生物活性肽制备的研究进展

３展望
生物活性肽是一类多功能因子，它 们涉及了一系列身体代谢和生理调节功 能。日本以活性肽为功能因子已开发了 低抗原食品、婴儿食品、运动食品、促钙 吸收食品、降压食品、醒酒食品等一系列 的产品［３“，取得了良好的社会效益和经
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态氮的转化率很低（＜６％）；而复合蛋白 酶则可大大提高花生粕蛋白氨基氮的生 成率。先用中性蛋白酶水解３ ｈ，再加入 复合蛋白酶（外切肽酶和内切肽酶的复 合体）水解３２ ｈ，氨基态氮的生成率达 ４３％，且克服了花生酶解液呈现苦味的 缺点，此酶解工艺得到的水解液呈鲜味、 酸味而略带涩味【１８ Ｊ。 ２．６乳链菌肽
（１）使用蛋白酶Ｉ水解蛋白质原料 形成可溶性肽，要求水解发生在特定的 位置使得切下的肽段的Ｎ一末端或Ｇ末 端为芳香族氨基酸。
（２）利用蛋白酶Ⅱ切断芳香族氨基酸 旁的肽键，并将其从肽链中释放出来。如
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王梅等在ｐ｝ⅡＯ、温度４５℃条件下采用碱 性蛋白酶（２６ ｕ／一）保温３ ｈ，再在ｐＨ６．８、 温度３８。下采用木瓜蛋白酶保温３ ｈ，即完 成玉米蛋白粉的两步酶解ｎ引。通常认为， 水解玉米醇溶蛋白以碱性蛋白酶为好，水 解葵花蛋白以中性蛋白酶较合适，水解动 物蛋白原料以胃蛋白酶较理想。释放 Ａ蚺的蛋白酶应首选肌动蛋白酶，其次是 木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶。
为了提高ＣＰＰＳ的纯度和消除苦味 肽，研究者对进一步纯化ＣＰＰｓ的方法 也进行了广泛的探索。如河野敏明等发 明的钙一乙醇沉淀法【２ ５｜，使ＣＰＰｓ的终 浓度分别为１％（ｗ／ｖ）和５０％（ｖ／ｖ）；冯 凤琴等采用大孔强碱性阴离子交换树脂 Ｄ２９０及ｓｅｐｈａｄｅｘＧ一２５凝胶过滤色谱分 离纯化，可将ＣＰＰｓ按分子量大小进行 分组［引。文献１２ｊ报道将酶解后的混合 物通过一个３ ０００～５ ０００分子量的超滤 膜，不仅能去除酶类，还能去除所有的分 子量大于５ ０００的肽。文献【２ Ｊ还报道采 用活性碳、苯甲醛、玻璃纤维等疏水性吸 附剂处理酶解混合物后，因为疏水性肽 的分离，酶解混合物的苦味可明显改善； 在水解过程中，加入多聚磷酸盐、古柯豆 酸、果胶、麦芽、糊精等物质，苦味也有所 减弱【２ ６｜。 ２．２大豆多肽
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ＤＨ达２％以上１４１；徐俊等以Ｓｅｐｈａｍ８ｅ一 ４Ｂ及其衍生物为载体，用重氮、三聚氯 氰、戊二醛共价固定胰蛋白酶，蛋白质回 收率分别为５９％、９３％、２８％，酶活力回 收率分别为５３％、７８％、２０％【２２１；陈庆 森等报道了以壳聚糖为载体固定碱性蛋 白酶制备ＣＰＰＳ的方法：在１ ｇ干基壳聚 糖中加入３“２７０９碱性蛋白酶原酶液 与磷酸缓冲液共５０ ｍｌ、戊二醛０．４％处 理１２ ｈ／４℃，酶活力回收率达到 ６６．４％；在ｐＨ ８．０、温度４５℃条件下用 固定化碱性蛋白酶处理４％酪蛋白溶液 ４０ ｍｉｎ，ＣＰＰｓ产率可达８％№Ｊ。吴思方 等进行了固定化胰蛋白酶生产ＣＰＰｓ的 研究，ＣＰＰｓ得率为２１．３％，产品中ＣＰＰｓ 含量为１５％；广州轻工研究所生产的 ＣＰＰｓ有效肽含量达８５％以上，加工性 能稳定，已在市场推出。
从寡肽混合物中去除ＡＡＡ的方法 较多，有膜分离法、凝胶过滤法、活性碳 吸附色谱法、离子交换法、电泳技术等。 但从工业应用方面考虑，活性碳色谱法 易于推广使用，活性碳对苯丙氨酸、酪氨 酸有选择吸附特性。王梅等人的报道认 为，活性碳吸附法分离寡肽和氨基酸混 合物的最佳分离条件为：碳液比１：１０、 温度４５℃、ｐＨ为２．５或２．８；较佳洗脱 条件是采用１：１混合的１Ｎ氨水和无水 乙醇混合溶液进行动态洗脱。
乳链菌肽（ＮｉＳｉｎ）是由乳酸乳球菌 种乳酸亚种产生的一种小分子抗菌肽， Ｎｉｓｉｎ是由３４个氨基酸组成的多肽，其 分子量为３５１０，食用后在消化道中很快 被廿胰凝乳蛋白酶降解，不会引起常用 抗生素出现的抗药性问题，也不改变人 体肠道内的正常菌群。毒理学和生物学 研究结果证实，乳链菌肽对人体是安全 无毒的ⅢＪ。
在国外，Ｎｉｓｉｎ早就进入了工业化大 生产的阶段，其应用也很普遍。但国内 尚未见工业化生产的报道，因此对Ｎｉｓｉｎ 生产工艺的探讨是很有必要的。
乳酸链球菌广泛存在于天然牛奶及 乳酪和酸奶中，Ｎｉｓｉｎ高产菌株的筛选方 法不同于一般缺陷型菌株的筛选，其高 产菌种的筛选基本上采用随机挑选的方 法，效率很低。近年来，随着人们对乳链 菌肽菌株基因研究的深入，已经证明 Ｎｉｓｉｎ的产生是和菌株对ＮｉＳｉｎ的免疫性 相关联的。杨博等对乳酸乳球菌７９ｕｖ－ Ｓ２２经多种诱变处理后，根据Ｎｉｓｉｎ产生 菌的基因分析进行了筛选，成功地获得 了一株Ｎｉ《ｎ高产菌株，该菌株在遗传 上是稳定的，使用Ｍ１７培养基发酵液效 价可达１５２７ＩＵ／“Ｌ１９Ｊ。
工业化制备大豆多肽的基本过程【１０ Ｊ。 大豆多肽生产过程的关键问题是酶
的选择及苦味的控制，目前应用于研究 和生产中的酶有碱性蛋白酶、中性蛋白 酶、木瓜蛋白酶和复合酶等。黄惠华等
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ＦＯＯＤ＆ＭＡＣＨＩＮ十
十
大豆—一低温脱脂豆粕一一水提取一一酸沉淀—一洗脱一一碱中和—一
截留物
‘
在氨基酸或寡肽混合物中，支链氨
基酸（Ｂｒａｎｃｈｅｄ ｃｈａｉｎ锄ｉｎｏ ａｃｉｄｓ，简称 ＢｃＡＡ）与芳香族氨基酸（ＡｒｏＩｎａｔｉｃ锄ｉｎｏ
ａｃｉｄｓ，简称ＡＡＡ）的摩尔比称为ＦｉＳｃｈｅｒ 值，简称Ｆ值，高Ｆ值寡肽即具有高支 链、低芳香族氨基酸组成特征的寡肽。
经动物实验和临床使用证明，高Ｆ 值寡肽可以减轻或消除肝硬化、肝性脑 病的症状；改善病人的蛋白质营养状态， 恢复正氮平衡；还具有抗疲劳作用¨５｜。
十
酶水解一终止一超滤膜分离一净｝生碳处理一过滤一离子交换一真空浓缩一高压均质
一喷雾干燥一过筛一成品
图２大豆多肽生产工艺流程图
报道了木瓜蛋白酶酶解大豆分离蛋白的
最适ｐＨ为７．５，在ｐＨ ９．０的碱性条件 下也有较好的适应性，酶的最大反应温 度６０℃，１８０ ｍｉｎ／６０℃温浴仍保持７０％ 的酶活，２．０％～５．０％的大豆分离蛋白 溶液经木瓜蛋白酶水解后，大豆多肽量 最高可达９３．６ ｍｇ／１００ｍＩｌｌｌｌ；李雄辉等 在ｐＨ ７．０、温度４５℃条件下采用中性 蛋白酶、木瓜蛋白酶双酶处理８％大豆 蛋白溶液３ ｈ，大豆蛋白的水解度ＤＨ可 达６８％，大豆多肽生成率达６２．９％，其 分子量集中在２ ０００左右，平均肽键长 度５～８，游离氨基酸含量大于８％１１２ Ｊ。
持８９％的体外ＡＣＥ抑制活性。ｓ陬动
物试验表明，口服１００ ｍｇ／ｋｇ·Ｂｗ的剂 量即能起到显著的降压效果，在０～
１，０００ ｍｇ傀·Ｂｗ范围内，降压效果与
剂量呈指数下降趋势。 吴建平等报道的大豆降血压肽的酶
法生产条件为：温度５０℃，酶量为４％ （ｖ／ｗ，酶活为５３８９９ Ｕ／ｈ１），底物浓度为
７．５％，ｐＨ值为９；反应至终点时的水解 度为３１．２％，酸溶性肽量为２９．７０ ｍｇ／ ｍＩ，氮溶性指数为７２．３３％。水解液经 离心、超滤、离交后活性得率与肽得率平 均为１２３％与１５％左右。赵金兰等报道 的利用玉米渣生产降血压肽的方法是： 将玉米面筋粉调成固形物含量１０％的 悬浮物，用４ＮＮａ０Ｈ调节到ｐＨ８．０，９０ ℃加热２０ ｍｉｎ后酶解，酶解条件为：酶 底比１／５０，ｐＨ８．０，温度６５℃，水解时间 ５ ｈ。之后在１０５℃下加热５ ｍｉｎ使酶失 活，用分子截留量５ ０００的超滤膜除去 大片断肽，得到具有ＡＣＥ抑制作用的３ ～７个氮基酸残基的小肽。再加入 ０．５％以下的活性碳和少量的ｐ环糊精 将大部分的苦味掩蔽掉¨６。。 ２．４高Ｆ值寡肽
大豆蛋白质疏水性较强，水解过程 中产生疏水性多肽的机会也较多，产物 苦味明显。随着水解度的增加，疏水性 氨基酸暴露越多，苦昧也就越强；而当水 解度非常高时，苦味肽被继续水解成分 子量很小的短肽或游离氨基酸，这时苦 味又会减弱或消失［２７｜。文献［１２］报道采 用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶水解大豆蛋 白，配合活性碳的吸附处理，可以完全消 除由于疏水性肽带来的苦味，大豆多肽 口味清淡。 ２．３降血压肽
不同的乳酸链球菌株，其Ｎｉｓｉｎ的 效价有着显著变化，所适应的发酵条件 也有所不同，国内外这方面的研究较多。 综合考虑各因素，最适ｃ源主要为蔗糖 和可溶性淀粉；最适Ｎ源主要为酵母
膏，添加量１％左右；最适Ｐ源为 ＫＨ２Ｐ０４，添加量＜５％；Ｎｉｓｉｎ的高效价 也依赖于Ｓ源的存在，可添加无机盐类 如ＭｇＳ０４、硫代硫酸盐或含硫氨基酸 等。按上述原则设计的培养基配方对细 胞的生长有利，且可提高Ｎｉｓｉｎ的产生 率［２１｜。在近几年的文献报道中，Ｎｉｓｉｎ 菌株的最适发酵条件均为：最达温度３０ ℃左右，最适ｐＨ值５．０～５．５或６．５左 右。
花生低肽的制备过程中酶的种类的 选择及酶解工艺是关键问题。谭斌等对 中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰酶进行了筛 选试验，它们对花生粕蛋白质的水解能 力依次为中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞胰 酶，魅１．３９８中性蛋白酶水解花生粕蛋 白质的最适工艺条件为：水解温度４１ ℃，底物浓度１０％，酶底物浓度比１０ ０００ ｕ／ｇ，水解时间３００ ｍｉｎ。在此条件 下测得水解度为３３．５％，酸溶性花生肽 得率为８９．７６％，平均肽链长为２．７，平 均分子量为３３８【１７ Ｊ。林勉等对中性蛋 白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胰酶、复 合蛋白酶进行筛选试验发现：几种单酶 对花生粕蛋白的水解程度十分有限，氨
目前，高Ｆ值寡肽的制备还停留在 实验室规模，有关其工程化技术、工业化 制备方法还有待进一步研究。 ２．５花生肽
花生是我国六大油料作物之一，除 少量加工成小食品外，大多数以制油为 主要用途，每年大约有１００万吨以上的 花生饼粕。目前，花生饼粕一般是作为 饲料和肥料，没有进行工业化深加工，花 生蛋白资源远未得到充分利用。作为一 个动物蛋白资源相对缺乏的发展中国 家，怎样合理地开发利用花生粕蛋白质 也是大有文章可做的。其中，采用蛋白 酶水解花生粕蛋白质，制备更易被人体 吸收利用的花生低肽，已成为重要的研 究方向。
高血压是一种以动脉收缩压或舒张 压升高为特征的临床综合症，目前我国 高血压的发病率已超过１２％。以药物 治疗高血压具有维持时间短、副作用大 等缺点，天然蛋白水解肽具有显著的降 血压活性，长期使用无毒副作用。大豆 降血压肽主要是通过竞争性抑制人体中 的血管紧张素转化酶活性而达到降血压 作用的，体外模拟人体消化过程证实，大 豆降血压肽经肠胃蛋白酶作用后仍能保