二代测序技术在血液系统疾病中的应用浅谈

Ivey et al., N Engl J Med 2016;374:422-33
MRD in Standard-Risk AML
有MRD携带FLT3-ITD 的患者复发率高
复发无 FLT3-ITD mutations
复发有FLT3-ITD mutations
Ivey et al., N Engl J Med 2016;374:422-33
• 测序限于基因组〜1％的蛋白质编码区
– 基因突变 • 髓系 Myeloid
• AML预后指标 – FLT3, NPM1, CEBPA, ASXL1, IDH1/2 • 骨髓增生异常综合征 (MDS) – 凝集素及剪切基因经常发生突变 • 骨髓增生性肿瘤 (MPNs) – JAK2, CALR, MPL, ASXL1 • 泛白血病基因 •淋系 Lymphoid • 弥漫性大B细胞淋巴瘤(BCR 信号通路突变) • 淋巴细胞增殖性疾病(JAK-STAT 信号通路突变) • 泛淋巴瘤基因
髓系肿瘤突变图谱 AML, MDS, MPN, MDS/MPN
Matynia et al et al. 2015. Archives of Pathology and Laboratory Medicine.
MRD in Standard-Risk AML
有MRD的患者预后差，复发率高
总生存率
复发率
研究内容
研究视角
简便快速的定量检 测疾病、不同阶段 和特定状态下的组 织基因表达的种类 和表达水平信息。 ➢ 鉴定差异表达
基因
➢ 差异表达基因 功能注释
研究内容
研究视角
快速发掘鉴定并定量 分析不同组织、不同 疾病状态下已知和潜 在miRNA及其差异 表达。 ➢ 鉴定差异表达
miRNA
➢ 差异表达miRNA 及其靶基因功能 注释
40-50K$
6
2008: ABI SOLiD
2012: 5K$,
<24 hrs?
60K$, 2 weeks
4
2001: Celera
100M$, 3 years
2010: 10K$,
a few days?
2
Sanger
2015: 1K$,
<24 hrs?
1997
2003
2008
2010
Year
2015
Wnt信号通路 DNA损伤及细胞周期相关 表观遗传学相关
RNA和核糖体加工 Others
MED12、FUBP1、MGA、MYC
POT1、ATM、CHEK2、DYRK1A、BRCC3、TP53
HIST1H1B、HIST1H1E、DDX3X、ZMYM3、CHD2、 EZH2、KMT2C、KMT2D、BAZ2A、TET2、CREBBP、 EP300、ASXL1、IKZF3
✓ 目前主要有Life Tech的SOLiD系列、Ion Torrent PGM和Ion Torrent Proton；Illumina的HiSeq和MiSeq序列；罗氏公司的Roche/454 GS FLX和Junior。
通量高 准确度高
分辨率高
成本下降
5
Trends in Sequencing Technology
• 利用DNA聚合酶和双脱氧链终止测定DNA核苷酸序列 的方法。
• 英国剑桥分子生物学实验室的生物化学家 Fred Sanger 及其同事在1997年发明的。
优点 ▪ 片段长度(~900bps) ▪ 适用于小片段
缺点 ▪ 低通量 ▪ 费用高、耗时长
4
Trends in Sequencing Technology
– 费用及医保报销政策 – 数据分析 – 差异的干扰 – 其他检测方法的干扰（如 PCR）
• 如今 - 基因组合（panel）及单基因分析 • 未来 - 常规全面的全基因组分析
转录组测序（Transcriptome sequencing）
RNA水平
数字表达谱测序（Digital expression profiling） 小RNA测序（Small RNA sequencing）
长链非编码RNA测序（Long chain non coding R NAsequencing）
免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)
表观遗传水平 全基因组甲基化测序（Whole genome methylation sequencing）
简化甲基化测序（Simplified methylation sequencing）
研究视角
在全基因组范围内鉴定基因 组变异信息。 ➢ 统计变异类型。 ➢ 筛选变异基因。 ➢ 注释突变基因功能
只有两个基因NOTCH1和CDKN2A / 2B在超 过50％的T-ALL病例中突变，其余基因以 较低的频率突变
NGS在CLL 临床诊疗中的应用
63个基因的靶向测序（TGS）
相关信号通路
相关基因
NOTCH信号通路 NF-κB信号通路
NOTCH1、FBXW7
MYD88、RIPK1、DDX3X、TRAF3、TRAF2、 SAMHD1、BIRC3、BRAF、EGR2、IRF4、BCOR、 BTK、NFKBIE、TNFAIP3、CD79B、ITPKB、CARD11、 PLCG2
– 检测复杂的基因组异常 - 拷贝数变异（CNV）和易位 – 先天性疾病 - 骨髓衰竭综合征，先天性溶血性贫血 – 高度复杂的单基因分析
• 例如：淋巴细胞克隆性和IGH或TRG / TRB基因
20
NGS在血液系统疾病的中临床应用路径
AML
MDS
患者
ALL
MPN
APL
CML
诊断 危险度分层
辅Leabharlann Baidu诊断
化疗 靶向治疗 免疫治疗
SF3B1、EWSR1、NXF1、XPO4、RPS15
FAT1、FAT3、IGLL5、MTOR、CACNA1E、BCL6、 PRDM1、BCL2、PIM1、KIT、KLHL6、CXCR4、 PIK3CA、SOCS1
不同的panel针对不同的需求
产品名称 ALL（10种） AML-MDS-MPN（34基因） MPN/MDS（25种） 髓系-large（58种） AML（22种） ABL激酶区
2
Trends in Sequencing Technology
三代测序技术
1 1代测序－双脱氧终止法（Sanger）
2
2代测序 (454, solexa, SOLiD)
3
3代测序 (单分子测序)
Trends in Sequencing Technology
1代测序——Sanger Sequencing
*Source: Shendure & Ji, Nat Biotech, 2008
25Gbp
1$
9
基于NGS肿瘤研究思路
结构变异
关键基因
分子机制
NGS几种方法
DNA水平
全基因组重测序 （Whole genome sequencing） 外显子组测序 （Whole exome sequencing）
研究内容
研究视角
系统识别、鉴定 lncRNA ，比较分析不 同组织间的lncRNA 差 异表达信息。
➢ lncRNA序列变异分 析
➢ 鉴定差异表达 lncRNA
➢ 差异表达lncRNA功 能注释
研究内容
研究视角
通过染色质免疫共沉淀 技术(ChIP)将获得的数 百万条序列标签精确定 位到基因组上，从而获 得全基因组范围内与组 蛋白、转录因子等相互 作用的 DNA区段信息
HSCT
巩固治疗
疗效评价
预后分析
复发监测
微小残留病检测
（MRD)
指导用药
复发监测
NGS在AML中的应用
• 一项癌症基因组图谱研究网络（The Cancer Genome Atlas Research Network， TCGA）的研究
• 200例初诊的AML患者 • 50例全基因组测序，150例外显子测序 • AML患者中平均有13个基因发生突变 • 23基因突变较为显著 （>5% 的病例）
二代测序技术 在血液系统疾病中的应用
1
Trends in Sequencing Technology
Sequencing the Human Genome
2001: Human Genome Project
2.7G$, 11 years
price
10
2007: 454
1M$, 3 months
8
2009: Illumina, Helicos
淋系-large 血液肿瘤（42种）
PH-like 噬血细胞综合征
易栓症
检测方法 NGS检测 NGS检测 NGS检测 NGS检测 NGS检测 NGS检测 NGS检测 NGS检测 NGS检测 IGN/TCGRS检测 NGS检测
展望
• NGS正在为病理学和实验医学带来改革 • 真正实现“个体化治疗”、“精准治疗” • 有利于进行靶向治疗 • 费用的快速降低，技术的持续提高 • 仍面临的挑战
Sanger
输出数据 Throughput
(per run)
400kbp
费用 Cost (1mbp)*
500$
454
~400bp
Polony
500Mbp
60$
Solexa
75bp
Polony
20Gbp
2$
SOLiD
75bp
Polony
60Gbp
2$
Helicos
30-35bp
Single molecule
MRD in Standard-Risk AML
有MRD携带DNMT3A的患者复发率低
复发without DNMT3A mutations
复发with DNMT3A mutations
Ivey et al., N Engl J Med 2016;374:422-33
NGS在T-ALL中的应用
NGS（外显子测序，全基因组测序或转录组 测序）已经鉴定出T-ALL中突变的100多个 基因。
➢ 统计测序数据在参 考基因组peak区
➢ 不同样品差异分析 ➢ 差异基因功能注释
研究内容
研究视角
DNA进行重亚硫酸盐 处理并高通量测序, 检测所有的甲基化位 点，绘制单碱基分辨 率的DNA甲基化图谱
➢ 差异甲基化区域 分析
➢ 多样品间差异甲 基化分析
研究内容
NGS在血液系统疾病中的临床应用
– 全基因组测序 （全基因组 ~3 Billion bp） – 全外显子测序 （~30M bp）
2代测序——Next Generation Sequencing (NGS)
✓ 二 代 测 序 ， 高 通 量 测 序 （ Next Generation Sequencing 、 Highthroughput Sequencing 、Deep Sequencing）:一次性对几百万到十亿 条DNA分子进行并行测序，从而可对一个物种的转录组和基因组进 行深入、细致、全貌的分析。
全基因组范围
研究内容
绘制体细胞突变图谱
研究视角
捕获外显子区域 DNA进行进行高通 量测序 ➢ 统计变异类型
➢ 筛选变异基因
➢ 注释突变基因功 能
1-2%基因组序列
研究内容
研究视角
针对样品在特定组织特 定状态下的全部mRNA 进行分析 ➢ 鉴定转录本结构变异
➢ 鉴定差异表达基因
➢ 变异基因及差异表达 基因功能注释
✓ 第三代测序技术发明人：Stephen W Turner & Jonas Korlach 博士 ✓ 基因测序技术逐渐成为临床分子诊断中重要技术手段 ✓ 第三代测序技术的应用在测序、甲基化研究、突变鉴定（SNP检测）
8
三代技术对比
Sanger
阅读长度 Read length
~800bp
测序技术 Sequencing Technology
High Parallelism is Achieved in Polony Sequencing
Sanger
Polony
7
3代测序——单分子测序：HeliScope
✓ DNA测序时，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独 测序。第三代测序技术基因组也叫从头测序技术，即单分子实时DNA 测序。
22
Blood. 2016 January 7; 127(1): 29–41.
NGS在MDS中的应用
738 例 MDS, MDS‐MPN患者 通过NGS检测了111 个癌症相关基因，结果显示：
78% 的患者至少有1种致癌基因的突变 骨髓或外周血提取DNA没有系统差异 致癌基因突变的总数越多，结果越差