虫害防治
d ib le fu n g i
表 1 抑制菌对菌蝇幼虫的杀灭效果
抑制菌
24 h 死亡率/% 48 h 死亡率/% 72 h 死亡率/%
葡萄糖培养基空白
0
0
0
球孢白僵菌
28.7±19.7
90.6±18.8
96.4±7.1
PDA 培养基空白
0
0
0
金龟子绿僵菌
81.1±12.9
100.0±0.0
表 2 绿僵菌不同孢子浓度对菌蝇幼虫的杀灭效果
孢子浓度/ （个·mL-1）
CK 103 104 105 106 107
24 h 0 0 0
9.6±2.4 13.4±3.5 25.48 h
72 h
0
0
13.3±4.0 23.1±4.2
14.3±2.6 42.8±11.3
发生时通过喷洒抑制菌孢子液的方式进行虫害的防治。 但绿
僵菌与食用菌都属于真菌， 实际生产中使用绿僵菌是否会影