Lipofectamine2000降低HeLa细胞系中DNMT1的表达

2018年4月第38卷第4期
基础医学与临床
Basic &Clinical Medicine
April 2018
Vd.38 No.4
文章编号：1001-6325(2018)04-0535-03
Lipofectamine2000降低H e L a细胞系中DNM T1的表达
赵丹，程易尘，吴晓明，罗瑛，贾舒婷！
(昆明理工大学医学院，云南昆明650500)中图分类号:R737.33 文献标志码:A
D N A甲基化是一种非常重要的表观遗传修饰，在基因的 表达调控、基因组的稳定性和发育过程中都发挥着重要的作 用[1]。

D:A甲基化的维持由D:A甲基化转移酶家族成员 D:A甲基转移酶1(D:M T1)催化完成。

D:A甲基化水平的 改变，通常与D N M T1密切相关[3<]。

而Lipofectamine2000是 一种常用的阳离子脂质体转染试剂，广泛地应用于特定基因 的表达和敲低对细胞影响的研究。

而阳离子脂质体对细胞 有一定的毒性作用[5]。

转染试剂Lipofectamine2000会影响 细胞中D N M T1的表达，Lipofectamine2000对细胞的毒性作 用可能是通过D N M T1实现的。

因此本研究通对D N M T1在 Lipofectamine2000处理Hela和395-9B-1(小鼠胚胎成纤维细 胞）细胞不同时间后的表达情况进行检测，并探讨Lpo- fectamine2000对细胞的毒性作用。

1材料与方法
1.1材料:H e L a细胞、395-9B-1细胞、胎牛血清和胰蛋白酶 (Amresco 公司）；D M E M( Life Technologies 公司）；Lipo- fectamine2000( Invitrogen 公司）；5Aza (5-氮杂-2’-脱氧胞昔，Sigma 公司）；D N M T1和Qeta-actin 抗体（Santa Cruz 公司）。

1.2实验方法
1.2.1细胞培养及处理：将细胞置于10%胎牛血清的
D M
E M培养基中，37 g、5d C02培养箱中培养H e L a和395- 9B氮细胞，细胞覆盖率为90%时传代，达到70% ~ 80%用 Lipo2000处理。

具体步骤为：将 20 "LLipofectamine2000 加 人3 m L 0Pti氮M E M培养基中室温孵育25 min。

吸除细胞培 养液并用P B S清洗。

将上述混合液加人培养皿中，置于培养 箱中培养。

6 h后更换D M E M培养基终止处理，分别于处理 后24、48及72 h和7 d收集细胞沉淀，-80 g保存备用。

5A z处理细胞作为阳性对照。

1.2.2 R T氮C R检测D N M T1的m R N A表达：收集细胞沉淀 后，用 Trizol 提取总 R N A，以01igo-d (T)引物 GoScript™Reverse Transcription System 试剂盒（Promega 公司）进彳了反转录得到C D N A。

实验方法参照产品说明书。

引物序列，D N M T1正向弓|物5:C C G T G G C T A C G A G G A G A A C-3，，反向弓|物5，-T T G G G T T T C C G T T T A G T G G G G-31 Qeta-actin 正向引物51A G A G G G A A A T C G T G C G T G A C-3，，反向引物5,-C A A T A G T G
A T G A C C T G G C C G T-3,。

1.2. 3检测D N M T1蛋白表达:取适量上述细胞沉淀提取蛋 白，每孔加人15 "g蛋白进行S D S氮A G E凝胶电泳分离蛋白 (电泳条件:恒压140 V1. 5 h)。

再用300 V、180 m A湿转 3. 5 h至硝酸纤维素膜上，然后用5%脱脂奶粉室温封闭1 h。

再加人相应一抗室温反应3 h，用T B S T缓冲液洗涤3次，每 次5 m i n，后加人相应二抗，室温反应2 h，用T B S T洗涤6次，每次5 m m。

最后用显影液处理1 m m后用全自动洗片机进 行显影后的成像。

1. 3统计学分析:应用S P S S160统计软件，计量数据以均数 ±标准差()表示，组间比较采用方差分析。

2结果
2. 1Lipofectamine2000 处理影响H e L a细胞的状态：Lipo- fectamine2000处理后24 h细胞变长，至72 h这一现象更加 明显，并且细胞外膜有向外延伸的状态，而7 d后细胞形状基 本恢复到原先状态（图1)。

2.2 HeLa 细胞中D N M T1的m R N A表达量:lipofectamine2000 处理H e L a细胞48 h后，D N M T1m R N A降低；处理后7 d，D:M T1 m R:A明显升高（图2)。

2. 3 Lipofectamine2000 处理影响H eLa 细胞中D N M T1蛋白 的:Lipofectamine2000 HeL a胞48 h D:M T1蛋白水平的表达显著降低，72 h后有回升的趋势（图3)。

2.4 Lip〇2000处理影响395氮B-1细胞中D N M T1的表达:用 Lip〇2000处理395氮B-1细胞后5 d，细胞中D N M T1蛋白有持 续升高的趋势（图4)。

收稿日期：2017氮0氮6 修回日期:2017氮2氮6
基金项目：国家自然科学基金（81460457)
!通信作者（corresponding author): shutingjia@..
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H e L a HeLa+Kpo2000( 72 hours) HeLa+Kpo2000 (7 days)
图1 H e L a 细胞形态图
Fig 1 The morphology of H e L a cells
com5are3 with ccrntro/
图2 H e L a 细胞中D N M T 1的m R N A 表达水平 Fig 2 m R N A expression level of D N M T 1 in H e L a
cell (x ±s tn = 3}
图4 395-9B-1细胞中D N M T 1蛋白表达变化 Fig 4 The protein expression of D N M T 1 in
395-9B-1 cells
A. Western blot results ；
B. quantitative chart of Western blot ； *P<0. 05 compared with
48 hours
图;3 H e L a 细胞中D N M T 1蛋白表达变化
Fig ? Protein expression of D N M T 1 in H e L a cell(!±"%n = 3}
3讨论
H e L a 细胞是实验中最常用的一种人源模式细胞，广泛
的应用于各种研究。

LipofeCtamine2000对细胞是有一定毒
性的，而其具体的原因目前还不是很清楚。

本研究发现这一 毒性在H e l a 细胞中可能是通过对D N M T 1蛋白水平的短期
抑制改变细胞的表观遗传修饰来实现。

小鼠胚胎成纤维细
赵丹LiP〇fe,am ine2000降低H eLa细胞系中DNMT1的表达537
胞的实验结果表明，Lip〇f ectamine2000对细胞D N N T1表达的提供一个新的视角。

影响可能具有普遍性，为Lipofectamine2000的细胞毒性研究
参考文献：
[1] Lorincz M C，Dickerson D R，Schmitt M，et al. Intragenic
DNAmethylation alters chromatin structure and elongation efficiency in mammalian cells [J ]. Nat Struct Mol Biol，2004, 11: 1068-1075.
[2] Goll M G，Bestor TH. Eukaryotic cytosine methyltrans-
ferases[ J]. Annu Rev Biochem，2005，74：481-514.[3] R h e e I，B a c h m a n K E，P a r k B H，e Z a l.D N M T1a n d D N-
M T3b cooperate t o silence genes in human cancer cells[J].
Nature，2002, 416： 552-556.
[4] Zhi D，Zhang S，Cui S，e t al. The headgroup evolution of
cationic lipids for gene delivery [J ]. Bioconjugate C h e m，2013, 24： 487-519.
新闻点击
出汗过多影响心理健康
据美国W e b M D医学新闻网（2016-12-14)报道，一项新研究指出，多汗症（出汗过多症状）伴发有焦虑症与忧郁症的比例 似乎也比一般人高一些。

研究发现，多汗症筛检阳性的人罹患焦虑症与忧郁症的概率分别为21%和27%，而其他患者检出率分别为7.5%和10% 以下。

这个研究结果并未证明多汗症会导致哪些心理健康问题，因此，这个结果并不代表将多汗症控制得较好会舒缓人们忧郁 症或焦虑症的情况。

但皮肤科医生应该了解，这些患者有焦虑症或忧郁症的概率较高。

然而，有多汗症的人通常会有自我意识避免社交活动，甚至像在课堂上举手这些平凡的事情。

研究人员建议，多汗症患者应该与医生讨论心理健康的问题。

该研究结果刊登在2016年12月《美国皮肤科学会杂志》。

低糖饮食对代谢有益
据美国W e b M D医学新闻网（2016-12-09)报道，有篇小型研究指出，吃低糖餐会对女性的代谢健康有益，若吃高糖餐则不 会有这种改变。

研究人员发现，运动时间对代谢的益处起了很大的作用。

这篇研究显示，当人们24 h内的三餐只含有30%的碳水化合物时，他们的餐后胰岛素抵抗以及胰岛素含量会降低30%。

当人们在24 h内的三餐含有60%碳水化合物，胰岛素抵抗或胰岛素含量就没有降低这么多。

正常来说，运动被认为有助于降低胰岛素抵抗，降低血糖值;但这篇研究结果显示，在吃东西以前运动确实增加女性夜晚 间血糖值。

B o e r解释，运动时需要能量，诱发激素作用，让肝糖元释放出来。

身体大部分出现组织胰岛素抵抗，允许大脑以及肌肉使 用多余的糖类。

如果组织没有使用完所有的糖类，血糖就会维持在很高的状态。

然而，吃饭后运动消耗的热量就是餐点所提供的能量，而不是由肝脏提供；建议在吃完饭后40 m i n内运动。

Boer■指出，这篇研究的对象只是健康的女性，而且研究是短期的，不能评价低糖饮食以及运动是如何影响某些糖尿病前 期或2型糖尿病患者。