全长cDNA的获得_RACE及其他方法进展
RACE原理及应用
RACE的简介目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。
尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。
近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长cDNA提供了一个便捷的途径。
cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA反转录和PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。
简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。
因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。
第二RACE的原理RACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。
3’RACE的原理一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。
这样就在未知cDNA末端接上了一段特殊的接头序列。
再用一个基因特异性引物(3 amp)与少量第一链(-)cDNA退火并延伸，产生互补的第二链(+)cDNA。
三)利用3amp和接头引物进行PCR循环即可扩增得到cDNA双链。
扩增的特异性取决于3amp的碱基只与目的cDNA分子互补．而用接头引物来取代dT17一adaptor则可阻止长(dT)碱基引起的错配。
RACE+PCR
RACE PCRRACE(rapid-amplification ofcDNA ends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。
cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。
完整的cDNA 序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。
末端克隆技术是20世纪80年代发展起来的。
RACE的优点与筛库法相比较，有许多方面的优点1）此方法是通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。
2）节约了实验所花费的经费和时间。
3）只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长。
实验室现有的RACE试剂盒的简介RACE是一种从一个相同的cDNA模板进行5‘和3‘末端快速克隆的方法。
此方法会产生较少的错误条带。
此过程中使用的酶混合物非常适合长链PCR。
使用此方法的要求是必须知道至少23－28个核苷酸序列信息，以此来设计5’末端和3‘末端RACE反应的基因特异性引物（GSPs）。
RACE引物的设计：基因特异性引物（GSPs）应该是：23－28nt50－70％GCTm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。
反应中涉及到的一些事项cDNA的合成起始于polyA+RNA。
如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。
RACE PCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。
在进行5‘和3’RACE PCR的时候应该使用热启动。
表4中给出了所有引物的相互关系。
重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。
另外，重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照。
并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。
引物GSP中的GC含量要在50－70％之间。
这样可以使用降落PCR。
避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。
由EST到全长cDNA—RACE及相关技术进展
（第 三 军 医 大 学 全 军 复 合 伤 研 究 所 ， 庆 ４ ０ ３ ） 重 ００ ８
摘 要 ：由 Ｅ Ｔ 出发 获得 仝长 ｃ ＮＡ是 基 因组和功 能基 因 组研 究 的重 要 内容 之 一，ＤＮ Ｓ Ｄ ｃ Ａ末 端 快 速 扩 增技 术 （ Ａ Ｅ） 实现 此 目的 的 重 要 方 法。 本 文 对 Ｉ￣ Ｅ的 基本 原 理 及 其 改进 ， 其 是 Ａ —ＭＶ Ｒ Ｃ 是 Ｌ． Ｃ 尤 Ｍ 酶 ａ （ｅ ｐａ ｗ ｔ ） 能 的应用 带来 的技 术 革 新进 行 了综述 。 Ｓ ｔｍ ｌｔ ｓ ｉ ｈ 功 ｅ ｃ
ｅ １ ９ ２ ０ ５ ３ ）：６ ＿ ４ ０ ．９ ５．７ （ ２ ５ ４ ７ ＿ ７
［ ］ Ａ ｍ Ｖ ｕ ｅ ． ｃ ｓ ｅ ２ ０ ，８ １ ） Ｅ ６ ２ Ｎ ｄ ｉ Ａ ｉ ｓ ０ ０ ２ （ ２ ： ６ ｚ ｄＲ ［ ］ 朱 滨 等 生 物 化 学 与 生 物 物理 进 展 ，０ １ ２ （ ） ３ ２０ ，８ １ ：
关键 词 ： 达序 列标 签 ； 表 奎长 ｅ Ａ；ＤＮ ＤＮ ｅ Ａ末 端 快 速 扩 增 中 围分 类号 ： ５ Ｑ ５ Ｑ ２； ７
利 用 表 达 序 列 标 签 （ ｘ ｒｓｅ ｅｅ ｃ ｅｐｅｓｄ ｓｑ ｎｅ ｔ ，Ｓ ） ａ Ｅ Ｔ 不但 可 以对 基 因进 行染 色 体定 位 ， ｇ 而 且 通 过 比较 不 同 研 究 条 件 下 的 Ｅ Ｔ 表 达 Ｓ 情 况 ， 获得 丰 富 的 生 物 学 信 息 。但 绝 大 多 可 数 Ｅ Ｔ分 布 在 基 因 的 ３端 ， 据 库 中 代 表 基 Ｓ 数 因 ５端上游信息 的 Ｅ Ｔ只 占很小 的 比例 ， Ｓ 而 且 Ｅ Ｔ的长 度 都 在 ３ ０～５ ０ ｐ 间 ， 从 Ｓ ０ ０ ｂ之 仅
采用RACE技术获得全长人新基因MAGE_D1
ISSN 100727626 CN 1123870 Q中国生物化学与分子生物学报Ch inese Jou rnal of B i ochem istry and M o lecu lar B i o logy2001年4月17(2):203～208收稿日期:2000207217,接受日期:2000210209国家“863”项目(N o.102210204204)、国家自然科学基金重点项目(N o.39730310,39970247),国家自然科学基金项目(N o.39900041,39900074)与军事医学科学院科技创新研究启动基金(N o.9905105)部分资助3联系人 T el:(010)66931246,Fax:(010)68214653E2m ail:hefc@nic.bm 邢桂春,女,1961年9月生,实验师R eceived:July17,2000;A ccep ted:O ctober9,2000Partially suppo rted by N ati onal H igh T echno logy“863”P rogram(102210204204),N ati onal N atural Science Foundati on of Ch ina fo rKey P ro ject(N o.39730310,39970247),N ati onal N atural ScienceFoundati on of Ch ina(N o.39900041,39900074)and InitiativeFoundati on fo r Scientific and T echno logical Innovati on of A cadem icM ilitary M edical Science(N o.9905105)3Co rresponding autho r T el:(010)66931246,Fax:(010)68214653E2m ail:hefc@nic.bm 采用RACE技术获得全长人新基因M AGE-D1邢桂春, 张成岗, 魏汉东, 贺福初3(军事医学科学院放射医学研究所,北京 100850)摘要 c DNA末端快速扩增(RA CE)技术是快速获得新基因5′和3′端未知序列的有效手段Λ鉴于新报导的人肿瘤基因M A GE家族成员之一M A GE2D1的c DNA序列不完全,从而拟用RA CE技术获得M A GE2D1的全长c DNA序列Λ结果显示,M A GE2D1的c DNA全长为2800个碱基,编码778个氨基酸Λ同时对RA CE技术应用时的一些关键问题进行了讨论Λ关键词 c DNA末端快速扩增技术,人黑色素瘤抗原相关基因D1,全长c DNA序列中图分类号 Q503Full-length Clon i ng of Hu man M elanoma An tigen-encod i ng Gene D1Usi ngRap id Am pl if ica tion of cD NA EndsX I N G Gu i2chun,ZHAN G Cheng2gang,W E I H an2dong,H E Fu2chu3(Institu te of R ad iation M ed icine,A cad e my of M ilitary M ed ical S cience,B eij ing 100850,Ch ina)Abstract R ap id am p lificati on of c DNA ends(RA CE)is a pow erfu l techn ique to ob tain unknow n sequence of5′2term inal o r3′2term inal p art of a new gene.A s the c DNA sequence of the new ly discovered tum o r2related gene M A GE2D1is no t in fu ll length,RA CE w as u sed to study the5′2 term inal of th is c DNA.T he resu lt show ed that the fu ll2length c DNA sequence of M A GE2D1is 2800bp in size and encodes a po lyp ep tide of778am ino acids.Som e key p rob lem s w ere discu ssed in RA CE.Key words rap id am p lificati on of c DNA ends,hum an m elanom a an tigen2encoding gene D1,fu ll2 len th c DNA sequence 目前通过对c DNA文库进行大规模DNA测序获得了大量的表达序列标签(exp ressed sequence tag,EST)序列[1]Λ同时采用差异显示PCR(differen t disp lay2PCR,DD2PCR)和代表性显示技术(rep resen tati on disp lay analysis,RDA)等一系列技术所获得的具有潜在重要功能意义的EST片段的数量也在日益增加[2,3]Λ在第116版GenB ank数据库中已经有四百多万条EST序列Λ然而,这些EST 片段所对应新基因全长序列的获得仍然是进行新基因功能研究的一个主要障碍Λ虽然基于网络进行序列分析以及核酸序列的电子延伸等在一定程序上可帮助获得较长的c DNA序列,但是此种策略往往不能得到全长c DNA序列Λ常用的通过文库筛选获得新基因的全长c DNA序列的方法则具有操作繁琐、实验周期较长等缺点Λ相比之下,近年出现的“c DNA末端快速扩增”(rap id am p lificati on of c DNA ends,RA CE)技术,则具有较强的优势Λ其原理是使用O ligo(dT)对m RNA进行反转录的同时在两头加上通用接头(引物),从而可利用基因特异的引物(gene sp ecific p ri m er ,GSP )通过PCR 反应快速获得目的序列的5′端和3′端[4～6],而且已经有较多成功的例子[7]Λ最近我们在对4～6月孕龄人胎肝c DNA 文库进行随机克隆,筛选并进行大规模DNA 测序中发现了一个克隆,其插入片段全长为1450bp Λ序列相似性分析提示,其所对应的基因可能是肿瘤相关M A GE 基因家族的新成员Λ随后Po ld 等报导了该基因,并命名为M A GE 2D 1[8]Λ然而,Po ld 等所报导的该基因序列的长度(1734bp )远远短于N o rthern 印迹的实验结果(约218kb )Λ我室通过电子延伸将该基因的长度增加到2030bp ,然而,仍然未能达到其全长Λ鉴于该基因的重要性并且其3′端已经获得(加尾信号和Po ly (A )均已经出现),因此,我们采用5′2RA CE 技术获得了此基因c DNA 的5′端,进而获得了此基因的全长c DNA 序列Λ现报导如下Λ1 材料和方法111 试剂及试剂盒人正常的组织N o rthern 膜购自CLON T ECH ΛS M A R TTMRA CE c DNA Am p lificati on K it 购自CLON T ECH ΛMM LV 反转录酶Sup erscri p t (200U Λl )购自G I BCO ΛA dvan tage ○RGC genom ic PCR K it 购自CLON T ECH Λp GE M 2T 载体为P rom ega公司产品ΛPE 480型PCR 仪为PE 公司产品Λ112 引物设计与合成通过电子延伸,该序列的长度已经达到2030bp Λ采用P ri m er P rem ier 软件[9],按照S M A R TRA CE 试剂盒的要求“23～28n t 、50%～70%GC 比例、T m ≥65℃”设计一系列RA CE 引物:P 144:5′2CGA GGA GGCCCGCA CCA CA GTCC A T T T TCT 23′,P 145:5′2GGGTCT TA GGCCT GCT GT T GGC CA GGTC 23′,P 121:5′2GT GGTCA CT GGAA CT GGT GCA G A 23′,P 122:5′2A TA CCCA GA CCCA GAA T GTAAA TCA GG 23′Λ这些引物与模板的匹配方式见F ig .1.所设计的引物均由大连宝生物工程(T akara )公司合成Λ使用浓度均为10Λm o l LΛF ig .1 R elative po siti ons of different RA CE p ri m ers in the sequence of hum an M A GE 2D 1113 Northern 印迹分析用引物对p 70(5′2CCCTCGA GA T GCCTCCAGA CT GGCAA GG 23′)和p 71(5′2GCTCTA GA T CA CTCAA CCCA GAA G 23′),从含有M A GE 2D 1部分序列的质粒中扩增出目的片段,琼脂糖凝胶电泳回收纯化后用随机引物标记试剂盒(PROM EGA )标记探针ΛN o rthern 杂交过程严格按照操作流程进行Λ洗膜后压片于-70℃,2d 后显影Λ114 5′-RACE按照试剂盒的操作流程进行Λ首先进行反转录反应,制备5′2RA CE 2R eady c DNA Λ其具体流程为:取015Λl Epp endo rf 管,加入1Λl 人胎盘总RNA 、1Λl 5′2CD S 引物、1Λl S M A R T o ligo 引物(10Λm o l L )和2Λl 灭菌水,轻轻混匀,于70℃加热2m in ,置冰上冷却2m in ,离心使液体沉底Λ加入2Λl 5×第1链缓冲液、1Λl D T T (20mm o l L )、1Λl dN T P (10mm o l L )和1Λl MM LV 逆转录酶(200U Λl ),随后用小枪头轻轻吹打混匀,离心使液体沉底Λ反转录于42℃115h ,加入100Λl 灭菌水,于70℃加热2m in 终止反转录反应,冻存于-20℃备用Λ随后,采用通用引物混合物(un iversal p ri m er m ix ,U PM )和P 121为引物进行“Touchdow n ”PCR 扩增[10]Λ向50Λl PCR 反应管中加入以下试剂:3415Λl 去离子水、5Λl 10×A dvan tage 2PCR 缓冲液、1Λl dN T P (10mm o l L )、1Λl 50×A dvan tage 2Po lym erase M ix 、5Λl U PM (10×)、1Λl P 121(10Λm o l L )和215Λl 5′2RA CE 2R eady c DNA ,振荡混匀、离心沉底,覆以2滴石腊油,在Perk in 2E l m er (PE )DNA T herm al Cycler 480启动PCR 反应,条件为:5×(94℃30s ,72℃3m in ),5×(94℃30s ,70℃30s ,72℃3m in ),5×(94℃30s ,68℃30s ,72℃3m in )Λ用112%琼脂糖凝胶电泳并回收所需402中国生物化学与分子生物学报17卷条带Λ随后分别使用P 122+P 121和巢式通用引物(nest un iversal p ri m er ,NU P )+P 144进行巢式PCR 鉴定、U PM +P 145进行RA CE PCR 扩增、U PM +P 144进行RA CE PCR 扩增ΛPCR 条件同上Λ所扩增的片段均用112%琼脂糖凝胶电泳回收,克隆至p GE M 2T 载体并用377XL 测序仪(PE 公司)测序Λ115 序列拼接将已知模板和5′2RA CE 获得的新片段用运行于苹果机上的Sequencher TM 软件进行序列拼接,结合测序峰图进行序列校正,最后获得拼接好的序列Λ116 全长序列鉴定根据拼接好的序列,分别在5′和3′末端设计一对引物P 159:5′2CT GCCGCGCT GGCA T T TCTCCT G GT 23′P 160:5′2CA CT T T GCAA T T TCAA T GT TA T T TC 23′从人胎盘总RNA 经O ligo (dT )引导反转录形成的c DNA 中扩增M A GE 2D 1基因的全长c DNA序列,PCR 条件同前Λ所扩增的片段用112%琼脂糖凝胶电泳回收,克隆至p GE M 2T 载体,并用377XL 测序仪(PE 公司)全长测序进行鉴定Λ2 结果211 Northern 印迹实验采用N o rthern 印迹检测发现,人M A GE 2D 1在所有被检测的正常组织中均含有一个218kb 的转录本(F ig .2)ΛF ig .2 N o rthern blo t analysis of hum an M A GE 2D 1exp ressi on in no rm al tissues1.Sp leen ;2.T hym us ;3.P ro state ;4.T estis ;5.O vary ;6.Sm all intestine ;7.Co lon (m uco sal lining );8.Peri pheral blood leukocyte212 5′-RACE使用引物U PM 和P 121进行RA CE PCR 反应,获得单一DNA 条带(A ),估计长度为110kb .以条带A 为模板,使用引物P 122和P 121进行PCR 鉴定,获得单一DNA 条带,估计长度为013kb .以条带A 为模板,使用NU P +P 144进行PCR 鉴定,获得单一DNA 条带(B ),估计长度为012～013kb Λ使用引物U PM 和P 145进行RA CE PCR 反应,产物呈现“Sm ear ”状态,未能获得单一DNA 条带;使用引物U PM 和P 144进行RA CE PCR 反应,获得单一DNA 条带(C ),估计长度为012～013kb Λ将这些条带(A 、B 、C )电泳回收后克隆于p GE M 2T 载体测序,长度分别为1071bp 、234bp 和257bp (F ig .3)ΛF ig .3 T he PCR fragm ents of hum an M A GE 2D 1obtained using 5′RA CEM 1:DNA M arker DL 215000(large size );1:P159+P160(full length c DNA of M A GE 2D 1);2:P 122+P 121(0.3kb );3:U PM +P 144(257bp );4:U PM +P 145(Sm ear );5:NU P +P 144(234bp );6:U PM +P 121(1071bp );M 2:DNA M arker DL 22000(s m all size )213 序列拼接将已知模板序列和通过5′2RA CE 获得的新片段用Sequencher TM 软件进行序列拼接,并结合测序峰图进行校正,获得拼接好的序列,结果见F ig .4Λ214 M AGE -D 1全长c D NA 序列鉴定使用引物对P 159和P 160从人胎盘c DNA 文库中扩增出单一DNA 条带,估计长度为218kb Λ该片段电泳回收后,克隆至p GE M T 载体测序,序列结果见F ig .5.结果显示M A GE 2D 1的c DNA 全长为2800bp ,编码778个氨基酸,比Po ld 等所报导的574个氨基酸更长,表明应用5′2RA CE 技术对M A GE 2D 1进行了有效延伸Λ3 讨论本文报导了应用5′2RA CE 技术获得人新基因M A GE 2D 1全长c DNA 序列的过程Λ目前关于该基因的功能研究正在进行中Λ目前常用的RA CE 策略主要有两类:一种以502第2期邢桂春等:采用RA CE 技术获得全长人新基因M A GE 2D 1 F ig.4 5′2RA CE results of hum an M A GE2D1A:Contig analysis of the fragm ents of5′2RA CE results of hum an M A GE2D1, B:Sequence structure of the fragm ents of5′2RA CE results of hum an M A GE2D1CLON T ECH的M arathon TM技术为代表;一种以CLON T ECH的S M A R T RA CE技术为代表[11]Λ前者是已经对特定组织m RNA完成反转录并加好接头(A dap to r)的c DNA(称为“非克隆c DNA文库”),用户可使用自己的引物和试剂盒中提供的接头引物配合直接从中扩增c DNA末端,而后者则需要用户自己进行反转录反应,在反转录反应进行到m RNA的5′末端时,反转录酶Sup erScri p t 所具有的“模板跳转”功能会将一个特定的接头(S M A R T“ ”O ligonucleo tide:5′2AA GCA GT G GTAA CAA CGCA GA GTA CGCGGG23′)添加到m RNA的5′末端并继续进行反转录反应,直至达到外加接头的末端Λ同时,在用O ligo(dT)启动反转录反应时,也可将接头序列引入,从而使得3′RA CE 可行Λ我们曾先后使用这两种试剂盒进行RA CE反应,结果发现使用M arathon TM所得到的片段总是比采用S M A R T RA CE试剂盒所得到的片段短,有的甚至可达到170bp(资料未提供)Λ这一结果也曾见于他人报导,其原因在于M arathon TM技术中反转录反应往往不能真正到达m RNA的5′末端Λ所以,进行RA CE反应时应当优选S M A R T RA CE试剂盒Λ引物设计是RA CE反应是否能够成功的决定性因素Λ设计具有较高GC比例(50%～70%)、较高T m值(70℃以上)的引物是提高产物特异性的最根本因素Λ这是因为所使用的PCR模板是组织中总m RNA进行反转录的产物,理论上含有该组织的全602中国生物化学与分子生物学报17卷F ig.5 Full2length c DNA sequence of hum an M A GE2D1T he arrow s(↓)indicate start of p revi ously repo rted M A GE2D1c DNA sequence and am ino acid sequences[8],respectively部表达基因,所以一旦引物的特异性较差,则极易导致形成非特异产物,从而导致实验的失败Λ在本实验过程中,引物P145持续产生非特异的扩增结果,只有放弃Λ为了估计所设计的引物的特异性,最好将该引物与GenB ank数据库中的已知基因进行序列相似性分析Λ如果该引物的3′2末端有数十个碱基和某个已知基因100%匹配,则应坚决弃之不用,因为后续PCR反应中很可能将此已知基因扩增出来Λ另外一个较好的方案是采用巢式引物进行第二次或者第三次PCR扩增,借此可初步鉴定第一次PCR扩增的结果是否正确ΛRA CE实验中常见的问题包括无扩增条带、扩增条带出现s m ear现象或者扩增条带不唯一Λ无扩增条带提示所选m RNA的组织很可能不是该基因的高表达组织,可结合多组织斑点印迹(Do t b lo t)、多组织N o rthern印迹或者多组织R T2PCR的结果选择该基因的高表达组织进行RA CE反应Λ其余问题大多数在于PCR反应时条件未能优化Λ例如,模702第2期邢桂春等:采用RA CE技术获得全长人新基因M A GE2D1 板量过大、退火温度较低或者PCR反应循环次数过多等均可能造成非特异产物的累积,从而导致s m ear现象或者多条PCR产物的出现Λ在进行5′2 RA CE反应时,PCR反应时所采用的酶是一个十分重要的因素Λ根据我们的经验,应当首选能够扩增含有GC高比例的DNA聚合酶Λ这是因为越靠近m RNA的5′末端,GC比例一般越高Λ然而,问题并非如此绝对Λ在我们进行M A GE2D1基因5′2RA CE 实验中,由于使用了针对GC高比例的DNA聚合酶,反而导致了非特异结果的产生(数据未显示)Λ所以,对PCR反应条件进行反复调试是RA CE实验中必须的Λ提高5′2RA CE成功率的一个策略是使用随机引物启动反转录反应Λ这是由于对于某些模板而言,当仅仅采用O ligo(dT)启动反转录反应时,由于RNA中间可能具有的二级结构等往往使得反转录反应提前终止,不能达到m RNA的5′2末端,而采用随机引物启动反转录反应,则可能越过RNA中间可能具有的二级结构而使得反转录过程能够达到m RNA的5′2末端,从而获得目的基因的全长序列Λ进一步而言,同时采用随机引物和O ligo(dT)启动反转录反应,则能够更好地提高所获得的“非克隆c DNA文库”的质量,是一个更好的选择Λ需要指出的是,当使用RA CE技术去获得新基因的末端片段时,所获重组克隆最好能够全部测序Λ这是因为即使RA CE反应结果中只有一条DNA条带,其长度也可能有部分差异Λ在常规的1%左右浓度的琼脂糖凝胶电泳中,数十甚至100个左右碱基的差别在大体长度为1kb的片段中是肉眼难以区分出来的Λ所以,挑选全部阳性重组克隆进行测序将有可能获得新基因的全长序列Λ总之,因为其核心基于PCR反应,所以,RA CE 实验结果中扩增产物的假阳性和假阴性往往是困扰科研人员的最大问题Λ但是,正是由于RA CE技术较之经典的文库筛选方法具有快速、有效的优点,这使得RA CE技术在新基因全长克隆方面的应用越来越多Λ参考文献(References)1 Co llins F S,Patrino s A,Jo rdan E,Chak ravarti A,Gesteland R, W alters L.N ew goals fo r the U.S.H um an Genom e P ro ject: 1998-2003.S cience,1998,282:682～6892 M atz M V,L ukyanov S A.D ifferent strategies of differential disp lay:areas of app licati on.N ucleic A cid s R es,1998,26(24): 5537～55433 W ang X,B row nstein M J,Young W S.PG25,a p ineal2specificc DNA,cloned by differential disp lay PCR(DD PCR)and rap idamp lificati on of c DNA ends(RA CE).J N eu rosci M ethod s, 1997,73(2):187～1914 Bo rson N D,Sato W L,D rew es L R.A lock2dock ing o ligo(dT) p ri m er fo r5′and3′RA CE PCR.PCR M ethod s A pp lic,1992,2: 144～1485 Feh r C,F ickov M,H iem ke C,D ahm 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lificati on.N ucleic A cid s R es,1991,19:400811 M atz M,Shagin D,Bogdanova E,B ritanova O,L ukyanov S,D iatchenko L,Chench ik A.Amp lificati on of c DNA ends basedon temp late2s w itch ing effect and step2out PCR.N ucleic A cid s R es,1999,27(6):1558～1560802中国生物化学与分子生物学报17卷。
RACE原理及其应用
RACE 的简介目前，全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。
尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA 通过转录获得全长cDNA 很困难。
近年来发展成熟的cDNA 末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长cDNA 提供了一个便捷的途径。
cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends，RACE)技术是一种基于 mRNA 反转录和 PCR 技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点，扩增基因转录本的未知区域，从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。
简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA 简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点，可同时获得多个转录本。
因此近年来RACE 技术已逐渐取代了经典的cDNA 文库筛选技术，成为克隆全长 cDNA 序列的常用手段。
第二 RACE 的原理RACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’ 末端，是一种简便而有效的方法，又被称为锚定PCR (anchoredPCR)和单边 PCR(one2side PCR)。
3’RACE 的原理一)加入 oligo(dT)17 和反转录酶对 mRNA 进行反转录得到(-)cDNA；二)以 oligo(dT)l7 和一个 35bp 的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组 DNA 中罕见的限制酶的酶切位点。
这样就在未知cDNA 末端接上了一段特殊的接头序列。
再用一个基因特异性引物(3 amp)与少量第一链(-)cDNA 退火并延伸，产生互补的第二链(+)cDNA。
三)利用 3amp 和接头引物进行 PCR 循环即可扩增得到 cDNA 双链。
扩增的特异性取决于 3amp 的碱基只与目的 cDNA 分子互补．而用接头引物来取代 dT17 一 adaptor 则可阻止长(dT)碱基引起的错配。
RACE技术
RACE技术第一 RACE的简介目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。
尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。
近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长cDNA提供了一个便捷的途径。
cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA 反转录和PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。
简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。
因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。
随着分子生物学技术的发展，科学家结合其他不同的分子生物学技术对最初的RACE 技术进行了改进，从而丰富了ＲＡＣＥ技术的类型。
目前使用的RACE技术包括：经典RACE、Adapter Ligated RACE、RLM-RACE、Cap-switching RACE、环形RACE、RAC-RACE和T-RACE等等，但没有一种RACE技术适合克隆所有类型的RNA。
因此，本文将通过介绍各种RACE技术的发展、原理及应用，比较认识各种RACE技术的优缺点，并对RACE的前景进行讨论。
第二RACE的原理1.经典RACERACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。
①3’RACE的原理一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。
CDNA末端快速扩增技术(RACE)简介
CDNA末端快速扩增技术(RACE)简介CDNA末端快速扩增技术(RACE)是一种利用PCR技术从低丰度的转录本中快速获取CDNA的5’和3’末端序列的方法。
这种方法的优点是简单、快速、廉价，可以用于研究基因的结构和表达。
RACE技术有两种主要类型，分别是3-RACE和5-RACE，分别用于扩增CDNA的3’和5’末端序列。
3-RACE原理和步骤3-RACE原理是利用mRNA的3’末端的poly (A)尾巴作为一个引物结合位点，用一个带有SMART序列的通用接头引物Oligo(dT) 30MN作为锁定引物，反转录合成第一链cDNA。
然后用一个基因特异引物GSP1作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM作为下游引物，以第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因3’末端的DNA片段扩增出来。
3-RACE步骤如下：•从RNA样品中提取mRNA，并用Oligo(dT) 30MN作为锁定引物进行反转录反应，合成第一链cDNA。
•用GSP1和UPM作为引物进行第一轮PCR反应，扩增出包含目的基因3’末端序列和接头序列的片段。
•从第一轮PCR产物中纯化出目标片段，并用UPM和另一个靠近GSP1的内嵌引物GSP2进行第二轮PCR反应，扩增出更精确的目标片段。
•从第二轮PCR产物中纯化出目标片段，并进行克隆、测序和分析。
5-RACE原理和步骤5-RACE原理是先利用mRNA的3’末端的poly (A)尾巴作为一个引物结合位点，用oligo (dT) 30MN作为锁定引物，在反转录酶MMLV作用下，反转录合成第一链cDNA。
利用该反转录酶具有的未端转移酶活性，在反转录达到第一链的5’末端时自动加上3-5个(dC)残基，与含有SMART序列的Oligo (dG)通用接头引物配对后，继续延伸而连上通用接头。
然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM作为上游引物，用一个基因特异引物GSP2作为下游引物，以第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5’末端的cDNA片段扩增出来。
race法获得全长cdna序列的过程
race法获得全长cdna序列的过程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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RACE
RACE技术的简介cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。
完整的cDNA 序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。
末端克隆技术是20世纪80年代发展起来的。
RACE(rapid-amplification of cDNA ends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。
RACE的优点与筛库法相比较，有许多方面的优点1）此方法是通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。
2）节约了实验所花费的经费和时间。
3）只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长。
RACE引物的设计：基因特异性引物（GSPs）应该是：23－28nt50－70％GCTm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。
反应中涉及到的一些事项cDNA的合成起始于polyA+RNA。
如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。
RACE PCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。
在进行5‘和3’RACE PCR的时候应该使用热启动。
表4中给出了所有引物的相互关系。
重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。
另外，重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照。
并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。
引物GSP中的GC含量要在50－70％之间。
这样可以使用降落PCR。
避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和如果要用重叠片段来检测设计的引物，GSp1和GSp2之间至少是100－200碱基。
只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。
降落PCR可以明显的增加RACE PCR产物的特异性。
在最开始的循环中，退火温度高于AP1引物的Tm值，可以增加对特异性条带的扩增。
RACE技术的原理和操作
RACE技术的原理和操作RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）技术是一种用于扩增cDNA末端序列的方法，广泛应用于克隆和鉴定未知基因的研究中。
下面将详细介绍RACE技术的原理和操作步骤。
一、原理：RACE技术是通过逆转录反应将RNA转录成cDNA，然后利用特殊的引物设计，通过聚合酶链式反应（PCR）进行扩增，最终得到所需的cDNA末端序列。
RACE技术主要包括5'-RACE和3'-RACE两个步骤。
5'-RACE：用于扩增未知序列的5'端操作步骤：1.提取总RNA，并进行逆转录反应，得到第一链cDNA。
2.利用聚dT载体和逆转录酶进行第二链合成。
3.利用内源引物（如具有较高表达的基因的已知序列）和外源引物A 进行PCR扩增。
4. 应用Nested PCR进行第二轮扩增，内嵌引物（nested primer）会在前一轮PCR反应的基础上扩增更长的特异性产物。
5.得到扩增的特异性产物后，纯化PCR产物并进行测序分析，获得5'端的未知序列。
3'-RACE：用于扩增未知序列的3'端操作步骤：1.提取总RNA，并进行反转录反应。
2.利用特异性引物（如基因的已知3'端序列）和逆转录酶进行第一轮PCR扩增。
3. 利用Nested PCR进行第二轮扩增，内嵌引物（nested primer）会在前一轮PCR反应的基础上扩增更长的特异性产物。
4.纯化PCR产物并进行测序分析，获得3'端的未知序列。
二、操作：1. 提取总RNA：一般使用RNAiso Plus试剂或类似试剂从细胞或组织中提取总RNA。
2. 逆转录反应：利用逆转录酶将RNA转录成cDNA。
逆转录酶一般有M-MLV逆转录酶和SuperScript III等。
3.第一链合成：利用聚克隆酶将逆转录的cDNA合成第一链，即得到第一链cDNA。
4.第二链合成：利用特殊的引物和逆转录酶将第一链cDNA合成第二链。
RACE原理及应用
RACE的简介目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。
尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。
近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长 cDNA 提供了一个便捷的途径。
cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA反转录和 PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。
简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。
因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。
第二 RACE的原理RACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定 PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。
3’RACE的原理一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。
这样就在未知cDNA末端接上了一段特殊的接头序列。
再用一个基因特异性引物(3 amp)与少量第一链(-)cDNA退火并延伸，产生互补的第二链(+)cDNA。
三)利用3amp和接头引物进行PCR循环即可扩增得到cDNA双链。
扩增的特异性取决于3amp的碱基只与目的cDNA分子互补．而用接头引物来取代dT17一adaptor则可阻止长(dT)碱基引起的错配。
cDNA获取方法
索取条款本着科研工作者之间互通有无的原则，非营利性质的研究机构的科研人员可向本实验室索取我们收集的人类全长cDNA，请在索要cDNA前，详细阅读本索取条款。
1.索取人不得将cDNA转让于第三方或用于商业用途。
2.按照本实验室提供的方法，索取人可以使用PCR方法方便快速地克隆相应基因，但我们不能保证所提供的cDNA一定能够满足索取人的实验要求，不过我们欢迎索取人的反馈。
3.本实验室收集的cDNA数量众多，信息繁杂，不便查询，无法提供除cDNA序列以外的任何信息，请勿询问。
4.本实验室对提供cDNA不收取任何费用，请索取人自付邮资（邮资到付）。
此外，因本实验室人力有限，索取的样品一般情况下不能多于10个/次，如有特殊需求，可以直接跟我们联系协调。
本实验室每周寄出一至两次样品，在寄出样品后，我们会邮件通知。
本校实验室凭打印的邮件直接来本实验室领取。
5.通过该网站仅能索取我们收集的cDNA，如需要我们发表的文章中所用到的质粒，请另外来信索取。
6.请严格按该方法通过PCR来扩增cDNA，否则可能将无法得到需要的cDNA。
cDNA获取方法本实验室提供的cDNA样品为100 μL含抗生素的菌液。
收到菌液后，请先确认菌液是否浑浊，若菌液澄清，请先在37度摇床上过夜培养后再使用。
另外，由于我们在建库时，每管中可能含有不只一种cDNA，因此不推荐将菌液在平板上划线后挑取单克隆进行扩增。
根据我们的测试，使用此方法获取目的cDNA的概率达95%以上。
具体方法如下：1.取1 μL菌液为模板，PCR扩增全长cDNA。
我们网站上的核酸序列为cDNA的实际序列，因此设计引物时，请严格按照我们提供的序列设计引物。
PCR体系一定要有去污剂（如，Triton X-100），我们推荐的PCR体系如下：菌液模板 1 μL10× PCR buffer 5 μL10 mM dNTP mix 1 μL10 μM Forward Primer 1 μL10 μM Reverse Primer 1 μLTaq 2.5 UH2O 至总体积50 μL提示：1)实际上，很多（但不是全部）商业化的高保真酶同样可以用来扩增该cDNA，但是必须确保反应的体系中含有去污剂。
cDNA获取方法
索取条款本着科研工作者之间互通有无的原则，非营利性质的研究机构的科研人员可向本实验室索取我们收集的人类全长cDNA，请在索要cDNA前，详细阅读本索取条款。
1.索取人不得将cDNA转让于第三方或用于商业用途。
2.按照本实验室提供的方法，索取人可以使用PCR方法方便快速地克隆相应基因，但我们不能保证所提供的cDNA一定能够满足索取人的实验要求，不过我们欢迎索取人的反馈。
3.本实验室收集的cDNA数量众多，信息繁杂，不便查询，无法提供除cDNA序列以外的任何信息，请勿询问。
4.本实验室对提供cDNA不收取任何费用，请索取人自付邮资（邮资到付）。
此外，因本实验室人力有限，索取的样品一般情况下不能多于10个/次，如有特殊需求，可以直接跟我们联系协调。
本实验室每周寄出一至两次样品，在寄出样品后，我们会邮件通知。
本校实验室凭打印的邮件直接来本实验室领取。
5.通过该网站仅能索取我们收集的cDNA，如需要我们发表的文章中所用到的质粒，请另外来信索取。
6.请严格按该方法通过PCR来扩增cDNA，否则可能将无法得到需要的cDNA。
cDNA获取方法本实验室提供的cDNA样品为100 μL含抗生素的菌液。
收到菌液后，请先确认菌液是否浑浊，若菌液澄清，请先在37度摇床上过夜培养后再使用。
另外，由于我们在建库时，每管中可能含有不只一种cDNA，因此不推荐将菌液在平板上划线后挑取单克隆进行扩增。
根据我们的测试，使用此方法获取目的cDNA的概率达95%以上。
具体方法如下：1.取1 μL菌液为模板，PCR扩增全长cDNA。
我们网站上的核酸序列为cDNA的实际序列，因此设计引物时，请严格按照我们提供的序列设计引物。
PCR体系一定要有去污剂（如，Triton X-100），我们推荐的PCR体系如下：菌液模板 1 μL10× PCR buffer 5 μL10 mM dNTP mix 1 μL10 μM Forward Primer 1 μL10 μM Reverse Primer 1 μLTaq 2.5 UH2O 至总体积50 μL提示：1)实际上，很多（但不是全部）商业化的高保真酶同样可以用来扩增该cDNA，但是必须确保反应的体系中含有去污剂。
RACE的技术原理和操作
RACE的技术原理和操作RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）是一种用于扩增cDNA末端的技术，主要用于确定基因的结构和转录起始位点。
RACE技术的关键步骤包括cDNA合成、RNA末端修饰、RACE PCR、校正反应和测序。
下面将详细介绍RACE技术的原理和操作步骤。
首先，RACE技术需要提取待研究的组织或细胞中的总RNA，使用反转录酶通过逆转录反应合成第一链cDNA。
反转录反应的关键是引入适配器序列（adaptor sequence）到cDNA末端，这样可以提供引物（primer）结合的位点。
接下来，使用指定酶（比如TdT）对合成的cDNA末端进行修饰。
修饰反应通常使用非模板化的端粒酶，这样可以在cDNA的3'末端添加poly-A尾。
添加poly-A尾的目的是为了提高引物的亲和性和特异性，同时也是为了提高RT-PCR的反应效率。
然后，在修饰的cDNA末端使用逆转录引物（gene-specific primer，GSP）和转录启动座位引物（TSP）进行PCR扩增。
逆转录引物是根据已知基因序列的3'末端设计的，它与cDNA的修饰末端具有互补性。
转录启动座位引物是根据已知基因序列的5'末端设计的，它也与cDNA的修饰末端具有互补性。
PCR反应的条件和步骤与常规PCR相似，但使用了增长温度梯度，以优化反应条件。
PCR反应通常包括初步扩增和内部扩增。
初步扩增通过扩增初始cDNA的末端，避免其它非特异性产物的扩增。
内部扩增是针对初步扩增产物进行的，目的是获得特异性较强的产品。
在内部扩增中，逆转录引物和转录启动座位引物的使用与初步扩增相同。
完成PCR反应后，需要验证PCR产物的特异性。
通常，可以通过凝胶电泳分析PCR产物来确定其大小和特异性。
如果PCR产物存在多个带或杂带，可能需要优化PCR反应的条件。
对于RACE技术最关键的一步是校正反应（nested PCR）。
RACE技术的原理和操作
RACE技术的原理和操作近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术二基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。
但上述方法人多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。
cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE）是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。
经典的RACE技术是由Frohman等（1988）发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的c DNA5'和3'端，包括单边PCR和锚定PCR。
该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点（Frohman等，1995：Schaefer，l995： Chen，1998： Bespalova等，1998： Matz等11999）。
对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进：改进之一是利用锁定引物（（lock docking primer）合成第一链cDNA，即在oligo（dT）引物的3' 端引入两个简并的核苷酸【5'-Oligo（dT）16-30MN-3'，M=A/G/C；N=A/G/C/T】，使引物定位在poly（A）尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo（dT）与poly（A）尾的任何部位的结合所带来的影响；改进之二是在5' 端加尾时，采用poly（C），而不是poly（A）；改进之三是采用RNase H-莫洛尼氏鼠白血。
病毒（MMLV）反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温（60℃ -70℃）有效地逆转录mRNA，从而消除了5 '端由于高CC含量导致的mRNA 二级结构对逆转录的影响；改进之四是采用热启动PCR （hot start PCR）技术和降落P CR（touch down PCR）提高PCR反应的特异性。
RACE原理及实验步骤
的结合所带来的影响；
2
在5' 端加尾时，采用poly（C），而不是poly（A）
采用RNase H-莫洛尼氏鼠白血病毒（MMLV）反转录酶
3
或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温（60℃ -70℃）有效
地逆转录mRNA，从而消除了5'端由于高CC含量导致的
mRNA 二级结构对逆转录的影响；
采用热启动PCR （hot start PCR）技术和降落
SMARTTM 5'-RACE 的原理
5’ RACE流程图
五、cDNA 末端的快速扩增(RACE)
主要步骤：
1、PCR 反应混合液的准备：确保混合液体积足够所有的 PCR反应和一次额外的反应。该混合液用于5'- 和 3'RACE 反应。 对于50-µl PCR 反应，所混合的成份如下：
2、漩涡混合（不要产生气泡），短暂离心。
Southern blotting：
Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位 的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切 酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链 DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者 紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交， 用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含 量。
一、成分及另备物品
保存条件： 1. Control Human PlacentalTotal RNA
和 BD SMART II A Oligonucleotide在– 70°C下保存。 2. NucleoTrap Gel Extraction Kit 室温下 保存。 3. 其余试剂–20°C下保存。
(Cat.Nos.639206/639207) Advantage 2 Polymerase Mix
RACE原理及实验步骤
RACE原理及实验步骤RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增和克隆未知DNA序列的两端。
通过RACE技术，研究人员可以对未知基因的序列进行扩增和鉴定，从而了解该基因的结构和功能。
RACE技术主要包含两个步骤：首先是逆转录，将RNA转录为cDNA，然后是扩增，利用特定的引物扩增未知序列。
下面将详细介绍RACE技术的步骤和操作方法。
实验步骤：1.RNA提取：首先需要从组织或细胞中提取RNA。
可以使用常见的RNA提取试剂盒，按照厂家提供的操作指南进行操作。
2.逆转录：使用逆转录酶将RNA转录为cDNA。
逆转录可以选择两种方法：随机引物逆转录和基因特异引物逆转录。
-随机引物逆转录：在反应体系中添加随机引物，以确保逆转录反应能逆转录所有RNA分子。
将RNA与随机引物一起孵育，使得引物能够与RNA序列互相结合，并成为逆转录反应的起始点。
逆转录反应通常在37-42°C进行，持续1-2小时。
-基因特异引物逆转录：如果已知目标基因的部分序列，可以使用基因特异引物逆转录。
在逆转录反应系统中添加特异引物，使其与目标基因序列互补结合。
该方法提高了逆转录的特异性，从而只逆转录目标基因。
3.RACE扩增：使用扩增反应将目标序列扩增出来。
扩增过程通常使用PCR技术。
-5'RACE：首先进行5'RACE，即扩增未知基因序列的5'端。
为了扩增未知基因的5'端，需要将cDNA的3'端进行特定的修饰，以便进行扩增。
修饰通常包括尾修饰和连接转录片段引物。
然后使用尾修饰的cDNA和一个基因特异引物进行PCR扩增。
PCR反应条件根据实际情况进行优化，反应体系中应包括模板cDNA、引物、dNTPs和热稳定DNA聚合酶等。
- 3' RACE：进行3' RACE，即扩增未知序列的3'端。
在逆转录反应中添加一段poly(A)尾修饰，将逆转录产物转录为cDNA。
扩增基因全长实验技术
测序
PCR扩增
生物信息学分析
Ⅰ电泳检测 Ⅱ凝胶回收 Ⅲ电泳检测 Ⅳ克隆
PCR产物测序 凝胶回收测序 克隆后菌液测序 克隆后质粒测序
基因全长获取
RACE 简介 试剂盒 选取
5’RACE
原理 实验 过程
方法
RACE技术
RACE 简介
cDNA末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends, RACE) 技术是基于PCR技术由已知的部分cDNA序 列来获得完整cDNA序列的一种方法。 分为3’RACE 和5’RACE
家族成员多重比对pcr扩增凝胶回收测序?设计引物?提取rna?反转录?pcr扩增电泳检测凝胶回收电泳检测克隆?pcr产物测序?凝胶回收测序?克隆后菌液测序?克隆后质粒测序基因初步验证race技术方法race简介试剂盒选取5race原理实验过程基因全长获取cdna末端快速扩增rapidamplificationofcdnaendsrace技术是基于pcr技术由已知的部分cdna序序列来获得完整cdna序列的一种方法
获取基因全长基本流程
以本实验室具体情况为例子
构建数据库
库
筛选EST序列
普通PCR进行初步验证 RACE技术
筛选EST 基因初步验证
获取基因全长
进行全序列分析
生物信息学分析
基因初步验证
1. Blast比对 2. ORF比对 3. 相似序列 多重比对 4. 家族成员 多重比对 •设计引物 •提取RNA •反转录 •PCR扩增
实验 过程
RACE PCR
每50ul的体系中先合成41.5ul的Master Mix: 34.5ul 5.0ul 1.0ul 1.0ul PCR-Grade Water HiFi PCR Buffer dNTP HiFi Mix
cDNA末端快速扩增技术RACE
原理图
伸等方法来保证mRMA 5′末端的获取，但又需要大量的mRNA。
阳性对照RACE PCR实验
SMART RACE cDNA synthesis Kit原理
◇ Tota（l R3N）A无降解，OD260/280=1.
poly(C)替代poly(A)
利用GenBank 数据库中的表达序列标签(express sequence tags , ESTs) 拼接出全长或近全长cDNA 。
碱基互补 配对原则
AT之间 形成两个氢键
GC之间 形成三个氢键
poly(C)替代poly(A) 增加5′ 接头与cDNA 第一链的结合牢固性
增加模板中有效双链丰度 提高目的基因获取几率
SMART RACE cDNA synthesis Kit原理
cDNA第一链的合成机制
SMARTer RACE流程
基本RACE原理
♥ 技术背景 ♥ 基本RACE 原理和方法 ♥ 样品要求 ♥ RACE 产物的鉴定和全长
cDNA 的获得
技术背景
得到某基因的片段、全长或近全长cDNA的方法列标签(express
sequence tags , ESTs) 拼接出全长或近全长cDNA 。 是多聚酶链式反应即PCR。 用cDRNNAa末se 端保快护速、扩S1增核(R酸A酶C谱E)和技引术物。延
GSP1：5’-RACE PCR的反义引物 GSP2：3’-RACE PCR的正义引物
注意：GSP1与GSP2的Tm值要相似
GSP 与 cDNA 模板的关系
NGSP：槽式（Nested）PCR引物
扩增后的预期：
利用Oligo (dT) 对mRNA 进行反转录的同时在两头加上通用接头(引物) ， 目的序列的5′端和 利用GenBank 数据库中的表达序列标签(express sequence tags , ESTs) 拼接出全长或近全长cDNA 。 cDNA第一链的合成机制 ◇ 提取Total RNA的材料要新鲜，采样后立即放入液氮中速冻或加入样品稳定剂。 目的序列的5′端和 cDNA第一链的合成机制 ◇ Total RNA无降解，OD260/280=1. NGSP：槽式（Nested）PCR引物 基本RACE 原理和方法
获得真核生物cDNA全长
获得真核生物cDNA全长★miRNA(金币+1):请按照版规发贴！！！以后不要求一律清除，请修改！【资源】获得真核生物cDNA全长1．获得真核生物cdna全长总的思路分离基因一般就从中心法则dna、rna、蛋白质的三个层次入手做工作。
随生物信息学的发展，电脑克隆基因也称为新兴的技术。
从题目获得全长cdna的要求上讲，即使上述几个途径得到的是基因片断，现有的途径也是可以完成cdna 全长的获得的（如下图示）。
因此，cdna全长的获得是技术上可以解决的问题，而目的基因的寻找，特别是未知功能的基因的克隆是比较关键的问题，下面就基因克隆的方法做一简要介绍：2．基因克隆的方法简介2-1．基因克隆的方法策略选择原则从表3中可见分离克隆基因基本上有三种类型：即三中不同的条件，可根据欲克隆的目的基因选择条件选择相应的方法。
类型i已知基因的序列（1）已知dna序列，包括三种情况，一是已知目的基因的dna全部或部分dna序列（与题目要求略有出入）；二是已知其它物种的同类基因的dna序列（功能可能已知，与题目要求略有出入）；三是已知目的基因cdna全部或部分序列（属于题目要求已达到的类型）。
（2）已知目的基因表达产物蛋白等序列。
在这两种情况下一般采用pcr技术或探针分子杂交技术分离克隆目的基因。
类型ii已有基因图位或标记，转座子等条件，分别可采用转座子标签法、t-dna标签法及图位克隆技术进行分离克隆目的基因。
类型iii为止目的基因序列（1）差异表达序列，即目的基因表达具有组织、器官等时空差异性。
可以采用随机引物多态性扩增技术，定向引物扩增技术和ddrt-pcr、ssh-pcr、rap-pcr、dna-rda、cdna捕捉法等进行克隆。
（2）无差异表达的目的基因，可采用文库筛选法、功能蛋白分离法即直接测须发等进行，是难度较大较繁琐的策略。
从基因分离克隆的方法进行分类可分为三类：一种类型是功能克隆，即根据已知基因的产物推断出其相应核苷酸序列，再根据此序列合成寡聚核苷酸探针。