猪胚胎干细胞建系研究进展
胚胎干细胞的研究进展和应用前景
胚胎干细胞的研究进展和应用前景胚胎干细胞是一种非常特殊的细胞，因为它们具有无限分裂的能力并能转变成各种不同类型的细胞。
胚胎干细胞通常从未经受精的卵子中提取，因此在当前的伦理和法律框架下，它们的使用受到限制。
虽然胚胎干细胞的研究发展还有很长的路要走，但是从研究方向和治疗应用方向来看，它们可能会在医学领域中发挥非常重要的作用。
研究进展近年来，许多研究人员一直致力于了解胚胎干细胞的真实功能。
研究表明，胚胎干细胞具有诱导分化的能力，这意味着这些细胞可以分化成各种类型的细胞，例如心肌细胞、神经元、肝细胞和胰岛素制造细胞等。
这些研究表明胚胎干细胞具有很大的潜力，可以用于治疗多种疾病，例如心血管疾病、神经系统疾病和糖尿病等。
应用前景胚胎干细胞的应用前景非常广泛。
一些应用研究正在进行当中，例如研究人员正在尝试使用胚胎干细胞治疗疾病，而另一些研究人员正在研究胚胎干细胞的分化过程，以便更好地理解这些细胞的功能。
目前，胚胎干细胞的应用领域非常广泛，最常见的就是用来治疗心血管疾病。
由于胚胎干细胞具有诱导分化的能力，这些细胞可以转化成心肌细胞，从而可以用于治療心臟病。
其他一些应用的领域包括神经系统疾病、肝脏疾病、糖尿病和癌症等。
神经系统疾病的治疗也是胚胎干细胞研究的另一重要方向。
如阿兹海默病，它是一种神经系统退化性疾病，目前还没有有效的治疗方法。
但是，研究人员正在尝试使用胚胎干细胞诱导成神经元，以便治疗这种疾病。
肝脏疾病的治疗也是一个具有挑战性的问题。
传统的肝脏疾病治疗方法通常是通过肝移植来实现。
但是这样做存在一系列的风险，并且这种方式对于某些患者来说并不可行。
胚胎干细胞可以被诱导成肝细胞，这为肝脏疾病的治疗提供了新的选择。
糖尿病治疗是胚胎干细胞研究的另一领域。
目前，人们正在尝试将这些细胞转化成胰岛素细胞，以便治疗这种疾病。
尽管与胰岛素治疗相比，使用胚胎干细胞治疗仍处于起步阶段，但这一研究将有望在未来成为一种新的热点领域。
胚胎干细胞的研究进展
究小 组用 流产 胎儿 性 腺成 功 地 分 离 和 培 养 并 建 ｒ
人胚 胎生 殖 细 胞 （ ｅ ｍ ｂ ｒ ｙ ｏ ｎ ｉ ｃ ｇ ｅ ｒ ｍ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ， Ｅ Ｇ细胞）
生命 科学 ｝ 的又 ・ 革 命性进 展 。
１ Ｅ Ｓ细胞 的基本 概 念及其 研 究历史
曾 香’ 综述 ， 金 玉 姬 审校 （ 吉林 医药 学院 ： １ ． ２ ０ １ ０级 预 防 医 学 本 科 班 ， ２ ． 基 础 医学 院， 吉 林 吉 林
１ ３ ２ ０ １ ３ ）
摘 要 ：胚胎 干细 胞是 来源 于胚胎 内细胞 团的具 有 多向分 化 潜 能 的一 类 干细 胞 ， 自从 ２ ０世 纪 ７ ０年 代 开 始研 究胚胎 干细胞 以来 ， 已经广 泛用 于生 命科 学的 许 多领域 。本 文综述 了近 些年 关于胚 胎 干细胞 建 系 、 分 化和 应用 的研 究进展 ， 同时也指 出 了目前 所面 临 的问题 。
关 键 词 ：胚胎 干 细胞 ； 临床应 用 ； 研 究进 展
中图分 类号 ：Ｒ ３ ２ ９
文献 标识 码 ：Ａ
胚胎 １ 细胞 （ Ｅ ｍｂ ｒ ｙ ｏ ｎ ｉ ｃ ｓ ｔ ｅ ｍ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ， Ｅ Ｓ Ｃ） 是 一 种
畸胎瘤 的研 究 ： 有人 把早 期 的小 鼠胚 胎移 植 到成年 小 鼠体 内后 产 生 了 畸 胎 癌 （ 即恶 性 的 畸 胎 瘤 ） ， 畸 胎 癌
系 。 国内在 细胞胚 胎 ： １ 方 面 的综 合 性研 究虽 然 起 步较 晚 （ １ ９ ８ ９年 ） ， 但 发展 非 常 迅 速 。在 基 础 研 究 方
而， 尚克 刚 、 赖 学 良等 已先后 建立 了小 鼠和兔 细胞 系 ，
胚胎干细胞的分化诱导研究进展
胚胎干细胞的分化诱导研究进展胚胎干细胞因其强大的分化能力和潜在的医学更应用价值而备受关注。
然而，其分化诱导的机制和过程仍然是研究的热点之一。
胚胎干细胞分化诱导的机制主要涉及两个方面：内部信号通路和外部因素。
内部信号通路中包括转录因子、染色质重塑和RNA编辑等，而外部因素主要包括生长因子、小分子化合物和细胞因子等。
近年来，很多研究者利用这些机制探索了各种分化诱导方法。
在转录因子方面，人类胚胎干细胞最初通过诱导多能性转录因子（Oct4、Sox2和Nanog）的表达实现向各种细胞类型的分化。
随着对转录因子结构和功能的深入研究，越来越多的转录因子被发现可以在胚胎干细胞分化中发挥作用。
例如，在神经元分化过程中，转录因子Atoh1和Ascl1被发现是神经元特异性的转录因子，通过诱导这两个因子的表达，可以有效促进胚胎干细胞向神经元的分化。
染色质重塑则是胚胎干细胞分化中另一个重要的内部机制。
染色质重塑是指通过去甲基化、重构和修饰等方式改变细胞染色质的结构和状态，从而影响基因表达和细胞命运。
近年来，研究者发现染色质重塑在胚胎干细胞分化诱导过程中也发挥了重要作用。
例如，在胚胎干细胞向神经元分化的过程中，组蛋白去乙酰转移酶CBP被认为是促进神经元分化的重要因子，其活性可以被小分子化合物通过影响组蛋白修饰来调控。
除了内部信号通路外，外部因素在胚胎干细胞分化中也扮演着至关重要的角色。
生长因子，特别是转化生长因子β（TGF-β）和骨形态发生蛋白（BMP），是许多胚胎干细胞诱导方案中最常用的外源因素。
生长因子可以通过激活某些信号通路，如Smad信号通路、p38 MAPK信号通路和wnt信号通路等来促进细胞的分化。
小分子化合物也是胚胎干细胞分化中广泛使用的外源性因素之一。
它们可以通过不同的机制来调节细胞分化，如促进转录因子的表达、调节细胞周期和修饰细胞信号通路等方式来实现。
此外，细胞因子如神经营养因子和胰岛素样生长因子也被广泛使用来促进胚胎干细胞分化。
胚胎干细胞研究进展 综述
台湾当代问题探究(二)医疗展望与伦理道德─从胚胎干细胞的研究讲起刘昭成助理教授国立中山大学生物科学系所人类一出生，就必须在病老死中走一遭。
根据统计，自二十世纪以来随着卫生环境的改善、药物的大量发明与应用，使得许多本来是致命的疾病得以治愈，因而使世界各国人口的平均寿命（Life expectancy）普遍提高。
现今医疗对疾病的处理不外乎给予药物、外科手术以及器官移植，然而这些治疗终究有其限制，对于先天性、老化疾病或损伤所造成的中枢神经失能在当今科学仍束手无策。
近年来随着医学、分子生物学知识的突飞猛进与生物科技的发展，对于目前仍折磨着人类、使人痛苦难当的许多疾病，相信应可以被逐渐治疗而改善。
随着在2000年6月一项经由跨国性分析人类基因研究计画（Human Genome Project）的完成，人类的医疗科学进入了一个似乎充满希望的时代，藉由对研究各个基因对人类的影响，不久的未来科学家应该可以利用基因改造技术来治疗基因疾病或改进人类的各种才能。
在各种如火如荼进行的实验研究中，尤以干细胞的进展特别值得注意。
在１９９９年１２月，干细胞研究进展被”科学”杂志评选为该年度世界十大科学进展之首，科学界普遍认为对干细胞的研究与应用将为一些以往束手无策或繁复的疾病治疗打开另一道窗口。
要了解为什么干细胞的研究为何如此重要就必须先来了解什么是干细胞，目前研究使用的干细胞就所取得的来源方面大致可以分为成人的干细胞（adult stem cells）以及胚胎干细胞(embryonic stem cells)二种。
当受精卵开始分裂进入二个细胞、四个细胞时期，在这个时期若因不特定因素使得这些细胞分开，这些细胞各自都可以继续分化并长成一个完整的个体，这也就是常见同卵双胞胎的起因，也由于此时这些细胞具有完整发育为人的特性，故被称为全能型的干细胞（toptipotent stem cell）,但是若受精卵已经分裂进入囊胚期（blastocyst），此时囊胚外层的细胞将分化成胎盘，囊胚内层的细胞则在胚胎进一步发育时会形成人体的200种细胞的任何一种而使的整个胚胎能完整的成形，由于单一的内层细胞并无法如toptipotent 时期的细胞可以独立形成一个完整的个体（因为缺乏外层细胞所分化构成的滋养层），因而此内层的细胞被称为复能干细胞（pluripotent stem cell），现今所用于科学研究的胚胎干细胞大部分都是取自此囊胚时期的内层细胞，取下内层细胞后，这个胚胎当然就会死亡无法进一部分化为一个完整的个体。
胚胎干细胞体外诱导分化的研究进展
04
胚胎干细胞体外诱导分化的应用前景
疾病治疗与药物筛选
疾病治疗
胚胎干细胞具有多向分化潜能，可分化为特定类型的细胞，如神经细胞、心肌细 胞等，为疾病治疗提供了新的途径。例如，通过诱导胚胎干细胞分化为神经细胞 ，可以用于治疗帕金森病、阿尔茨海默病等神经系统疾病。
药物筛选
胚胎干细胞可在体外培养扩增，为药物筛选提供了大量的实验样本。通过比较胚 胎干细胞在药物处理前后的分化过程和表型变化，可以评估药物的疗效和副作用 ，为新药研发提供有力支持。
表观遗传修饰
表观遗传修饰可以影响胚 胎干细胞的分化，如DNA 甲基化、组蛋白乙酰化等 。
03
胚胎干细胞体外诱导分化方法
化学诱导分化方法
化学诱导分化是利用化学物质 调节胚胎干细胞的分化过程。
常用的化学物质包括细胞因子 、激素、小分子化合物等。
这些化学物质通过调节胚胎干 细胞的基因表达、信号转导等 途径，诱导细胞定向分化。
组织工程与器官移植
组织工程
胚胎干细胞具有发育成各种组织的潜力，为组织工程提供了理想的基础材料。例如，可以诱导胚胎干细胞分化 为软骨、肌肉、血管等组织，用于修复或替换受损的组织器官。
器官移植
胚胎干细胞可分化为多种器官细胞，为器官移植提供了新的来源。与传统的器官移植相比，胚胎干细胞诱导分 化的器官具有更好的组织匹配性和更少的不良反应，有望成为解决器官短缺和提高移植效果的重要途径。
研究方法
采用体外培养胚胎干细胞的方法，通过添加不同的诱导因子 或采用特殊的培养条件，观察细胞的分化过程和分化产物的 特性，同时结合分子生物学、细胞生物学等技术手段分析相 关机制。
02
胚胎干细胞特性与分化机制
胚胎干细胞特性
胚胎干细胞的制备及研究进展
胚胎干细胞的制备及研究进展摘要：胚胎干细胞(ES细胞)是从动物早期胚胎的内细胞团或原始生殖细胞分离出来的具有发育全能性的一种未分化的无限增殖细胞系。
ES细胞在动物克隆、转基因动物生产、细胞工程、组织工程、临床克隆治疗和发育生物学等方面的研究应用中起着重要的作用。
引言近年来，随着科学技术的不断发展，世界各国对胚胎干细胞的研究不断深入，取得了许多突破性的进展[1]。
科学证明小鼠ES细胞可以分化为心肌细胞、造血细胞、卵黄囊细胞、骨髓细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、内皮细胞、黑色素细胞、神经细胞、神经胶质细胞、淋巴细胞、胰岛细胞、滋养层细胞等。
人类ES细胞也可以分化为滋养层细胞、神经细胞、神经胶质细胞、造血细胞、心肌细胞等。
ES细胞不仅可以作为体外研究细胞分化和发育调控机制的模型，而且还可以作为一种载体，将通过同源重组产生的基因组的定点突变导入个体[2]。
这意味着ES细胞将在动物克隆、转基因动物生产、细胞工程、组织工程、临床克隆治疗和发育生物学等方面发挥重要作用，为人类攻克癌症等疑难杂症开辟新的道路。
1胚胎干细胞胚胎干细胞是由哺乳动物附植前早期胚胎的内细胞团细胞或附植后胚胎的原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)通过体外分离培养而建立的克隆细胞系。
它具有与早期胚胎细胞相似的形态，即胞体小、核大、胞浆少且具有正常的二倍体核型。
ES细胞最突出的特点是只生长不分化，且保持早期胚胎发育的全能性，在饲养层上或含有白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)的培养基中，可稳定传代，长期培养。
体外诱导分化可形成3个胚层的分化细胞。
另外，ES细胞还具有种系传递功能和具有培养细胞所有的特征[3]。
胚胎干细胞不但可用于研究哺乳动物胚胎早期发育和细胞谱系分化，还可对它的基因组进行操作，通过基因打靶、突变和转基因等技术，建立各种实验模型，研究发育、肿瘤、免疫以及人类遗传病等有关问题，大大推动和发展了哺乳动物生物学的研究。
胚胎干细胞的研究进展及其应用
文献标识码 ： Ａ
Ｌ ｎ Ｑ ｋ Ｚ ａｇＷｅ ｃａ ｇ Ｚ ｕｎ ｉ ｎ ｉ ｇ ｉ ｅ ｈ ｎ ｎ ｈｎ ｈ ａｇＹｆ Ｍｉ Ｘｉ ｅ
（ ｏｌ ｅｏ ｎｍａ Ｓ ｉ ｃ ， ｕｉ ｇｉ ｈ ｒ ｎ ｏｅ ｔ ｎｖ ｒ ｔ， ｕ ｈ ｕ３ ０ ０ ） Ｃ ｌ ｇ ｆ ｉ ｌ ｃ ｎ ｅ Ｆ ｊ ｎ Ａ ｒ ｕ ｕｅａ ｄＦ ｒｓ Ｕ ｉｅｓ ｙ Ｆ ｚ ｏ ５ ０ ２ ｅ Ａ ｅ ａ ｃ ｙ ｒ ｉ
类 早 期 胚胎 。这 样 就使 科 学 家利 用 人 类 Ｅ Ｓ细 胞 治 疗 各种 疾病 成 为可 能 。从 此对 胚 胎干 细胞 研究进 入 了一个 新 的 时代 。 最新 研 究发现 ， 体： 细 胞也 可 以 成 ＿ Ｆ
向特 定 的方 向转化 上 来 。 ２０ ０ １年美 国 马 萨 诸 塞 州 先 进 细 胞 技 术 公 司把 干 细胞 用 于 治疗性 克 隆 ，并通 过 克隆 技术 培育 出人
胚 ， 胚 ） 原 始 生 殖 细 胞 （ｒ ｏｄａ ｇ ｒ ｅｌ， 囊 或 Ｐｉ ｒｉｌ ｅｍ ｃ ｌ ｍ ｓ Ｐ Ｃ ） 体外 分化 抑 制 培 养筛 选 出 的一种 多潜 能 细 Ｇ ｓ经 胞 。 胎干 细胞 可 以在 体外 稳 定 的 自我 更 新 ， 以在 胚 可 长 时 间继 代 培 养 后仍 维 持 正 常 的 二 倍 体 染 色 体 结 构 ；具有 与早 期胚 胎细 胞相 似 的形 态特 征 和很 强 的 分化 能力 ， 在一 定 的条件 培 养下 ， 可 以无 限增 殖 并 它 分 化 成 为全 身 ２ ０多 种细 胞 类 型 ， 如 ： 类 Ｅ ０ 例 人 Ｓ细 胞 可 以 分 化 为 肌 细 胞 ［ 、 经 细 胞 ［ 内 皮 细 １ 神 、 胞 ［ 造血 干 细胞 ［ 、 、 骨髓 细 胞 等 ， 可 进 一步 并 形成 机 体所 有组 织 、 官参 与个 体 的发育 过 程 ， 器 可称
胚胎干细胞的研究进展和应用前景
胚胎干细胞研究现状及应用前景摘要：作为一类既有自我更新能力，并具有多向分化潜能的细胞，胚胎干细胞具有非常重要的理论研究意义和临床应用前景[1]。
胚胎干细胞已被广泛用于生命科学的许多领域, 它潜在的医学应用也成为世界范围内的研究热点。
本文主要概述了目前胚胎干细胞在基础研究及临床上应用的研究进展并展望了今后研究的方向。
关键词：胚胎干细胞生物特性克隆应用干细胞是一类具有自我更新和无限分化潜能的细胞，它包括胚胎干细胞和成体干细胞，特别是胚胎干细胞是当前国内外医学和生物学领域研究的重点。
胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells，ES Cells)是由早期胚胎内细胞团(Inner cell mass，ICM)(桑葚胚，囊胚)或原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)经体外分化抑制培养筛选出的一种多潜能细胞。
胚胎干细胞可以在体外稳定的自我更新，可以在长时间继代培养后仍维持正常的二倍体染色体结构；具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的分化能力，在一定的条件培养下，它可以无限增殖并分化成为全身200 多种细胞类型，例如：人类ES 细胞可以分化为肌细胞、神经细胞[2]、内皮细胞、造血干细胞、骨髓细胞等，并可进一步形成机体所有组织、器官参与个体的发育过程，可称为是打开人类胚胎发育大门的一把“万能钥匙”。
1.胚胎干细胞的生物学特性1.1 胚胎干细胞的形态生化特性胚胎干细胞都具有相似的形态特点，与早期胚胎细胞相似，细胞较小，核质比高，细胞核明显，有一个或多个核仁，染色质较分散，细胞质内除游离核糖体外，其他细胞器很少；体外培养细胞呈多层集落状生长，紧密堆积在一起，无明显细胞界限。
细胞的染色体均为稳定的二倍体核型。
胚胎干细胞表达早期胚胎细胞的表面抗原，转录因子Oct- 4 为目前广泛用于鉴定胚胎干细胞是否处于未分化状态的一个重要的标记分子。
研究发现，它最早表达于胚胎8细胞时期，一直到细胞发育至桑椹胚时期，在每个卵裂球中都可检测到大量的Oct- 4 的表达产物，这之后Oct- 4 的表达局限于内细胞团细胞。
胚胎干细胞研究进展及其应用
胚胎干细胞研究进展及其应用胚胎干细胞是一种可以分化为身体各个组织细胞的原始细胞，因此在医学仿生学研究中备受关注。
胚胎干细胞的研究从未停止过，其重要性在于建立了一个可以治疗许多疾病的出发点。
以下是有关胚胎干细胞研究的最新进展和应用的简要分析。
胚胎干细胞的发现胚胎干细胞的发现可以追溯到1998年，当时一群来自威斯康星大学的研究人员成功培养出了第一批人类胚胎干细胞。
他们从人类早期胚胎的内细胞团（一种可以分化为各种人体细胞的组织）中分离出了这些细胞，并在实验室的增殖基质上维持了它们的繁殖。
十多年来，胚胎干细胞一直是许多疾病治疗方案的关键组成部分。
胚胎干细胞的作用作为早期胚胎组成部分的胚胎干细胞，可以分化为身体内几乎所有类型的细胞。
这是令人兴奋的，因为研究人员可以将其作为治疗许多疾病的手段之一。
例如，这些细胞可以转化为治疗心脏病、糖尿病和多发性硬化等疾病所需的心肌、胰岛素细胞和髓鞘细胞。
应用胚胎干细胞治疗疾病有望在未来几年内成为一种常规治疗方法。
胚胎干细胞研究的道德问题胚胎干细胞研究引发了一些道德争议，因为这些细胞是从人的早期胚胎中提取的。
在使用胚胎干细胞进行研究或使用这些细胞进行治疗时，必须从早期胚胎中收集组织。
这种做法在一些宗教团体中引起了道德问题。
为了解决这个问题，一些科学家已开始研究可以分化为多种类型的干细胞，例如诱导多能干细胞(iPSCs)。
iPSCs和胚胎干细胞iPSCs和胚胎干细胞有什么区别？这是一个重要的问题，因为iPSCs已经成为胚胎干细胞的可能替代品。
iPSCs是个性化的多功能细胞，可通过添加特定的信号物使其分化成其他细胞类型。
相比之下，胚胎干细胞是从早期活动的胚胎中获得的，因此它们不是个性化的，虽然它们可能具有更大的分化潜力。
同时，iPSCs可以在实验室中生成，而不是通过在早期胚胎中提取细胞获得。
iPSCs的优点之一是，它们可以根据患者的基因组具体分化成特定类型的细胞。
目前状态和前景胚胎干细胞是一种极具前景的治疗工具，但研究目前仍在向前推进。
胚胎干细胞的研究进展
胞分裂． 所谓对称性 细胞分裂是指干细胞每经过一次细胞分 裂周期后 ， 产生与母细胞相 同的两个子代干细胞 ； 不对 称 而 性 细胞分 裂是指干细胞每经过一次细胞分裂周期后 的两个 子代 细胞 ， 中一个仍然维 持干细胞状态 ， 其 另一个则 形成 干
干细胞定 向分 化为神经元 、 肌细胞 、 心 血管 内皮 细胞 、 类胰 岛细胞等 彳 显然 ， 艮 人们一旦 掌握 了胚胎干细胞 定向分化 的
规律 ， 必然引起生物医学领域的一场重大革命．
２ 国外 胚 胎 干 细 胞 的 研 究 状 况
无 明显细胞界限． 细胞的染 色体均为稳定的二倍体核型．
干细胞是一种具有多分化潜能和 自我更新功 能的早期 未分化细胞 ． 在特定 条件下， 它可以分化成不 同的功能 细胞 ， 形成多种组织 和器官． 因此 ， 人们期望能 够用干细胞来 修复 那些不能再生 的坏损组织或器官 ，于是干细胞研究 成为 目
局限于内细胞 团细胞．由此可见 ， ｃ ４为细胞是否具有多 Ｏｔ 一 能性的一个标记分子． 另外 ， 还有一些其他的标记 分子 ， 如碱 性磷酸酶 、 ｅｅｉ、Ｒ 一 — ０ Ｔ Ａ １８ 、 Ｄ ０等． Ｇ ｎｓ Ｔ Ａ １ ６ 、Ｒ 一 — １Ｃ ３ ｓ
胚胎干细胞表达早期胚胎细胞 的表 而抗 原 ，转录 因子 Ｏ ｔ４为 日前广 泛用于鉴定胚 胎干细胞是 否处于未 分化状 ｃ一 态 的一个重要 的标记分 子． 研究发现 ， 它最 早表达 于胚胎 ８ 细胞时期 ， 一商到细胞发育至桑椹胚 时期 ， 每个 卵裂球 中 在 都可检测到大量 的 Ｏ ｔ４的表达产物 ， ｃ一 这之后 Ｏ ｔ４的表达 ｃ 一
动物胚胎工程技术的研究进展及展望
动物胚胎工程技术的研究进展及展望摘要：动物胚胎工程是用人工的方法对动物卵母细胞或胚胎进行改造的技术，在育种中可使优良的种质特性和遗传潜力得到充分的发挥，是家畜繁殖领域的一次技术革命。
本文综述了动物胚胎工程包含的技术及研究进展，并对胚胎工程技术发展前景进行了展望。
关键词：胚胎工程；技术；研究进展动物胚胎工程是用人工的方法对动物卵母细胞或胚胎进行改造的技术，包含胚胎移植、排卵控制、胚胎冷冻保存、体外受精与显微受精、胚胎分割与胚胎嵌合、胚胎性别控制、胚胎干细胞、动物克隆等技术[1]。
这些技术的出现不仅大大扩展胚胎移植的研究领域，而且促进畜牧业、医药卫生行业发展，具有重大理论意义。
1 胚胎移植技术哺乳动物的胚胎移植始于1890年，当时英国剑桥大学Heape首次获得兔受精卵移植的成功。
Heape的成功，第一次证实了受精卵在寄主体内发育的可能性，从而奠定胚胎移植的生理学基础和原则。
2 排卵控制排卵控制分为排卵时间控制和排卵数量的控制。
控制排卵时间的目的是得到特定发育阶段卵母细胞，如做微注射转基因使用的原核胚。
排卵数量的控制又称为超数排卵，是为了获得更多的卵子。
目前在控制排卵中常用的激素有FSH、LH、PMSG、HCG等[3]。
3 胚胎冷冻保存胚胎冷冻是对胚胎采取一定保护措施和降温程序，使之在-196℃条件下细胞内一切新陈代谢过程中的化学反应被抑制从而处于一种“停滞”状态，但又不失去升温后恢复代谢的能力，从而能够得到长期保存的一种生物技术[4]。
玻璃化冷冻技术作为一种新发展起来的生物技术，具有许多潜在的应用价值。
而应用此项技术进行卵母细胞冷冻保存，可将优良品种动物废弃卵巢中的大量卵母细胞保存起来，向建立“精子库”和“胚胎库”那样建立“卵子库”，为体外受精、核移植、转基因等各种胚胎生物技术的开展提供充足的材料，并解除了时间和空间上的限制；而且可以为珍稀动物、濒危动物的遗传资源的保存提供可能。
5 胚胎分割和嵌合5.1 胚胎分割胚胎分割是采用显微手术的方法，将早期胚胎一分为二，一分为四或更多次的分割，再（或经过体外培养后）移回受体妊娠产仔，是动物克隆的一种[8]。
胚胎干细胞的研究及其应用
动物繁殖技术学课程论文胚胎干细胞的研究及其应用姓名学号系名专业班级指导老师2017年1月1日胚胎干细胞的研究及其应用摘要：胚胎干细胞 (ES 细胞)是一类从早期胚胎内细胞团或原始生殖细胞分离和克隆出的、具有发育全能性和多能性的细胞。
ES 细胞在动物克隆、转基因动物生产、细胞工程、组织工程、临床克隆治疗和发育生物学、遗传学以及制作动物疾病模型等的研究应用中起着重要的作用。
本文介绍了胚胎干细胞的生物学特性, 国内外研究进展和研究动态, 阐明了建立 ES 细胞系的技术要点以及 ES 细胞的应用及发展前景。
关键词：:动物;胚胎干细胞;发育；研究进展目录1.ES 细胞的研究概况 (3)2.ES 细胞的形态学及其基本特征 (4)2.1 ES细胞的形态学特征 (4)2.2 ES 细胞的基本特征 (4)3. ES 细胞系的建立概况及建系的技术要点 (5)3.1 ES 细胞系的建立概况 (5)3.2 ES 细胞建系的技术要点 (5)4.ES细胞的应用与前景 (5)4.1 ES细胞与动物克隆 (5)4.2基因载体 (5)4.3加快组织工程发展 (6)4.4其他 (6)5.存在的问题 (7)6.参考文献 (8)胚胎干细胞 (Embryonic stem cells, Es细胞)是一种从早期胚胎内细胞团(Inner cellmass, ICM)或原始生殖细胞 (primor-dial germ cells, PGCs)经体外分化、抑制培养、分离和克隆得到的具有发育全能性的细胞。
目前, ES 细胞已经引起广大学者的注意和兴趣, 对 ES细胞的研究也取得了很大进展。
该细胞除细胞和细胞集落有一定形态和生长行为外 ,经细胞表面抗原检测、体内体外分化实验为阳性 ,核型正常并可产生嵌合动物个体。
目前 ,除小鼠 ES细胞分离克隆成功称ES细胞系以外 ,其它动物 ES细胞研究虽然获得很大进展 ,但只称作类 ES细胞系或 ES样细胞。
主要原因是未能证明 ,经嵌合体实验发生生殖腺嵌合的嵌合体。
胚胎干细胞治疗心脏疾病动物实验研究进展
Ｅ Ｃ作为心肌细胞替代疗法的一种细胞来源。 Ｓ
１ Ｅ Ｃ 的研 究概 况 Ｓ
培养 （Ｅ Ｃ多采用） ｈＳ ，以及 用特异性 因子增强心 肌细胞分化 。这些 Ｅ Ｂ含有各种各样的细胞 ，包括 自 发同步收缩的心肌。 ｈＳ Ｅ Ｃ能 自发分 化 成 心 肌 细 胞 ，加 人 某 些 因子 将产生更多成熟的细胞 。但没有一种生长因子能把
（ Ｃ ａｔ 、ａｔ ｉ、ＭＨ ＭＨ ｃ ｎ ｃ ｎｎ ｉ ｉ Ｃ一２ ｃ ｘ和肌 钙 蛋 白 ｃ ｎ Ｔ） 和心 脏 特 异 转 录 因 子¨ （ ｋ２ ５和 Ｇ Ｔ 一４） Ｎ ｘ． ＡＡ 等。
１８ ９５年 Ｄ ｅ ｃｍａ 首 先进 行 了 ｍ Ｓ ｏｔ ｈ ｎ等 ｓ Ｅ Ｃ体 外
分 化 为 心 肌 细 胞 的 研 究 。 随 后 １９ ９ １年 报 道 了 ｍＥ Ｃ在 体外表 达心 肌 细胞 肌 球蛋 白重链 。到 目前 Ｓ
，
施只能延缓疾病的进展 。细胞替代疗 法有 望成为治疗损伤心脏的一种非 常有前景 的新方 法。胚胎干细胞 有无 限增 殖能力 和
心肌分化潜能 ，可作为心肌细胞替代疗法 的一种细胞来源。动物实验显 示胚 胎干细胞源性 心肌细胞移植 可作为 生物起搏 器
起搏心脏 ，或提高心肌梗死后动物存 活率 ，改善心功能 。
病 相关基 因缺 陷 的一 种简 化模 型 。Ｅ Ｃ要 分化 必 须 Ｓ 去除维持 自我 更新或 增殖 的特 异生 长 因子 ，才 能 分
化 成 由多 种 细 胞 种 类 构 成 的 细 胞 团块— — 拟 胚 体 （ｍ ｒｏ ｏｙ Ｂ） Ｂ培 养 阶 段不 同修饰 培养 ｅ ｂ ｉ ｂｄ ，Ｅ 。Ｅ ｙ ｄ
和 中胚层 ） 的 畸胎 瘤 。在 体外 细胞 分 化 也 证 明 Ｅ ｓ 细 胞 的全 能性 。
胚胎干细胞的研究进展
胚胎干细胞的研究进展
胚胎干细胞是一种可以分化为多种细胞类型的特殊细胞，被认为在生
物医学研究和临床应用中具有巨大的潜力。
本文将介绍近年来胚胎干细胞
研究的进展，包括诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）的发现、疾病模型的建立以及临床应用的前景等。
iPSCs的发现带来了诸多应用前景。
由于iPSCs可以从病人本身取得，因此可以用来研究各种疾病，并为基因治疗提供新的途径。
研究人员通过
将病人的成年细胞转化为iPSCs，然后将其分化为患有特定疾病细胞类型，可以模拟疾病在体内的发生过程，以及研究新药的疗效。
例如，人们利用iPSCs成功建立了帕金森病、阿尔茨海默病和肌萎缩侧索硬化症等神经退
行性疾病的模型，为研究疾病的发病机制和寻找治疗方法提供了有力的工具。
除了疾病模型，胚胎干细胞还有望用于再生医学。
研究人员可以将胚
胎干细胞或iPSCs分化为各种细胞类型，如心肌细胞、肝细胞等，并移植
到患有相应疾病的患者体内。
这种修复和替代受损组织的方法，被认为有
望治疗各种疾病，如心脏病、肝病、糖尿病等。
目前，临床试验已经开始
使用胚胎干细胞治疗一些疾病，取得了一些初步的成功。
然而，胚胎干细胞的研究仍然面临许多挑战。
首先，胚胎干细胞的获
得过程涉及胚胎的形成和破坏，引发了伦理和道德上的争议。
其次，胚胎
干细胞在培养过程中存在困难，需要在特殊的条件下维持其干性。
此外，
将胚胎干细胞或iPSCs移植到患者体内需要解决排异反应和移植后的安全
性问题。
胚胎干细胞的研究进展
轰 动 ． ｃｅ ｃ 志 将 人 类 Ｅ Ｓ ｉ ｅ杂 ｎ Ｓ细 胞 研 究 成 果 评 为 １ ９ ９ ９年 世 界 十 大 科 技 进 展 之 首 ， 国《 代 周 刊 》 美分 化 能 力 的 干 细 胞 ， 具 有 早 期 囊 胚 Ｉ Ｍ 或 Ｐ ｓ 似 的 生 物 学 特 性 ， 体 ／ 直能 它 Ｃ ＧＣ 相 在 外 能 够保 持 正 常 的 二 倍 体 核 型 和未 分 化 状 态 ， 且 有 多 方 向 分化 潜 能 ． 并 在适 当条 件 下 ， Ｓ细 胞 可 被 诱 Ｅ 导分 化 为多 种 细胞 和 组 织 ， 可 以 与 受 体 胚 胎 嵌 合 ， 成 嵌 合 体 ． 也 形 因此 ， 就 决 定 了 Ｅ 这 Ｓ细胞 在 发 育 生 物学 、 传 学 、 物 工程 和 家 畜 育 种 等 学 科 中 有不 可 替 代 的应 用 价 值 ， 令 人 振 奋 的 是 ， ９ ８年 ， 国 遗 生 更 １９ 美
胚 胎 干 细 胞 的 研 究 进 展
李 长 有
（ 林 师 范 大 学 生 物 系 ， 林 四平 １６ ０ ） 吉 吉 ３ ０ ０
摘 要 ： 胎干 细胞 源 于着 床前 的 囊胚 内 细胞 团或 早 期 胎 儿 原 始 生 殖 细 胞 的 一类 未 分 化 的 多 能 性 干 细 胚
胞 ， 有 无 限增殖 和 多能 分化 的能 力 ． 文综 述 了胚 胎 干 细胞 的 研 究 现状 、 物 学特 性 、 待解 决 的 问题 ， 具 本 生 亟 以 及胚胎 干细 胞在 发育 生物 学 、 床 医学 、 药 的开发 、 物 的克 隆 、 产业等 方 面有着 广 阔的应 用前 景 ． 临 新 动 畜
猪胚胎干细胞的分离、培养、鉴定和分化的研究
猪胚胎干细胞的分离、培养、鉴定和分化的研究猪胚胎干细胞的分离、培养、鉴定和分化的研究引言：猪胚胎干细胞 (pig embryonic stem cells, pESCs) 是具有自我更新和多向分化潜能的一类细胞，它们可以分化为各种细胞类型，包括神经细胞、心肌细胞和肝细胞等。
猪胚胎干细胞对于研究疾病机制、药物筛选以及组织器官的修复和再生具有重要意义。
本文将深入探讨猪胚胎干细胞的分离、培养、鉴定和分化的研究，以期为相关领域的研究提供参考。
一、猪胚胎干细胞的分离和培养1.1 选择合适的胚胎阶段猪胚胎干细胞的分离最好选择在初中胚胎期 (early to mid-stage) 进行，此时胚胎内细胞的多能性较大。
通常使用体外受精的方法获得猪胚胎，进而通过体外培养技术将胚胎发育至所需的阶段。
1.2 分离和培养将胚胎置于去膜卵黄体外囊内培养基中，经过适当的处理后，即可分离出内细胞团 (inner cell mass, ICM)。
在I型胶原酶中加入0.1%胰酶，由于细胞外基质的断裂，使得内细胞团可以被完全获得。
所获得的内细胞团可用于培养和传代，从而分离出猪胚胎干细胞。
二、猪胚胎干细胞的鉴定为了确保得到真正的猪胚胎干细胞，需要通过特定的标记和鉴定方法进行确认。
2.1 形态学特征猪胚胎干细胞的具有原始胚胎细胞的形态特征：小而柔软的圆形细胞，细胞质丰富、核大而圆。
通过显微镜观察，可以初步判断细胞的特性。
2.2 基因表达使用荧光定量PCR等方法，检测特定的基因如Oct-4、Nanog和Sox2的表达水平，以确定细胞是否具有胚胎干细胞的特征。
2.3 免疫细胞化学法通过免疫染色技术，检测细胞表面或胞浆内的特定标记物，如Oct-4、CD9和SSEA-4。
根据标记物的阳性和阴性表达，可以确定细胞是否为猪胚胎干细胞。
三、猪胚胎干细胞的分化猪胚胎干细胞具有多向分化的潜能，可以分化为多种细胞类型，从而为组织器官修复和再生研究提供基础。
胚胎干细胞的研究进展
有 与早期胚胎 细胞 相似 的形态结构 ，细胞体积 小 ， 核 大， 胞质胞浆少 ， 细胞界限明显 。 体外 培养 时 ， 细胞排列
用丝裂霉素 ｃ处理使细胞停 止分裂 ，即形 成饲养层 。 培养 液一般是 Ｄ Ｍ＋ ５ ＭＥ １％的犊牛 血清 （ Ｃ ）培养液 Ｆ Ｓ， 中还可添加氨基酸 、 丙酮 酸盐 、 乙醇 、 谷氨酰胺 、一 巯基
羊等的类 Ｅ 细胞 系。１９ 年 ，ｈ ｍ ｏ ｓ ９ ８ Ｔ ｏ ｓｎ等问 率先成功分 离、 克隆了人胚胎 干细胞 ， 并建立 了细胞 系。 自此 ， ｓ Ｅ 细
Ｅ 细胞的成功分离与建系 ，开辟 了哺乳动物 Ｅ 细胞 Ｓ Ｓ 研究 的新纪元 。
１ 胚 胎 干细 胞 的研 究概 况
３１ Ｅ ． Ｓ细胞 分离培养及建 系 的材料
可采 用早期胚
胎或采用 Ｐ Ｃ 。胚胎发育 的阶段与 Ｅ 细胞分离 的效 Ｇｓ ｓ
Ｅ 细胞 的研究首先源于畸胎瘤 干细胞或胚胎癌细 ｓ 胞（ Ｃ细胞 ） ９ ８ ， ｅｅ【 小 鼠早期胚胎移植到 Ｅ 。１５ 年 ｓ ｖｎ ｔ 把 “２ １９品系” 小鼠精巢或肾脏 的被膜下 ， 得到 了 Ｅ Ｃ细胞 。 １７ ，ｒ ｓ — ＝ Ｃ细胞注射到小 鼠囊胚后 ， ９４年 Ｂｉ ｔ ｎ ｅ 巴Ｅ 参与受
３２ 培养 液中添加分化抑制 因子体 系 ．＿ ３
这种方法是
将 分化 抑 制 因子 直接 添 加到 囊 胚 或 Ｐ Ｃ Ｇ ｓ的培养 液
中 ，分离 Ｅ ｓ细胞 。所 用的分化 抑制 因子有 ＬＦ Ｄ Ａ Ｉ、Ｌ （ 分化抑制 因子 ）Ｈ Ｌ Ａ 人 白细胞 介素 ） 。在实际 、 ＩＤ （ 等
胚胎干细胞研究进展
胚胎干细胞研究进展胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell，ESC）是指从早期胚胎（通常为囊胚阶段）分离出来的无定向分化能力极强的细胞，在体外特定培养环境下可持续增殖，并且能够分化成为多种细胞类型的干细胞。
由于胚胎干细胞拥有高度的分化潜能和潜在的无限治疗潜力，因此胚胎干细胞研究一直备受全球各地科学家的关注和关心。
目前，胚胎干细胞研究已经得到了迅速的发展和进展。
在过去的几十年里，科学家们不断完善胚胎干细胞培养技术和不同的分化优化方法，以期能够使其在临床中发挥更大的治疗价值。
一、胚胎干细胞在内分泌紊乱疾病治疗中的应用内分泌紊乱是指内分泌腺分泌的激素异常导致机体功能紊乱和多种疾病的发生的一种疾病。
目前，胚胎干细胞在内分泌紊乱疾病治疗中展现出了极大的应用潜力。
例如，糖尿病是一种由胰岛素毁损导致的代谢疾病，已经有研究证明，胚胎干细胞来源的胰岛细胞移植能够有效地恢复病人胰岛素分泌功能。
二、胚胎干细胞在心脏病治疗中的应用胚胎干细胞作为干细胞的鼻祖，对于心脏病的治疗也有着重要价值。
在过去的几年里，科学家们使用胚胎干细胞成功地分化出了心肌细胞和心脏血管细胞，且这些细胞带有更好的分化、增殖和移植特性，这为治疗心脏病的药物研发和干细胞移植疗法的发展提供了巨大的希望。
三、胚胎干细胞在神经系统疾病治疗中的应用神经系统疾病，包括脑损伤、阿尔茨海默病和帕金森病等，是一类越来越常见的疾病，其影响范围和危害程度都很大。
然而，经过多年逐步发展的胚胎干细胞技术已经显示出在治疗神经系统疾病方面的潜力和优势。
目前，胚胎干细胞在分化出大脑皮质神经元和肌肉神经元时,对于重复发作性多发性硬化症、小儿脑少病及上肢肌萎缩性侧索硬化症等神经系统疾病的治疗都取得了良好的效果。
四、胚胎干细胞的研究现状胚胎干细胞的研究在过去几年间得到了长足的发展。
不仅是分化胚胎干细胞成为不同类型的细胞，更多的研究将焦点放在在胚胎干细胞的种种分化过程中。
例如研究人员在结合生物基因工程和干细胞技术，以植物白菜为基础，通过转化分化出来的胚胎干细胞能够分化成为多形态的植物细胞，这为生物学家向下展开了一条新的技术路线。
胚胎干细胞和诱导多能干细胞的研究进展
胚胎干细胞和诱导多能干细胞的研究进展干细胞是指具有自我复制和分化为多种细胞类型能力的未分化细胞，是成体组织维持和修复过程中必不可少的一种细胞类型。
干细胞分为多种类型，其中胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，ESC)和诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cell，iPSC)是目前研究最为广泛的两种干细胞类型。
在生物医学领域，干细胞被认为是一种有广阔应用前景的细胞类型，因为它们可以为组织修复、疾病治疗和基因检测提供新的可能。
胚胎干细胞研究胚胎干细胞，又称为“初生干细胞”，是一种来源于早期胚胎的多能干细胞。
胚胎干细胞具有自我复制和分化成任何一种细胞类型的能力，这为细胞治疗提供了不可估量的帮助。
胚胎干细胞可以用于治疗许多疾病，如糖尿病、巨细胞病毒感染和白血病等。
在ESCs的研究中，科学家通常使用非常早期的胚胎，通常在受精卵成形后4-5天内，获得干细胞。
但是在严格的法律和伦理规范下，胚胎干细胞研究一直面临一定程度的限制。
由于胚胎干细胞源自胚胎，因此其获得相对困难。
另外，由于胚胎构成和宗教、伦理道德等问题，在某些国家和地区，这种研究还面临法律禁止，甚至被认为是不道德的。
诱导多能干细胞研究为了解决这些伦理问题，科学家们提出了一种新的方法，即诱导多能干细胞研究(Induced pluripotent stem cell，iPSC)。
iPSC是指遗传工程中使用特定的基因表达和化学因子来“诱导”已分化细胞返回干细胞状态所获得的多能干细胞。
与胚胎干细胞不同，iPSCs 可从体细胞（如皮肤、血液、肝、胰腺和脑等）中获取，通过简单的细胞培养可以获得。
如此，伦理问题得到了大大的解决。
iPSCs不仅具有胚胎干细胞的特性，而且还可以通过患者特定的基因型和表型模拟疾病。
因此，iPSCs被认为是一个重要的模型系统，用于揭示先天疾病的发病机制、显性遗传疾病和性染色体遗传疾病的根源，以及药物研究和干细胞治疗。
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鼠血清的抗体和补体使人或鼠的囊胚滋养层细胞发 生免疫溶解，再用吸管轻轻吹吸，可较完整地去除滋 养层细胞，从而得到较纯的ＩＣＭ。Ｂｒｅｖｉｎｉ
Ｔ Ａ Ｌ
等卟３用自制的抗猪血清按１００ ｍＬ／Ｌ与低糖 ＤＭＥＭ混合后放入去透明带的６ ｄ～７ ｄ猪胚胎， ３７℃孵育１０ ｍｉｎ，然后转入含豚鼠血清的培养液中 孵育３０ ｍｉｎ，即可脱去滋养层细胞。Ｋｉｍ
只加１５０ ｍＬ／Ｌ ＦＢＳ。有报道用１００ ｍＬ／ＬＦＢＳ和
１００
ｍＬ／Ｌ猪血清联合适用效果更佳。对于血清用
于ＥＳＣｓ建系仍有争论。血清中成分复杂，其中许 多未知蛋白分子或病原体是ＥＳＣｓ建系的潜在污染 源之一。因此，现在很多有条件的实验室用无血清
培养基（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ，ＳＦＭ）或是ＫＯ（ｋｎｏｃｋ—
１．１．２胚径
猪胚胎的胚径影响ＥＳＣｓ分离培养
效果。胚径越大分离培养ＥＳＣｓ效果越好，胚径＞
１００
ｐ．ｍ分离ＩＣＭ后ＥＳＣｓ克隆率１００％。
收稿日期：２０１０—０５－１４ 基金项目：国家自然科学基金项目（３０６００４３２）
作者简介：王磊（１９８２一），男，安徽铜陵人，硕士，主要从事动物遗传学研究。＊通讯作者
免疫外科法囊胚去透明带后用兔血清、豚
殖、分化调节，对ＬＩＦ也有协同作用。但对于猪维持 ＥＳＣｓ全能性的确切细胞因子及其作用机理还尚未 探明。 １．３．２胰岛素胰岛素可提高ＥＳＣｓ分离效率、促 进细胞分裂、增加胚胎细胞数，对滋养层和ＩＣＭ的 增殖也有促进作用。应其龙等［９３认为胰岛素能增强 干细胞长期生长能力，但不参与ＥＳＣｓ自我更新和 种系传递命运的决定。
Ｈ
阶段特异性胚胎抗原检测 阶段特异性胚胎抗原ＳＳＥＡ一１是一种胚胎聚
Ｓ等嗍分别用ＳＴＯ、小鼠胚胎成纤维细胞
糖，而ＳＳＥＡ一３、ＳＳＥＡ一４是球形系列糖脂抗原。ＥＳ 细胞及早期胚胎细胞表面有丰富的特定抗原，用相 应抗体就可检测ＥＳ细胞的存在；一旦ＥＳ细胞分 化，他们的表达量显著下降。’目前利用ＳＳＥＡ系列 鉴定ＥＳ细胞已是常规的手段之一。以ＳＳＥＡ－１为 例，用间接免疫荧光染色法：以抗ＳＳＥＡ－１单克隆抗 体为一抗，荧光标记羊抗鼠ＩｇＧ为二抗，分步染色， 荧光显微镜下观察分析。 ２．３碱性磷酸酶活性检测 用快蓝Ｂ盐、萘酚、ＡＳ－ＴＲ等对猪类ＥＳＣｓ染 色。ＥＳＣｓ阳性的呈红棕色，而饲养层、分化细胞则 不着色。但经研究发现猪上皮细胞用碱性磷酸酶
动物医学进展，２０１０ａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
猪胚胎干细胞建系研究进展
王 磊，陶
勇，章孝荣。，宋锐
（安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥２３００３６）
摘要：胚胎干细胞（ＥＳＣｓ）是遗传工程、发育生物学和疾病模型研究与应用的重要材料。猪ＥＳＣｓ建 系研究虽已历经十多年，且已有建立猪类ＥＳ细胞系的报道，但由于其培养和鉴定方法基本都是借鉴小鼠和 人的ＥＳＣｓ建系，从而使其培养体系存在着极大的不可靠性，至今未有种系嵌合的猪ＥＳＣｓ建系成功的报道。 论文对猪ＥＳＣｓ建系的影响因素和存在的问题、传统的培养和鉴定方法在猪ＥＳＣｓ建系中的应用、ＥＳＣｓ多能 性分子以及ＥＳＣｓ研究中出现的新理论进行了综述。
２．４中间纤维表达检测
后迅速令细胞贴附于硬的基质上培养，这样传代猪 ＥＳ细胞效果较好。目前如何稳定传代并保证猪 ＥＳＣｓ不分化是猪ＥＳＣｓ建系的瓶颈之一。 研究发现，将ＩＣＭ集落消化成单个细胞就破坏 了细胞间信号传导，可促使干细胞分化。因此猪 ＩＣＭ初次传代不可消化成单个细胞，以免传代后难 以形成集落；以后传代可消化成单细胞，以便分离 ＥＳＣｓ克隆。用机械切割法分离猪ＩＣＭ和传代ＥＳ 细胞（用微型环加吸管吹吸），应确保不消化成单细 胞悬液，保持消化成的每个细胞群平均５００个～６００ 个细胞口Ｊ。
ｂｏｖｉｎｅ
１．２．４酶消化法
李明等［８３将脱去透明带的猪囊
１．３．４ １００ １００
胚置于２．５ ｇ／Ｌ胰蛋白酶（Ｔｒｙｐｓｉｎ，Ｔｒｙ）～０．４ ｇ／Ｌ 乙二铵四乙酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅ
ｄｉａｍｉｎｅ ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ，
ｍＬ／Ｌ胎牛血清（ｆｅｔａｌ ｍＬ／Ｌ新生牛血清（ｎｅｗ
ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）和
Ｈ
特制吸管将ＩＣＭ剥离出来进一步培养。该方法的 优点是可保证ＩＣＭ的完整性，几乎不损伤细胞，分 离出来的细胞团状态良好；缺点是胚胎贴壁率受饲 养层状态、胚胎发育状态、胚径大小等因素影响较 大，往往贴壁率不高；而且通常猪囊胚腔很大，这直 接导致在培养液中胚胎浮力大，使胚胎悬浮或与饲 养层接触不紧密，贴壁细胞少；在观察或移动培养皿 时有轻微晃动就可使已贴壁的猪胚胎脱落，因此用 该方法接种猪囊胚后２ ｄ～３ ｄ内不宜挪动培养皿。 １．２．２机械切割法 该方法是在全胚培养法基础 上加以改进。用链酶蛋白酶脱去囊胚透明带后，用 细玻璃针或１ ｍＬ注射器针头将胚胎切成两半。其 中一半仅有滋养层细胞，另一半含ＩＣＭ和少量滋养 层细胞。将后者取出培养，待滋养层扩散后可用吸 管分离到ＩＣＭ。
１猪胚胎干细胞分离培养的影响因素
１．１取材
ＥＳＣｓ来源于胚胎外胚层，胚胎不同发育时期外 胚层细胞分化状态不一致。胚龄小则ＥＳＣｓ分化程 度低而具有全能性；胚龄大则ＥＳＣｓ部分或全部失 去全能性。对于自然胚来说，猪胚胎外胚层形成时 期在囊胚孵出前，完成于配种后１２ ｄ左右，这表明 在囊胚孵出前（配种后６ ｄ～７ ｄ）也许无明显外胚层 出现，而事实上猪胚泡附植在配种后１７ ｄ左右，因 此发育后期阶段囊胚较容易收集并用于ＥＳＣｓ分离 培养［３］。猪７ ｄ～９ ｄ的胚胎ＥＳＣｓ原代克隆率最 高。Ａｎｄｅｒｓｏｎ和Ｓｔｒｏｊｅｋ认为猪第１０天胚胎分离 培养ＥＳＣｓ效果最佳。以上差异可能与研究所用猪 种和培养体系不同有关。对于体外生产（锄ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ＩＶＰ）胚胎即非自然胚来说，目前猪胚胎 体外培养体系还不完善，不足以维持胚胎充分发 育［１］。ＩＶＰ的胚胎发育能力较差，导致ＩＣＭ质量不 高，这在很大程度上影响从ＩＶＰ胚胎分离培养猪 ＥＳＣｓ。曾有报道用体外培养的猪４一细胞期胚胎、孤 雌胚和体外培养７ ｄ～８ ｄ胚胎分离得到猪类ＥＳ细 胞并成功传代［６］。
１．２．３
Ｓ等［７３用不同
ｖｉｔｒｏ
基础培养液培养从猪体外受精（ｉｎ
ｆｅｒｔｉｌｉｚａ—
ｔｉｏｎ，ＩＶＦ）胚胎中分离的ＥＳ细胞，结果Ｄ／Ｎ、Ｄ／ Ｆ１０、ＤＭＥＭ的原代克隆率分别为４４．４％、２１．７％ 和０％。
１．３．１
细胞因子
通常认为白血病抑制因子（１ｅｕ—
ｃｅｌｌ
ｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ
ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，ＮＢＳ）或
ＥＤＴＡ）的细胞消化液中室温消化约５ ｍｉｎ后，于解 剖镜下观察，发现滋养层细胞开始脱落时即将囊胚 移入ＥＳＣｓ培养液中，在解剖镜下借助吸管和拨针 分离出ＩＣＭ。研究发现该方法对ＩＣＭ造成的损伤 小，所有ＩＣＭ都能贴附于饲养层上，原代类ＥＳ细胞 形成率为６８％，且得到传６代～９代的类ＥＳ细胞集 落。在自然胚中，用酶消化法分离ＩＣＭ比其他方法 效率高；但在体外生产胚胎中，全胚培养法更好，酶
Ｈ
Ｓ等［７］
用山羊抗猪全抗血清和豚鼠补体以３：１比例配成 免疫操作液，当猪囊胚变黑、有不规则表面、囊胚收 缩变小时可用吸管轻轻吹吸，使死去的滋养层细胞 脱落而得到ＩＣＭ。该方法优点是分离ＩＣＭ效率很 高，可得到较纯、无损伤的ＩＣＭ；缺点是血清内成分 复杂，ＩＣＭ会接触到动物源性蛋白，有一定程度的
化学损伤。
１３－巯基乙醇
ｐ一琉基乙醇（Ｂ—ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａ—
ｎｏｄ是一种强还原剂，能使培养液中的含硫化合物 还原成谷胱甘肽，防止氧化物对培养细胞的损害；同 时能促进有丝分裂原的反应和ＤＮＡ的合成，从而 促进细胞贴壁增殖。研究表明在其他培养条件相同 的情况下，添加口一巯基乙醇可提高胚胎和ＥＳＣｓ贴 壁率及克隆形成率，间接增加传代次数。 血清 在猪ＥＳＣｓ培养中，一般要添加
ｏｕｔ）ＤＭＥＭ中添加血清替代物（ｓｅｒｕｍ
ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，ＳＳＳ）。
ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ
万方数据
８８
动物医学进展２０１０年第３１卷第１１期（总第２０９期）
１．３．５饲养层
由于饲养层细胞可分泌ｂＦＧＦ和
个细胞。传代４次后猪ＥＳ集落光泽变暗，立体感 强，呈长圆或长条状且细胞致密。
２．２
ＬＩＦ，所以饲养层在ＥＳＣｓ分离培养过程中主要有两 方面作用：促进细胞增殖和抑制细胞分化。饲养层 细胞的类型和状态影响ＥＳＣｓ分离培养效果。Ｋｉｍ
关键词：胚胎干细胞；细胞系；鉴定方法；多能性分子；猪
中图分类号：￥８５２．１６１
文献标识码：Ａ
文章编号：１００７・５０３８（２０１０）１１－００８６—０６
胚胎干细胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＥｓＣ）是从囊胚
内细胞团（ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ，ＩＣＭ）中获得的，具有自我
猪ＥＳＣｓ多潜能性维持是否有效还需进一步论证。这 些都是一直困扰着猪ＥＳＣｓ建系研究的未解之谜。
更新、分化可塑性和种系嵌合能力的一类全能细 胞［１］。它是医学和生物工程研究的重要工具，将其用 于器官移植、细胞治疗、提高转基因效率等是目前干 细胞研究的热点［２。３］。猪是人类疾病的良好动物模 型，也是异种器官移植的理想材料［４］，猪Ｅ．ＳＣｓ研究将 加速转基因猪在人类异种器官移植上的应用。利用 猪ｎＳＣｓ易于进行遗传操作和重构胚发育率高的优 点，以ＥＳＣｓ作为载体提高转基因猪的制备效率将是 转基因技术的重要突破。 目前猪ＥＳＣｓ的研究仍集中在分离和传代方法的 优化上，现在还没有可靠的方法分离猪Ｆ．ＳＣｓ并很好 地维持其干细胞特性。虽然在猪上有许多关于类ＥＳ 细胞系的报道，但都未获得有种系嵌合能力的细胞 系；也一直没有猪特异的、可靠的方法来证明完全是 ＥＳ细胞系，更没有像小鼠、人的ＥＳＣｓ那样成功用于 医学研究或基因工程研究。猪ＥＳＣｓ分离纯化难、传 代次数低、易分化是导致建系成功率低的主要方原 因。猪的Ｆ．ＳＣｓ与小鼠、人的有很大的不同：在人和鼠 上表达的干细胞分子标记在猪上不一定表达，猪可能 存在种属特异的干细胞分子标记；猪ＥＳＣｓ对胰蛋白 酶、磷酸缓冲液等试剂的刺激很敏感，暴露其中数秒 就会裂解‘¨，因此猪ＥＳＣｓ的分离传代应与传统方法 有所不同；成功用于小鼠和人的干细胞培养的白血病 抑制因子（ＵＦ）、干细胞因子（ＳＣＦ）等细胞因子对