胰腺癌患者手术标本及胰液脱落细胞端粒酶活性的检测
AA几种肿瘤常用检测方法
AA几种肿瘤常用检测方法1．端粒酶活性检测很多恶性肿瘤中都能检测到端粒酶活性,端粒酶可以作为诊断这些肿瘤的生物学标志。
在某些肿瘤中,端粒酶表达会随着肿瘤的进展而上调,因此又可作为肿瘤恶性度评价的一个指标。
端粒酶常用检测方法1) TRAP 法:端粒酶是由蛋白质和RNA 构成的逆转录酶,可以用自身的RNA 为模板合成端粒DNA 而避免端粒的缩短。
人大部分体细胞都不表达端粒酶。
由于“末端复制问题”的存在,端粒在每次细胞分裂后就会缩短一点,当端粒缩短到一定程度就无法维持染色体的稳定,细胞最终衰亡。
恶性肿瘤中端粒酶却能被重新激活而使细胞获得永生化。
自从Kim创立了端粒重复序列扩增法(telomeric repeat ampli-fication protocol ,TRAP) 检测端粒酶的活性以来,大约85 %的恶性肿瘤被检测出具有端粒酶活性。
在目前的肿瘤标志物中,端粒酶是惟一能在大部分肿瘤中都以高阳性率检测到的物质,因此端粒酶是一个很好的肿瘤诊断标志。
该方法非常敏感,只要有10 个阳性细胞存在就可以检测出其端粒酶活性。
但是除了恶性肿瘤外,端粒酶活性也在一些正常细胞中被检测到,特别是有增生能力干细胞和活化的淋巴细胞,另外如甲状腺腺瘤和肠腺瘤等一些良性肿瘤中也能检测出端粒酶活性,从而使TRAP 法得到的结果复杂起来,因此光用定性的方法有时很难确认恶性肿瘤。
但不少研究发现正常组织和良性肿瘤中端粒酶的活性相对较低,所以可以用定量的方法进一步鉴定。
传统的TRAP 法无法对端粒酶活性做准确定量。
现在有人把实时PCR 技术与传统的TRAP 法相结合发明了实时定量TRAP 法( realtime quantitative telomeric repeat amplificationprotocal ,RQ2TRAP) ,能够对端粒酶活性进行较精确的定量,为良恶性的鉴别诊断提供了有效的手段。
但由于设备和试剂很昂贵,目前还难以普及。
端粒酶作为肿瘤标志物的研究进展
端粒酶通过延长端粒序列来增加染色体稳定性，从而维持细胞寿命。在正常细胞中，随着细胞分裂次数的增加 ，端粒序列逐渐缩短，当端粒缩短至一定程度时，细胞进入复制停滞期或凋亡。而在肿瘤细胞中，端粒酶的表 达水平较高，能够维持端粒序列的长度，使肿瘤细胞逃避正常的细胞衰老和死亡过程。
端粒酶与肿瘤的关系
端粒酶活性可以预测肿瘤的预后，为患者和医生提供参 考。
04
端粒酶作为肿瘤标志物的 前景和挑战
提高检测灵敏度和特异性
总结词
提高端粒酶作为肿瘤标志物的检测灵敏度和特异性是 关键的挑战之一。这需要深入研究端粒酶的生物学机 制和肿瘤细胞中端粒酶的表达调控机制，以发现更特 异和敏感的检测方法。
详细描述
目前，已经有一些基于端粒酶的肿瘤标志物检测方法 ，如端粒酶活性检测、端粒酶RNA检测等。但是，这 些方法的灵敏度和特异性还需要进一步提高。例如， 一些非肿瘤疾病或良性疾病中也可能出现端粒酶活性 升高的情况，这会给诊断带来一定的干扰。因此，开 发出更特异和敏感的检测方法是非常重要的。
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《端粒酶作为肿瘤标志物的 研究进展》
2023-10-29
目 录
• 端粒酶概述 • 端粒酶的检测方法 • 端粒酶作为肿瘤标志物的应用 • 端粒酶作为肿瘤标志物的前景和挑战
01
端粒酶概述
端粒酶的生物学作用
端粒酶的组成
端粒酶是由RNA和蛋白质组成的复合体，其中RNA为模板，提供端粒重复序列，蛋白质为催化酶，促进端粒 DNA合成。
端粒酶研究的历史与现状
端粒酶的发现
20世纪80年代，科学家们发现了端粒酶，并认识到其在维持染色体稳定性和细胞寿命中的重要作用。
端粒酶作为肿瘤标志物的研究
胰腺癌组织端粒酶逆转录酶的表达与临床病理的关系研究
胰腺癌组织端粒酶逆转录酶的表达与临床病理的关系研究薛福龙【摘要】Objective Research on pancreatic cancer telomerase reverse transcriptase (hTERT) expression and clinical pathologic relationship. Methods Retrospective analysis of our hospital from June 2009 to February 2014 were clinical data of 46 cases of patients with pancreatic cancer, on pancreatic cancer lesion size, site and clinical grading, organization clearly described. Using SABC immunohistochemistry, the expression of hTERT for testing. At the same time take 46 patients with tissue adjacent to carcinoma were compared. Results The study found that patients with tumor site and expression of hTERT unrelated (P>0.05). Through the observation of patients with pancreatic cancer in the pancreas, 39 patients present expression of hTERT positive, positive rate was 84.8%, in the tissue adjacent to carcinoma, 12 cases with specimen appears as positive, positive rate was 26.1%. Expression of hTERT in clinical stage statistically signiifcant (P<0.05), and its expression of hTERT pos itive rate in stageⅠ, the lowest signiifcantly below itsⅢandⅣ. It has to do with tumor grade, size,location. Conclusion Human telomerase reverse transcriptase in pancreatic cancer tissues is higher, its expression associated with tumor has a great clinical stage, indicating that hTERT expression in tumor tissue and the expression of tissue adjacent to carcinoma difference is very big.%目的：研究胰腺癌组织端粒酶逆转录酶（hTERT）的表达与临床病理的关系。
端粒酶活性检测
端粒酶活性检测（TRAP EZE Telomerase Detection Kit）实验前准备1.试剂盒中需要分装保存的试剂：50X dNTP 5ul/管，-20℃保存2.Telomerase positive Cells的处理：用200ul CHAPS Lysis Buffer溶解，然后分装至10ul/管，-85℃至-75℃保存；使用时用CHAPS Lysis Buffer按1：20稀释3.自备试剂：RNase inhibitor，Taq Polymerase（native，without BSA；Fermentas），PBS（Mg2+and Ca2+-free）4.设备及耗材：2.5ul，10ul，100ul加样器及对应Tip，200ul EP管，1.5ul EP管（以上耗材均要求RNase-free）冷冻离心机，PCR仪，PAGE电泳系统，凝胶成象系统。
实验步骤1．PBS洗去残余培养基；2．CHAPS Lysis Buffer 中加入RNase inhibitor，终浓度100-200U/ml（0.1-0.2U/ul）；3．将样本加入CHAPS Lysis Buffer中，浓度200ul/105-106cells，用枪混匀；4．冰浴30mins；5．4℃离心12000g，20mins；6．吸取上清，分装至200ul EP中，约10-15ul/管，冷冻保存于-70℃冰箱。
*可取一小管样品测定蛋白浓度，具体方法见《蛋白质浓度测定（BCA TM Protein Assay Kit）》7．配制反应液：（25ul体系）10X TRAP Reaction Buffer 2.5ul50X dNTP Mix 0.5ulTS Primer 0.5ulTRAP Primer Mix 0.5ulTaq Polymerase （5units/ul）0.2ul（1unit）dH2O 19.8ulTemplate 1.0ul每次反应都应包括：①样本（蛋白含量＜1.5ug per assay），②样本热敏对照（85℃，10mins），③阳性对照（可用试剂盒自带的Telomerase positive Cells，也可用其他公认有端粒酶活性的细胞，如Hela细胞），④阳性热敏对照（85℃，10mins），⑤阴性对照，⑥空白对照（CHAPS Lysis Buffer）8．将混合好的反应管置于PCR仪中反应，程序：30℃，30min s→94℃，30s→59℃，30s↖70℃，1mins↙30-33cycles9．12%非变性PAGE电泳，上样4ul每孔，400V，1.5-2h10．银染：①将凝胶小心倒入染色槽中，加入500ml固定液，盖好盖子放在水平摇床上轻摇10-15mins②小心倒掉固定液，用二蒸水洗一遍再加入500ml银染液，盖好盖子放在水平摇床上轻摇10-15mins③小心倒掉银染液，用二蒸水洗一到两遍再加入500ml显色液，放在水平摇床上轻摇至条带显色④小心倒掉显色液，用二蒸水洗一遍，然后用保鲜膜包好凝胶至凝胶成相系统中拍照。
病理性消化道息肉组织中端粒酶活性的检测及临床意义
病理性消化道息肉组织中端粒酶活性的检测及临床意义【摘要】目的探讨端粒酶在病理性消化道息肉中的检测及在早期胃癌或大肠癌诊断中的价值。
方法端粒重复序列扩增法(TRAP-PCR-PAGE) 检测175例胃镜活检标本端粒酶活性，标本均系电子内镜下取得的病理性胃、肠息肉组织。
结果增生性息肉、腺瘤、炎性息肉和息肉样胃(肠)癌组织的端粒酶阳性率分别为6.2%、19.5%、15．4%和85．7%；同时随着息肉直径的增大、数目的增多，其端粒酶的阳性表达率也逐渐增高。
结论端粒酶活性检测可作为消化道息肉恶变的早期预测指标。
【关键词】病理性消化道息肉；端粒酶；聚合链反应端粒是真核细胞染色体末端具有稳定染色体末端和阻止它们缩短、融合、重组和缺失作用的DNA序列，由端粒酶以逆转录的方式合成。
端粒酶活化是细胞永生化和肿瘤发生的关键步骤，利用端粒酶作为肿瘤的特异性标记物用以肿瘤的早期诊断具有重要意义。
1 材料与方法1．1 一般资料175例均为本院近两年门诊和住院就诊患者，年龄14~70岁，平均42岁；均于内镜下发现消化道息肉，息肉直径＜2 cm 76例，直径≥2 cm而＜2．5 cm 53例，直径＞2．5 cm 46例；单发息肉96例，多发息肉79例。
取息肉组织进行活检：增生性息肉40例，腺瘤82例(其中伴肠上皮化生26例，伴轻、中、重度不典型增生分别为26例、18例和12例)，炎性息肉39例、息肉样胃(肠)癌组织14例。
1．2 检测方法1．2．1 组织提取物制备胃黏膜活检组织置500 μl无菌生理盐水中漂洗,10 000 r/min离心10 min,弃去上清液,用消毒的眼科剪将组织剪碎,加冷裂解液50 μl ,混匀后置4℃孵育2 h,12 000 r/min离心15 min,取上清液置-70℃保存备用。
1．2．2 端粒重复序列扩增(TRAP) 取裂解上清液3 μl ,加入PCR 反应混合液25 μl ,去离子水补足至总体积50 μl 混匀,覆盖无菌石蜡油30 μl ,在PCR扩增仪上进行引物延伸及扩增反应。
早期胰腺癌的基因诊断研究进展
近年来，胰腺癌的发病率和死亡率呈逐渐上升趋势，每年 有新发病例约２０万人，占全部恶性肿瘤发病的２％。其发病隐 匿，早期缺乏特异表现，恶性程度高，极易出现转移，８００／ｏ一９０％ 的胰腺癌病人就诊时，已经到了晚期，手术切除率只有１５％，５ 年生存率为１％一５％１１１。而早期胰腺癌的手术切除率为９０％一 １００％，５年生存率可达７００／一１００％。另有研究表明，肿瘤的大小 是重要的生存率预测因子，如果直径＜ｌｅｍ，术后５年生存率接近
仅有大约１％的病人发展为胰腺癌。因此，目前并不推荐Ｋ—ｍ
基因用于诊断早期胰腺癌。 １．２细针穿棚（ＦＮＡ）和Ｋ－ｒａｓ基因
Ｋ一瑚基因突变与细胞分析联合可能是诊断胰腺癌的一个
有用工具。对于可疑病例，Ｋ—ｒａｓ基因突变可以帮助诊断胰腺 癌。Ｕｒｇｅｌｌ等１１０ｌ收集了８４例慢性胰腺炎病人ＦＮＡ的样本，同时 进行细胞学和Ｋ—Ｆａｓ突变检测，结果诊断６０例为胰腺癌，２例 为粘蛋白囊状肿瘤，４例为内分泌肿瘤，６例为其他恶性肿瘤， １０例为慢性胰腺炎，１例为急性胰腺炎，１例为结核。随后的细 胞学对其中的６３例进行了明确诊断，占７５％；非确定性报道２ｌ 例，占２５％。Ｕｒｂａｎ等也作了相似研究【Ｉｌ】’敏感率９２％，特异性
忉．中华外科杂志，１９９６，３４（１１）：６７８－６８０． ［ＳＪＰｅｒｒａｕｈ
Ｌ
右心气体；⑤开放上下腔静脉并建立循环后，逐渐夹闭下腔静
脉，并先后拔出下腔静脉和左心引流管，停机后拔出上腔静脉 插管，最后缝闭主动脉排气孔。本组没有脑气栓并发症发生。 本组１０２例患者术后无呼吸衰竭施气管切开术病例，其临 床疗效说明浅低温体外循环心内直视下先心病矫治手术成熟、
经房间隔缺损或切开房间隔，通过二尖瓣口置左心房引流管人 左心室，即可行左心引流，又使二尖瓣关闭不全，从而使左心房 和左心室内压与大气压相当，主动脉灌注压在８．０
特异性PCR法检测胰腺癌p16基因甲基化改变
特异性PCR法检测胰腺癌p16基因甲基化改变刘枫;李兆申;许国铭;任玥欣;周国雄;屠振兴【摘要】目的探讨胰腺癌 p16基因启动子区5'CpG岛甲基化改变的特点及其与临床病理特征的关系.方法应用甲基化特异性PCR法进行甲基化检测.结果 14/36例胰腺癌标本的p16基因启动子区5'CpG岛检测到甲基化,甲基化频率为38.9%,5例癌旁组织、1例正常胰腺组织、7例慢性胰腺炎及2例胰腺粘液性囊腺瘤未发现相应区域的甲基化.结论 p16基因启动子区5'CpG岛甲基化是胰腺癌p16基因失活的机制之一,是胰腺癌细胞区别与正常细胞的分子事件.检测p16基因甲基化可能有助于胰腺癌的诊断及鉴别诊断.【期刊名称】《中华胰腺病杂志》【年(卷),期】2002(002)002【总页数】3页(P82-84)【关键词】胰腺癌;p16基因;甲基化;甲基化特异性PCR【作者】刘枫;李兆申;许国铭;任玥欣;周国雄;屠振兴【作者单位】200433,上海,第二军医大学附属长海医院消化科;200433,上海,第二军医大学附属长海医院消化科;200433,上海,第二军医大学附属长海医院消化科;200433,上海,第二军医大学附属长海医院消化科;200433,上海,第二军医大学附属长海医院消化科;200433,上海,第二军医大学附属长海医院消化科【正文语种】中文【中图分类】R73在胰腺癌多步骤、多阶段发生过程中有多种肿癌相关基因参与。
p16基因是其中一个重要的抑癌基因，参与细胞周期的调控，控制细胞的生长和分化。
其失活的机制包括缺失、突变及5'CpG岛异常甲基化。
目前已在多种肿瘤中发现5'CpG岛异常甲基化是其灭活的主要机制[1]。
我们采用敏感的甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)法检测了胰腺癌组织中p16基因启动子区5'CpG岛甲基化状态，探讨中国人胰腺癌p16基因甲基化改变的特点及其与临床病理特征的关系，为胰腺癌的早期诊断提供新的分子生物学指标。
端粒酶活性检测
端粒酶活性检测（TRAP EZE Telomerase Detection Kit）实验前准备1.试剂盒中需要分装保存的试剂：50X dNTP 5ul/管，-20℃保存2.Telomerase positive Cells的处理：用200ul CHAPS Lysis Buffer溶解，然后分装至10ul/管，-85℃至-75℃保存；使用时用CHAPS Lysis Buffer按1：20稀释3.自备试剂：RNase inhibitor，Taq Polymerase（native，without BSA；Fermentas），PBS（Mg2+and Ca2+-free）4.设备及耗材：2.5ul，10ul，100ul加样器及对应Tip，200ul EP管，1.5ul EP管（以上耗材均要求RNase-free）冷冻离心机，PCR仪，PAGE电泳系统，凝胶成象系统。
实验步骤1．PBS洗去残余培养基；2．CHAPS Lysis Buffer 中加入RNase inhibitor，终浓度100-200U/ml（0.1-0.2U/ul）；3．将样本加入CHAPS Lysis Buffer中，浓度200ul/105-106cells，用枪混匀；4．冰浴30mins；5．4℃离心12000g，20mins；6．吸取上清，分装至200ul EP中，约10-15ul/管，冷冻保存于-70℃冰箱。
*可取一小管样品测定蛋白浓度，具体方法见《蛋白质浓度测定（BCA TM Protein Assay Kit）》7．配制反应液：（25ul体系）10X TRAP Reaction Buffer 2.5ul50X dNTP Mix 0.5ulTS Primer 0.5ulTRAP Primer Mix 0.5ulTaq Polymerase （5units/ul）0.2ul（1unit）dH2O 19.8ulTemplate 1.0ul每次反应都应包括：①样本（蛋白含量＜1.5ug per assay），②样本热敏对照（85℃，10mins），③阳性对照（可用试剂盒自带的Telomerase positive Cells，也可用其他公认有端粒酶活性的细胞，如Hela细胞），④阳性热敏对照（85℃，10mins），⑤阴性对照，⑥空白对照（CHAPS Lysis Buffer）8．将混合好的反应管置于PCR仪中反应，程序：30℃，30min s→94℃，30s→59℃，30s↖70℃，1mins↙30-33cycles9．12%非变性PAGE电泳，上样4ul每孔，400V，1.5-2h10．银染：①将凝胶小心倒入染色槽中，加入500ml固定液，盖好盖子放在水平摇床上轻摇10-15mins②小心倒掉固定液，用二蒸水洗一遍再加入500ml银染液，盖好盖子放在水平摇床上轻摇10-15mins③小心倒掉银染液，用二蒸水洗一到两遍再加入500ml显色液，放在水平摇床上轻摇至条带显色④小心倒掉显色液，用二蒸水洗一遍，然后用保鲜膜包好凝胶至凝胶成相系统中拍照。
端粒酶活性的检测与胃癌预后关系的研究
端粒酶活性的检测与胃癌预后关系的研究摘要】目的本研究检测胃癌组织中端粒酶活性蛋白的表达，旨在探索端粒酶表达与胃癌的生物学行为和患者预后的关系。
方法应用TRAP-PCR银染法检测40例胃癌组织和15例正常胃组织中端粒酶活性。
同时收集每一例胃癌患者的临床病理资料，并将上述标记物与患者的临床病理参数（年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位、病理类型、组织分化程度、浸润深度、淋巴结转移情况、pTNM分期）进行相关性分析。
结果端粒酶在正常胃粘膜的表达为13.3%(2/15)，胃癌组织中端粒酶阳性表达率为77.5%（31/40）, 差异有显著性P＜0.01；端粒酶的表达与肿瘤浸润深度、pTNM分期及有淋巴结转移呈正相关P＜0.01。
Logistic多因素回归分析示：端粒酶活性是与肿瘤浸润深度相关的危险因素（P﹤0.05）。
结论胃癌组织中端粒酶活性与胃癌的浸润转移密切相关，对它的检测有助于对胃癌患者的转移和预后做出更准确地判断，更好的指导胃癌的治疗。
【关键词】胃癌端粒酶活性临床病理参数预后转移胃癌是严重危害人类健康最常见的恶性肿瘤之一，胃癌发病率在全球范围内仅次于肺癌居第二位，胃癌在亚洲地区更为突出，在我国男性胃癌发病率仅次于肺癌，女性胃癌为第四位高发癌[1]。
侵袭与转移是胃癌的重要生物学行为之一，其全过程包括：癌基因的激活[2]；抑癌基因失活[3]；端粒酶(telomerase)活化-细胞永生化；细胞转移相关基因及凋亡抑制基因的失调等。
这些基因和蛋白表达的增加或降低均为临床检测浸润转移提供了分子标记物。
近年来分子生物学研究的进展极大帮助研究人员从分子生物学水平认识恶性肿瘤的发生与演进。
本课题采用TRAP-PCR银染法检测胃癌组织中端粒酶活性,探讨其与病人临床病理学特征的关系，旨在从分子水平分析胃癌转移相关因素，并评价上述生物学指标判断胃癌预后的价值。
1 资料与方法1.1病例及手术标本收集收集我院胃肠外科2010年3月至2010年10月之间的40例行胃癌根治术的新鲜瘤体组织标本，所有标本修剪后用生理盐水清洗，冻存在-80℃冰箱中做长期保存。
胰腺癌患者手术标本及胰液脱落细胞端粒酶活性的检测
胰腺癌患者手术标本及胰液脱落细胞端粒酶活性的检测龚晓明;陈元方;陈原稼;陆星华【期刊名称】《胃肠病学和肝病学杂志》【年(卷),期】2002(011)001【摘要】目的研究胰腺良、恶性患者手术标本,经ERCP所获胰液脱落细胞的端粒酶活性的表达,探索胰腺癌诊断的新方法.方法采用TRAP-ELISA的方法检测胰腺癌细胞株、胰腺良恶性疾病组织物、胰液细胞的端粒酶活性.结果6株胰腺癌细胞株均检测到了端粒酶活性,胰腺癌手术标本端粒酶的阳性率为63%(5/8),而4例正常胰腺组织和2例胰腺良性疾病患者的胰腺标本未检测到端粒酶活性.胰腺癌患者的胰液细胞中,有58%(11/19)检测到有端粒酶活性的表达,而胰腺良性疾病也有高达62.5%(5/8)的阳性率,两者无差别.结论胰腺癌组织标本中有较高的端粒酶活性表达;胰液脱落细胞检测端粒酶活性无助于鉴别胰腺良恶性疾病.【总页数】4页(P50-53)【作者】龚晓明;陈元方;陈原稼;陆星华【作者单位】中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院,妇产科,北京市,100730;中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院消化内科;中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院消化内科;中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院消化内科【正文语种】中文【中图分类】R73【相关文献】1.粪便肠脱落细胞端粒酶活性检测对老年大肠癌的早期诊断价值 [J], 徐梅华;蔡克银;赵勇2.胆管癌患者胆汁脱落细胞端粒酶活性和p53基因突变检测的临床意义 [J], 郑强;薛平;卢海武;胡以则3.联合检测尿液Survivin浓度及脱落细胞端粒酶活性在膀胱移行细胞癌中的诊断价值 [J], 刘岗;宋永胜4.胰腺癌患者胰液中端粒酶活性表达及临床意义 [J], 叶远红;张安忠5.粪便肠脱落细胞端粒酶活性检测对大肠癌的早期诊断价值 [J], 徐梅华;蔡克银因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
肺癌患者痰标本中端粒酶活性表达及意义
肺癌患者痰标本中端粒酶活性表达及意义作者：马缠过，徐阳，赵岚，王宏涛，杨淑梅【关键词】端粒酶；肺肿瘤；痰；TRAP PCR ELISA端粒酶异常活化与肺癌的发生、发展及转归密切相关. 肺癌端粒酶活性的研究最早始于对手术切除的肿瘤标本的检测,以后逐渐扩展到纤维支气管镜活检标本、血液、肺泡灌洗液等的检测. 这些检测手段对肺癌的诊断及治疗均有一定的临床意义,但也存在局限性. 我们采用TRAP PCR ELISA法测定肺癌患者痰液中的端粒酶活性,探讨其在肺癌早期诊断中的临床价值.1材料和方法1.1材料收集肺癌患者痰标本33份，男27例,女6例,平均年龄55．3岁，均经活检或手术后病理检查证实为肺癌（鳞癌28例,腺癌1例，小细胞肺癌4例）. 所有患者既往均未接受过治疗，并且排除口腔及鼻咽部肿瘤. 对照组为同期住院的肺部良性疾病患者27例,男20例,女７例,平均年龄５０岁,其中慢性支气管炎13例, 支气管扩张症8例,肺部炎性假瘤4例,肺结核2例. 采用上海华美生物工程公司生产的TRAPPCR ELISA试剂盒检测.1.2方法常规检查排除口腔及鼻咽部炎症，留取患者晨起后新鲜深部痰液3～5 mL,采取深咳嗽或(和)给予拍背等措施利于深部痰咳出；无痰者，用生理盐水雾化吸入后再深咳排痰. 将痰液收集到无菌器皿中，部分患者于纤维支气管镜检查后留取痰液，并于30 min内进行痰标本处理. 立即用4℃无菌生理盐水冲洗痰标本2次，加入与痰液等量的NaOH（1 mol／L），进行碱化处理,取溶解痰液于试管中进行离心，弃上清液，于试管中加入5 mL无菌生理盐水（4℃）进行再次离心，弃上清液，取沉淀置于-80℃冰箱中待用或直接用于端粒酶活性检测. 按照TRAP PCR ELISA试剂盒使用说明书进行操作. 实验步骤包括端粒模板的提取、扩增、杂交等流程. 每例标本均做2个平行反应. 根据试剂盒提供的使用说明，在酶标仪上用波长450 nm 读取A值，以空白对照校零，阴性对照A值≤0.05时按0.05计算；A值>0.05时按实际值计算. 样本A值>2.1倍阴性对照值时，判断端粒酶活性阳性.统计学处理：采用χ2检验和t检验，以P<0.05为有统计学意义.2结果肺癌组痰标本中的端粒酶活性阳性率为48.5%（16／33）,而肺部良性疾病对照组为11.1%（3／27）,差异有统计学意义（P<0.05）. 33例肺癌患者痰标本中的端粒酶活性水平（A值）高于对照组,差异有统计学意义［（0.326±0.231） vs (0.087±0.108), P<0.05）］. 但肺癌组中不同组织类型痰标本中的端粒酶活性水平比较,差异无统计学意义（P>0.05）. 3讨论痰标本中脱落上皮细胞的相关分子生物学检查，敏感性高，特异性好，误诊的可能性很小，是肺癌最有希望的早期诊断措施. 端粒酶活性存在于生殖细胞、永生细胞、活化的淋巴细胞以及大多数的人类原发肿瘤细胞中. Kim等［1］研究统计了15种肿瘤的644个标本,端粒酶阳性者545例,占85%,而相应的293例正常组织中仅21例阳性,占7%. 因此端粒酶活性已成为人类诊断肿瘤的重要标志,端粒酶亦可能成为肿瘤治疗的一个新靶点. 肺癌以往文献报道的端粒酶活性检测的样本多来源于手术切除标本,纤维支气管镜检查活检组织或肺泡灌洗液等,其总的阳性率多在80%～97%之间,刘瑾等［2］分析了28篇有关端粒酶和肺癌诊断的流行病学文献，结果显示，端粒酶阳性者患肺癌的危险性是端粒酶阴性者的66.43倍；在肺癌人群中端粒酶阳性出现的概率是非肺癌人群的12.13倍；而在肺癌人群中端粒酶阴性出现的概率是非肺癌人群的0.22倍. 可见端粒酶是一种敏感性及特异性都较高的肿瘤标志物. 本研究试图为肺癌的普查及筛查寻找无创、适宜于早期诊断的简便方法. 痰标本容易得到，重复性好，能直接反应气道及肺部的病变. 痰标本中端粒酶活性测定可用于肺癌的辅助诊断. 既往［3-4］采用手术、活检、肺泡灌洗液等标本测定端粒酶活性检出率较本组偏高,但总的趋势一致. 杨晔［5］等研究发现，端粒酶活性与肺癌的病理类型无关，而与癌细胞的分化程度有关，端粒酶活性越高，肺癌分化越低，侵袭生长能力越强，对肺癌预后判断有潜在价值. 支气管肺癌发生和发展特点及支气管肺泡结构的解剖特点，决定了痰标本检查在肺癌早期诊断中的重要性.总之,本实验样本量小，关于痰标本端粒酶活性高低与肺癌肿块位置、病理类型及其分化程度的关系尚无明确结论，有待进一步研究.【参考文献】［1］Kim NW，Piatyszek MA， Prowse KP，et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer ［J］. Science, 1994,266（5193）:2011-2015.［2］刘瑾,杨青,兰亚佳,等.肺癌患者端粒酶表达的Meta分析［J］.中国肺癌杂志,2001,4(4):299-301.［3］王金亮,王嘉祺,安真光,等. 端粒酶活性在肺癌患者痰液脱落细胞中表达的临床价值研究［J］.中国肺癌杂志,2002,5(1):38-40.［4］胡坚,孙鹏,李任远,等. 非小细胞肺癌病理类型及临床分期与血液端粒酶活性相关性研究［J］.中华实验外科杂志,2004,21(10):1257-1258.［5］杨晔，程庆书，王小平，等. Bcl2,p53表达及端粒酶活性三者在非小细胞肺癌发生中的相关性［J］.第四军医大学学报,2003,24(23):2199-2202.。
PCR-EIA法检测端粒酶活性及其临床应用
!PCR-EIA法检测端粒酶活性及其临床应用陈卫群1，陈和明2，胡元佳1（1.中南大学湘雅医学院检验系临床生化教研室，长沙410013；2.中南大学湘雅二医院心胸外科，长沙410011）［摘要］目的：探讨用PCR-EIA法检测人端粒酶活性及其临床应用。
方法：利用kim法处理细胞和组织标本及扩增端粒酶产物，引物TS用生物素标记，CX用地高辛标记，PCR产物与包被有链亲和素的酶标板结合，并与酶标抗地高辛抗体反应，用TMB显色。
结果：PCR-EIA法与TRAP-银染色法有很好的相关性，批内变异系数CV为4.138%，在30例各种恶性肿瘤组织中端粒酶活性检出率为90%，28例癌旁组织中为7.1%。
结论：该法具有较好的灵敏度与重复性，无同位素污染，较银染色法更为简便、快速，检测成本低，无需特殊仪器，适合于各级医院推广。
［关键词］端粒酶活性；肿瘤；多聚酶链反应；酶多重免疫测定技术［中图分类号］R446.61［文献标识码］A［文章编号］1000-5625（2002）03-0221-03(uantitation of telomerase activity using the polymerase chain reaction-based enzyme immunoassay and its clinical applicationCHEN Wei-gun1，CHEN He-ming2，HU Yuan-jia1（1.Department of Clinical Biochemistry，Xiangya School of Medicine，Central South Uniuersity，Changsha410013；2.Department of Thoracic and Cardiac Surgery，Second Xiangya Hospital，Central South Uniuersity，Changsha410011，China）Abstract：Objective To investigate detective methodoIogy of teIomerase activity and its cIinicaI appIica-tion.Methods The teIomerase activity was guantitated by poIymerase chain reaction-base enzyme immunoassay （PCR-EIA）.The TS primer was biotinyIated（TS-B），and CX primer was digoxigeninated（CX-D）.The ampIi-cons containing TS-B were combined with microtiter pIate coated streptavidin，then combined with anti-digoxi-genin antibody IabeIed with POD and finaIIy reacted to tetramethyIbenzidine substrate soIution.Results TeIom-erase activity measured by the PCR-EIA method was comparabIe to that obtained from TRAP-siIver stain protocoI.The CV of the PCR-EIA method was4.138%.TeIomerase activity was detected in90%of various tumer tis-sues.In controI tissues，teIomerase activity was detected onIy in7.1%.Conclusion The PCR-EIA method of-fers a rapid，guantitative，and nonisotopic assay for the determination of teIomerase activity.It is simper than siI-ver stain protocoI.The detection of teIomerase activity may pIay a significant roIe in the diagnosis of cIinicaI tu-mors.Key words：teIomerase activity；neopIasms；poIymerase chain reaction；enzyme-muItypIied im-munoassay technigue［BuII Hunan Med Univ，2002，27（3）：0221-03］端粒酶活性的表达与细胞的衰老凋亡和永生化密切相关，普遍认为端粒酶在肿瘤的发生发展中具有重要作用。
肺癌组织中端粒酶活性检测及临床意义
肺癌组织中端粒酶活性检测及临床意义姚珂;余祖滨;闵家新;张国强【期刊名称】《中国肺癌杂志》【年(卷),期】2003(006)005【摘要】目的研究肺癌组织中端粒酶活性检测的临床意义,探讨其作为肺癌诊断和预后评价指标的可行性.方法采用端粒重复序列扩增(telomeric repeat amplification protocal,TRAP)-PCR-ELISA方法检测48例肺癌手术切除组织及相应的癌旁组织中端粒酶的活性,并以42例肺部良性病变组织作为对照.结果 48例肺癌组织中端粒酶阳性率为87.5%(42/48), 癌旁组织为8.3%(4/48),42例肺部良性病变组织中未检出端粒酶阳性.肺癌组织端粒酶水平明显高于癌旁组织(χ2＝13.029,P<0.01)及良性病变组织(χ2＝14.016,P<0.01).端粒酶活性随细胞分化程度、临床分期有升高趋势,但无统计学差异,不同组织学类型间端粒酶活性无显著性差异,伴淋巴结转移肺癌组织中端粒酶阳性率明显高于不伴淋巴结转移组(93.5%比76.4%,χ2＝63.511,P<0.01).结论端粒酶的激活与肺癌的发生发展密切相关.端粒酶可作为肺癌辅助诊断、预后判断的标志物之一,并为肺癌的基因治疗提供理论依据.【总页数】3页(P364-366)【作者】姚珂;余祖滨;闵家新;张国强【作者单位】400037,重庆,第三军医大学新桥医院胸外科;400037,重庆,第三军医大学新桥医院胸外科;400037,重庆,第三军医大学新桥医院胸外科;400037,重庆,第三军医大学新桥医院胸外科【正文语种】中文【中图分类】R734.2;R730.51【相关文献】1.肺癌患者诱导痰中端粒酶活性检测的临床意义 [J], 刘乾中;李秋根;彭亦平2.胃液中端粒酶活性检测临床意义探讨 [J], 孔超美;王书奎;孙丹莉;张振玉;张予蜀3.肺癌组织中端粒酶活性检测 [J], 李欣;李清泉;杨炯;周宏4.肺癌组织及支气管冲洗液中端粒酶活性检测的临床意义 [J], 毛辉;罗凤鸣;刘春涛;王曾礼;李佳琦5.端粒酶活性检测在肾细胞癌中的临床意义 [J], 康郑军;张亚光;李宇辉;赵明义;杨健因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。