PCR技术及临床应用、新冠病毒核酸检测原理ppt课件

PCR技术及临床应用、新冠病毒核酸检测 原理
第一代：手动/机械手式水浴基因扩 增
➢ 用三个恒温水浴箱，分别将三个水浴温度恒定在 三个温度：PCR的高温变性温度（如94℃）低温复 性温度（如58℃），适温延伸温度（如72℃）。 再用一个装有PCR标本试管的提篮，用手工在不同 温度的水浴箱中依次水浴。
➢ 核酸的分类：脱氧核糖核酸（DNA），核糖核酸（RNA）。 DNA和RNA的区别在于：DNA所含的戊糖为脱氧核糖，而RNA 所含的戊糖为核糖；在碱基成分中，DNA含胸腺嘧啶T，而 RNA含脲嘧啶U。
➢ 核苷酸：是核酸的基本结构单位，核酸水解首先得到的是
单核苷酸，后者可进一步水解为核苷和磷酸，核苷可进一
➢ 这种方法的特点是：实验人员劳动强度大，容易 因疲劳引起差错P；CR技术而及临优床应用点原、理新是冠病毒:核设酸检备测 简单，投资少，
第二代：自动化控制型PCR
使用广泛及具有代表性，采用琼脂糖电 泳的方式对PCR产物进行分析，但存在着操 作繁琐、只适用于定性研究、交叉污染风 险大等不足。且无法对起始模板准确定量， 无法对扩增反应实时检测。
➢周而复始的升降温度进行扩增，每 PCR技术及临床应用、新冠病毒核酸检测 原理
PCR扩增步骤
➢DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA 模板在热作用下，氢键断裂，形成 单链DNA。
➢退火（25℃-65℃）：系统温度降 低，引物与DNA模板结合，形成局
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PCR扩增示意图
➢ 因此特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域：拷贝数变异、突 变检测、基因相对表达研究（如等位基因不平衡表达）、二代测序结 果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。
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三、PCR技术简介
➢ 高温可以使双链DNA解链成为单链， 这一过程称为变性。
➢ 定量PCR仪是在普通PCR仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检 测装置，PCR扩增和检测同时进行，最终结果不需进行电泳检测， 所以有效地避免了样品间的交叉污染。
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PCR技术及临床应用、新冠病毒核酸检测 原理
No. of Cycles
1
No. Amplicon Copies of Target
2
2
4
3
8
4
16
5
32
6
64
20
1,048,576
30
1,073,741,824
30次循环后靶序列扩增的数量
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常用的ＰＣＲ技术 ➢定性ＰＣＲ
原理
第四代PCR：数字PCR
➢ 由于定量PCR的分析最终结果依赖于Ct值，在这个意义上所谓的“定 量”也只是相对的。而且在低拷贝靶分子、模板浓度差异细微的条件 下，其检测的灵敏度、精确度都受到了限制。在这种背景下，“数字 PCR"应运而生。
➢ 数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术。相较于实时荧光定量PCR，数 字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。
PCR技术及临床应用、新冠病毒 核酸检测原理
授课人：刘翔宇
PCR技术及临床应用、新冠病毒核酸检测 原理
目录
一．核酸基本知识
二．PCR的发展史
三．PCR技术简介
四．实时荧光PCR技术
五．实时荧光PCR的临床应用
六．新冠病毒核酸检测原理
PCR技术及临床应用、新冠病毒核酸检测 原理
一、核酸基本知识
➢ 核酸：生物贮存遗传信息物质的大分子，是生命的直接标 志
步水解为戊糖（核糖和脱氧核糖），和含氮碱基（嘌呤碱
和嘧啶碱）。
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核酸的基本结构
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遗传信息传递的中心法则
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➢ DNA的复制：能在酶的作用下解链，根据碱基互补 配对的原则进行半保留复制。
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第三代PCR：实时荧光定量PCR
➢为了避免上述传统PCR的缺陷，并对基因的 表达水平进行定量分析，1992年诞生了所 谓“第三代PCR"的荧光定量实时PCR。
➢ 所谓real-time Q-PCR技术，是指在PCR反 应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累 积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲 线对未知模板进行定量分析的方法。 PCR技术及临床应用、新冠病毒核酸检测
➢ 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的 Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。
➢ 1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶检测 原理
➢1988年Saiki 等从温泉中分离的一 株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA 聚合酶，此酶的发现使PCR广泛的被 应用。
➢变性后的DNA通过降温可以重新接 合为双链，这一过程称为复性。
➢PCR技术的基本原理类似于DNA的天
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➢利 用 温 度 的 升 降 来 控 制 DNA 的 变 性 和复性。
➢设 计 引 物 作 为 启 动 序 列 ， 加 入 DNA 聚合酶、dNTP（三磷酸脱氧核甘酸） 等原料完成特定基因的体外复制。
➢ 聚合酶链式反应（Polymerase Chain
Reaction,PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片
段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特
殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅
增加。
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二、PCR的发展史
➢ 1953年，沃森和克里克发现了DNA双螺旋的结构， 开启了分子生物学时代，极大地推动了核酸生物 化学,分子生物学及分子遗传学等各类生命科学的 迅速发展。
电泳检测、放射自显影 特异性差、易污染、只能定性 ➢ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ 特异性较好，极易污染、定量不 PCR技术及临床应用、新冠病毒核酸检测
原理
四、实时荧光PCR技术
➢ 实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信 号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行 定量分析的方法。